Transformation af det genstridige pesticid chlordecone af Desulfovibrio sp.86 med et skift fra ringåbnende dechlorering til reduktiv sulfideringsaktivitet | Videnskabelige rapporter

isolering af Desulfovibrio sp.86
Genomanalyse af Desulfovibrio sp.86
Desulfovibrio sp.86 nedbryder chlordecon til kendte transformationsprodukter såvel som en uventet svovlholdig forbindelse
syntese af chlordecthiol-standarden og bekræftelse af, at transformationsprodukt F1 er identisk med chlordecthiol
Desulfovibrio SPS evne.86 at nedbryde chlordecontransformationsprodukter
undersøgelse af inkubationsbetingelserne, der fører til bakteriel reduktiv sulfidering
miljørelevans af chlordeconreduktiv sulfidering

isolering af Desulfovibrio sp.86

isolering af Desulfovibrio sp.86 blev opnået fra det chlordecon-nedværdigende konsortium 865 under anvendelse af sulfatreducerende betingelser. Da bakteriekonsortium 86, der var i stand til at transformere chlordecon, blev opnået fra et beriget mineralmedium (MM) ved navn MM + 5 suppleret med chlordecon, blev den vigtigste kemiske sammensætning holdt, men elektrondonorer og acceptorer blev modificeret. Flere medieformuleringer, der bruges til at berige sulfatreducerende bakterier, bruger organiske syrer f.eks. lactat,som kulstof-og energikilder (elektrondonor) og sulfat,der bruges som eletronacceptor til vækst15,16, 17, 18. I denne sammenhæng blev pyruvat i MM + flydende medium erstattet af lactat, og sulfat blev tilsat (MMD flydende medium, se afsnittet “metoder”). Berigelsen blev spredt på MMD-agar, og de brune vibrio-lignende bakteriekolonier (observeret under optisk mikroskop) blev oprenset yderligere gennem to yderligere pladestriber (Fig. S1). En isoleret bakteriestamme viste sig at være identisk med Desulfovibrio sp.86 Fra konsortium 86 baseret på 100% identiteter af deres 16S rRNA-gener (1538 bp hver).

Genomanalyse af Desulfovibrio sp.86

hele genomet består af et enkelt 3.464.070 BP cirkulært kromosom. CheckM-analyse19 udført med 61 genomer og 284 slægter indikerer, at genomet hører til Deltaproteobakterierne, og CheckM-fuldstændigheden er 100% (nul essentiel markør mangler). Det gennemsnitlige G + C-indhold for DNA er 58,06%. I alt 3.342 kodende DNA-sekvenser (CDSs) blev forudsagt for kromosomet, 4 pseudogener og 10 Diverse RNA ‘ er (misc-RNA), 3 rRNA-operoner og 54 tRNA-gener.

de tre 16S rRNA-gener af Desulfovibrio sp.86 er identiske. Deres bedste BLAST hits (NCBI) var fra ukultureret Desulfovibrio sp. kloner fra mikrobielle brændselsceller såsom MFC63A04 (Genbank tiltrædelsesnummer : FJ823865; dækning 98%; identitet 99,87%)20. Et fylogenetisk træ ved hjælp af den tilgængelige 16S rRNA af dyrkbare bakterier bekræftede lighederne mellem Desulfovibrio sp.86 og Desulfovibrio dsm4141 (GenBank 16S rRNA tiltrædelsesnummer: NR_117110; dækning 99%; identitet 99, 22%; genomisk sekvens utilgængelig) (Fig. S2) 21. På det genomiske niveau, Desulfovibrio sp.86 rangerer først med Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans str. ATCC 27.774 genom (GenBank: NC_011883). Ikke desto mindre Desulfovibrio sp.86 deler kun 1.408 gener (43%) med D. desulfuricans (over 80% aminosyreidentitet og 80% justeringsdækning). Derudover er de gennemsnitlige nukleotididentiteter (ANI) mellem Desulfovibrio sp.86 og sekventerede Desulfovibrio-genomer er lavere end den 95% Ani-afskæringsværdi, der generelt accepteres for artsafgrænsning (Fig. S3) 22. Disse resultater indikerer, at Desulfovibrio sp.86 er sandsynligvis en ny art af Desulfovibrio phylum. Tilstedeværelsen af to superkilte-dismutaser og et katalasegen tegner sig for dets relative ilttolerance. Som forventet er Desulfovibrio sp.86 genom udviser et omfattende genkomplement til svovlmetabolisme, der omfatter svovl respirationsveje med uorganiske kilder som sulfat, sulfit, bisulfit og tetrathionat som elektronacceptorer. Organiske svovlkilder kan tilvejebringes ved fermenteringsprodukter af svovlbiomasse (sulfokinovose af sulfokinovosyllipider) sulfoacetat, svovl ikke-proteogen aminosyre taurin via sulfoacetaldehyd eller alkansulfonater23.

Desulfovibrio sp.86 nedbryder chlordecon til kendte transformationsprodukter såvel som en uventet svovlholdig forbindelse

den chlordeconnedbrydende evne hos den isolerede Desulfovibrio sp.86 stamme blev undersøgt ved hjælp af GC-MS (gaskromatografi massespektrometri) og LC-HRMS (væskekromatografi massespektrometri med høj opløsning) teknikker under vækstbetingelser anvendt med succes for Desulfovibrio sp.86 isolering (MMD flydende medium). Na2S blev brugt som reduktant, og en anaerob N2/H2 (98/2; V/V) atmosfære blev påført ved hjælp af et handskerumssystem. Disse inkubationsbetingelser førte til fuldstændig forsvinden af chlordecon–signalet i GC-MS og LC–HRMS og resulterede i lignende GC-MS og LC-HRMS TP-profiler som dem, der blev opnået med Citrobacter sp.866: monohydrochlordecon A1, pentachloroindene B1, tetrachloroindenes B3-B4 og polychloroindencarbonsyre C1-C2 og C3-C4 (Fig. 1a, b). I handskerumssystemet blev bakteriekulturer udført under anvendelse af 100 mL hætteglas med en hydrofob porøs film for at muliggøre gasudveksling og undgå forurening. Denne inkubation tilstand blev betragtet som” fornyet atmosfære ” tilstand (RA). I dette system blev atmosfæren regelmæssigt fornyet med N2/H2 (98/2; V / V), og kassen blev ikke termostatisk kontrolleret, så temperaturen varierede mellem 25 og 33 liter C. For bedre at kontrollere vækst-og nedbrydningsbetingelser, Desulfovibrio sp.86 kulturer blev anbragt i MMD-medium under anvendelse af 100 mL hætteglas, forseglet med butylgummi septa, i en ovn ved 30 liter C. forseglede hætteglas blev oprindeligt renset med N2/H2 (98/2; V/V) gas for at sikre anaerobiose. Denne inkubation betingelse blev betragtet som” begrænset atmosfære ” betingelser (CA).

efter seks ugers inkubation med chlordecone kunne pesticidet ikke længere påvises ved de samme analytiske teknikker. Samtidig optrådte en enkelt ukendt chloreret forbindelse ved navn F1. Det kunne kun påvises gennem GC-MS (25,6 min) (Fig. 1c). Ligesom i de tidligere rapporterede chlordecon-nedbrydningskulturer5, 6 optrådte hovedchlordecontransformationen under den stationære fase (Fig. 1e). Da der ikke kunne observeres nogen synlig chloreret top i LC-HRMS (Fig. 1d), baserede vi den strukturelle belysning af F1 på fortolkningen af GC–MS-data (Fig. 1f). 507,8 indeholdt den molekylære ion, antog vi to mulige neutrale formler for F1, C10Cl10O2H2 og C10Cl10SH2. Fragmenter i kilden var meget lig dem, der blev observeret i polychlorerede bishomocubanbaserede strukturer, herunder chlordecon, hydrochlordeconer,chlordecol og mireks5,6, 24. Isotopmønstrene ved 201,0, 235,9 og 271.9 opstod formodentlig fra den kendte in-source bishomocubane retrocyclodimerisering og svarede til positivt ladede C5-fragmenter. Sammenligning med isotopiske simuleringer begrænsede muligheden for følgende radikale ioner: + * · * og +·, med n = 0,1. Den sidstnævnte bis-iltede generiske formel viste sig at være meget usandsynlig, da den krævede tilstedeværelsen af en perle-diol-funktion eller en perle-chlorhydrindel på cyclopentenylringen, der måtte modstå de barske GC-kromatografiske forhold (> 200 liter C). I stedet konkluderede vi, at en svovldel, dvs. en thiolfunktion var sandsynligvis til stede på bishomocubane polycycle. Vi foreslog for F1 strukturen afbildet i Fig. 2A og foreslog navnet chlordecthiol, svovlanalogen af chlordecol (chlordeconalkohol).

syntese af chlordecthiol-standarden og bekræftelse af, at transformationsprodukt F1 er identisk med chlordecthiol

for at bekræfte strukturen af F1 blev standardchlordecthiol kemisk syntetiseret og fuldt karakteriseret. For at opnå kemisk reduktiv sulfidering af chlordecon var der behov for to trin. Den første bestod i omdannelsen af Gem-diol-funktionen af chlordecon i ligevægt med den tilsvarende ketonform20,25 til svovlanalogen, dvs.gem-thiol/thiocarbonyl-delen. For at udføre dette trin anvendes fosforholdige svovlreagenser generelt26, 27. Her brugte vi fosfordecasulfid (P4S10), også kaldet berselius reagens27, 28 i henhold til protokollen fra Saidi og kolleger, der med succes syntetiserede camphorthiol29 (Fig. 2a). Det andet trin bestod i reduktionen af gem-thiol-mellemproduktet ved anvendelse af NaBH4. Efter oprensning blev der opnået et hvidt fast stof i et samlet udbytte på 73% (Fig. 2a). 1D-og 2D-NMR-analyser bekræftede chlordecthiol-strukturen: (i) to 1h-signaler, der integrerer hver for en proton og kobles sammen (3,78 ppm, d, J = 5,5 ppm og 2,01 ppm, d, J = 5,5 ppm), med den ved 3,78 ppm korreleret med et 13C-signal forskudt nedfelt (55,1 ppm) i HSC-eksperiment, der perfekt tegner sig for ch-delen ved siden af thiol-funktionen, og (ii) i alt seks synlige 13C-signaler, der afspejler symmetriplanet, der er bevaret i den nuværende bishomocubanstruktur (fig. 2a, Fig. S19-23). Selvom F1 i mikrobiel transformation ikke kunne detekteres ved hjælp af LC-HRMS-værktøj under de udviklede betingelser, gav en koncentreret prøve af den syntetiske standard chlordecthiol et signifikant signal. Tilstedeværelsen af et svovlatom og den forventede neutrale formel C10Cl10SH2 blev bekræftet (Fig. 2c, d), og de rå formler C10Cl10O2H2 blev udelukket (Fig. 2b). Endelig viste GC-MS-analyse det perfekte match (dvs.den samme retentionstid på 25,6 min og samme massespektre i kilden Fig. S6) mellem den syntetiske standard og TP F1 og dermed bestemt tildele den som chlordecthiol. Faktisk repræsenterer F1 det første medlem af en ny familie af chlordecone TPs, der for første gang besidder et svovlatom.

Desulfovibrio SPS evne.86 at nedbryde chlordecontransformationsprodukter

forbindelser A1, B1, C1-C2 og F1, der er repræsentative for de fire familier af TPs, der muligvis er dannet i nærvær af Desulfovibrio sp.86 blev syntetiseret i henhold til tidligere rapporterede kemiske protokoller6 og heri udviklet til F1. Hver af dem blev inkuberet i nærvær af Desulfovibrio sp.86 kulturer under forhold, der blev vist at fremme reduktiv sulfidering (forseglet hætteglas; CA-betingelser) eller dechlorering med ringåbning (åbent hætteglas; RA-betingelser). Der blev udført dobbelt GC-MS-og LC-HRMS-overvågning af alle prøver.

efter en måneds inkubation under CA-betingelser blev 10-monohydrochlordecone A1 fuldstændigt omdannet til to ukendte chlorerede forbindelser, der næppe blev adskilt under anvendelse af GC–MS (retentionstider: 24,3 min F2 og 24,5 min F3, Fig. 3, fig. S7-S11). De viste et identisk massespektrum i kilden, der meget lignede F1-fragmenteringsmønsteret (Fig. S8). Alle detekterede fragmenter i kilden vendte sig til at besidde et chloratom mindre end deres analoger i F1-massespektrum. Forbindelser F2 og F3 blev således antaget at være diastereoisomerer af 10-monohydrochlordecthiol (Fig. 3c). Dette blev bekræftet ved den kemiske syntese af de to 10-monohydrochlordecthiol-standarder fra 10-monohydrochlordecone A1 under anvendelse af den procedure, der tidligere blev anvendt til syntese af chlordecthiol F1 (Fig. S24-27). Disse kemiske standarder havde de samme retentionstider (24,3 og 24,5 min) og de samme massespektre sammenlignet med den biologiske F2 og F3 (Fig. S8). TPs B1, C1-C2 og F1 forblev uændrede, selv efter seks måneders inkubation med Desulfovibrio sp.86 under CA betingelser.

efter seks måneders inkubation under RA-betingelser blev chlordecthiol F1 delvist omdannet til 10–monohydrochlordecthioler F2 og F3, og to andre ukendte chlorerede arter påvist ved anvendelse af GC-MS, navngivet F4 (retentionstid: 17,9 min) og F5 (retentionstid: 26,6 min) (Fig. 3D, Fig. S12). Ingen af disse to forbindelser gav noget detekterbart signal i LC-HRMS. GC-MS-analyse gjorde det muligt at foreslå C10Cl6SH4 som rå formel for F4 (Fig. S14) og C11Cl10SH4 for F5 (Fig. S15). Methylchlordecsulfid blev kemisk syntetiseret og fuldt karakteriseret ved NMR (Fig. S28-31). Den perfekte korrespondance mellem GC-retentionstider og GC-massespektre af methylchlordecsulfid og biologisk F5 (Fig. S13) bekræfter sin postulerede identitet. Bemærkelsesværdigt er strukturen af F5 (Fig. 3d) repræsenterer en s-methyleret form af F1. Den nøjagtige karakter af F4 forbliver klar (se si-supplerende tekst). Alle andre TP ‘ er forblev uændrede under RA-betingelser.

sammenfattende gennemgik A1 (dannet under RA-betingelser) en reduktiv sulfidering ligesom chlordecon; under begge inkubationsbetingelser syntes polychloroindener (B1 og C1-C2) ikke at være nedbrydelige af Desulfovibrio sp.86, hvorimod F1 (produceret under CA-betingelser) kunne transformeres under RA-betingelser (Fig. 3).

undersøgelse af inkubationsbetingelserne, der fører til bakteriel reduktiv sulfidering

for at stille spørgsmålstegn ved de fysisk-kemiske eller fysiologiske parametre, der påvirker chlordecons transformationsveje i kulturer af Desulfovibrio sp.86, GC-MS overvågning (B1 og F1 tilstedeværelse som bevis for RA og CA betingelser, henholdsvis) blev valgt.

to svovlholdige uorganiske forbindelser, reduktanten Na2S og elektronacceptoren Na2SO4, var til stede i det originale MMD-flydende medium. En første række forsøg i forseglede hætteglas med substitution af NA2 ‘ er med andre reduktionsmidler, sulfurerede eller ej, dvs.cystein og Titan(III) citrat (TiCi) førte til et sammenligneligt niveau af chlordecthiol F1 (tabel 1). Spor af TP B1 blev også observeret i alle forsøg, herunder Na2S, den positive kontrol (tabel 1).

tabel 1 påvirkning af reduktionsmidlet på chlordecone TP-profil.

et andet sæt eksperimenter blev designet ved hjælp af Na2S som reduktionsmiddel og alternative svovlbaserede elektronacceptorer i forseglede hætteglas (tabel 2). Anvendelse af 90% 34S-beriget uorganisk sulfat resulterede i et chlordecthiolprodukt, der viste lignende 34S-berigelsesniveau (90% 34s-F1/10% F1, Fig. S16). GC-MS-analyse af kulturhovedrum afslørede også tilstedeværelsen af H234S og H3C34SH (Fig. S16), hvilket viser, at Desulfovbibrio sp.86 produceret H2S fra sulfat. Disse gas blev detekteret i kulturhovedrummet under CA-forhold ved anvendelse af MMD-medium, hvorimod de var fraværende fra kulturhovedrummet i RA-tilstand, der svarede til handskerummets atmosfære (Fig. S17). Fravær af sulfat inhiberede ikke Desulfovibrio sp.86 vækst, men det resulterede i dannelse af B1 (tabel 2)5. Remplaceringen af sulfat med sulfit, bisulfit eller thiosulfat førte i alle tilfælde til dannelsen af chlordecthiol F1.

tabel 2 indflydelse af den svovlbaserede elektronacceptor på chlordecone TP-profil.

en tredje række eksperimenter ved hjælp af krukker undersøgte effekten af arten af gasfasen i kontakt med kulturen. Mellem RA-tilstanden ved brug af åbne hætteglas i handskerum og CA-tilstand ved brug af forseglede hætteglas i ovnen var der flere parametre (atmosfærens natur og volumen, temperatur). Ved hjælp af et jar-system inklusive flere hætteglas studerer vi selektivt effekten af atmosfærefornyelse på chlordecontransformation af Desulfovibrio sp.86 i MMD medium. I hvert tilfælde blev åbne hætteglas med hydrofobe porøse film anbragt i krukker, der oprindeligt blev renset med en valgt gas. Alle glassene blev inkuberet kl 30 kg C. Nogle af dem blev skyllet flere gange for at efterligne handskerumssystemet, mens andre blev holdt lukket.

krukker 1-4 indeholdt to identiske åbne hætteglas fyldt med MMD, chlordecone og Desulfovibrio sp.86 inokulum og en negativ abiotisk kontrol. Blandt dem blev to krukker skyllet to gange om ugen, krukke 1 med (N2/H2 (98/2; V/V)), krukke 2 med N2 (Fig. 4A), hvorimod krukker 3 og 4, oprindeligt renset med N2 og (N2 / H2 (98/2; V / V)) henholdsvis blev efterladt unflushed (Fig. 4b).

de sidste to krukker (krukke 5 og 6) indeholdt tre åbne hætteglas fyldt med MMD, chlordecone og Desulfovibrio sp.86, plus en kultur uden sulfat. Disse krukker blev oprindeligt skyllet med (N2/H2 (98/2; V / V)) og blev ikke skyllet i 2 måneder (Fig. 4c).

parallelt med krukkerne er to forseglede hætteglas fyldt med MMD uden sulfat, chlordecone og Desulfovibrio sp.86 blev skyllet med ekstemporativt syntetiseret H2S (Fig. S4).

efter inkubation på to måneder ved 30 liter C blev TP B1 påvist i hætteglas anbragt i de skyllede krukker 1 og 2 (Tabel 3a), mens TP F1 kun blev fundet i hætteglas anbragt i ikke-skyllede krukker 3 og 4 (tabel 3b). Der var ingen TP til stede i de abiotiske kontroller. I krukker 5 og 6 var F1 til stede i både sulfat og sulfatfri Desulfovibrio sp.86 åbne kulturer (tabel 3c). På samme måde Desulfovibrio sp.86 sulfatfrie kulturer, skyllet med H2S, viste signifikante niveauer af F1 TP, hvorimod der ikke blev observeret nogen transformation i den negative kontrol (tabel 3D).

tabel 3 indflydelse af gasatmosfære på chlordecone TP-profil.

et yderligere kemisk eksperiment blev udført for at vurdere indflydelsen af H2S på chlordecontransformation. Klassisk kemisk protokol muliggør B og C TPS dannelse, blev anvendt (chlordecone, titanium citrat, vitamin B12, vand). Under N2 atmosfære, B og C TPs blev opnået, men under H2S atmosfære, kun A1 blev produceret (Fig. S18).

disse resultater viser tydeligt, at dannelsen af chlordecthiol F1 kræver et lukket inkubationssystem med en reducerende atmosfære. H2 som den oprindelige gasatmosfære er imidlertid ikke obligatorisk, mens tilstedeværelsen af H2S er påkrævet. Kemisk forhindrer tilstedeværelsen af H2S fra ring-åbning dechlorering proces.

miljørelevans af chlordeconreduktiv sulfidering

vi undersøgte vores tidligere samling af chlorecon-forurenede miljøprøver (otte jordarter og to sengesedimenter), hvor forskellige niveauer af Chlordecon TPs var blevet rapporteret6. Blandt de hidtil ukendte svovlholdige TP ‘ er, der blev rapporteret, fandt vi mærkbare niveauer af F1 i de to bed-sedimentprøver (927 og 928) ved en koncentration estimeret henholdsvis omkring 50 liter/kg og 20 liter/kg vådt sediment (tabel S1). Parallelt, bakteriepopulationsdiversitetsdata udstedt fra metabarcoding analyse af disse prøver (Fig. 5, Fig. S5) blev behandlet for at genvinde en hierarkisk klyngedannelse af miljøprøver i henhold til deres taksonomiske sammensætning6. Det blev bemærket, at sulfatreducerende bakterier var meget mere til stede i sengesedimenter end i de andre rum,som tidligere rapporteret30,31, 32.

Transformation af det genstridige pesticid chlordecon af Desulfovibrio sp.86 med skift fra dechlorering med ringåbning til reduktiv sulfideringsaktivitet