Type III-kollagen er afgørende for kollagen i-fibrillogenese og for normal kardiovaskulær udvikling

resultater og diskussion

ES (J-1) celler (22) blev transficeret med en målretningsvektor indeholdende et Col3a1-gengenomisk DNA-fragment, hvori promotorregionen af genet og den første ekson, der koder for signalpeptidet, blev slettet (Fig. 1A). Målrettede ES-cellekloner blev identificeret ved Southern blot-analyse og anvendt til blastocystinjektion (Fig. 1b øvre). Mutante mus blev afledt af to uafhængigt målrettede ES-cellekloner og identificeret ved Southern blot-analyse (Fig. 1b lavere). Proteinanalyse af hale-og hudkollagen viste, at heterosygøse mutante mus har ca.50% reduktion i type III-kollagen, mens der ikke blev påvist type III-kollagen hos homosygøse mutante dyr (Fig. 1C).

mutante dyr var frugtbare, men kun heterosyge mus var fænotypisk normale. Homosygøse mutante mus viste en gennemsnitlig overlevelsesrate på 5% ved fravænningsalderen, hvor de fleste dødsfald forekom inden for de første 48 timer efter fødslen (tabel 1). Den nøjagtige årsag til neonatal dødelighed er ikke klar, fordi de døde hvalpe blev kannibaliseret, før de kunne undersøges, og lysmikroskopisk histologisk analyse af levende nyfødte homosygøse mutanter påviste ikke nogen grov abnormitet. Voksne homosygøse mutante mus forekom normale, bortset fra at de var omkring 15% mindre end deres vildtype-kuldkammerater af samme køn (data ikke vist). 6 måneder eller en femtedel af den normale levetid. Obduktion viste, at blodkarbrud var hovedårsagen til disse Muses forkortede levetid (tabel 2). Brudstederne var sporadiske og for det meste forbundet med store blodkar. Histokemisk analyse blev udført for at finde den defekt, der forårsagede skrøbelighed i blodkarvæggen. Fig. 2 A og B viser et tværsnit af normal abdominal aorta. Aortas væg består af intima og medier (Fig. 2A, pil) og adventitia (Fig. 2 A og B, pilespidser). Mediet består af elastiske fibre (Fig. 2B, store pile) og glatte muskelceller (Fig. 2B, små pile) og tilvejebringer elasticiteten af aorta, mens adventitia for det meste omfatter type i-kollagenfibriller og begrænser dilatationen af aorta. Fig. 2C viser et tværsnit af en dissekerende aneurisme i abdominal aorta fra en homosygøs mutant mus. Bruddet krydsede medierne (pil), hvilket førte til en blodfyldt kanal (stjerne) mellem medier og adventitia (pilespidser) og delvist kollapsede lumen i aorta. Adventitia sprængte til sidst et andet sted, og blod lækkede ind i bughulen, som det er tilfældet hos mennesker med dødelig aortaaneurisme (20). Det samlede arrangement af de elastiske fibre og de glatte muskelceller (Fig. 2D) svarede til kontrollerne (Fig. 2B). Intensiteten og fordelingen af ekstracellulært matricsmateriale og den mørkere farvning i adventitia og mellem elastiske fibre og glatte muskelceller i intima hos mutante mus (Fig. 2D) var sammenlignelige med vildtype kontrol (Fig. 2B). Der blev ikke observeret nogen åbenlyse defekter i hjerte og mellemstore og små arterier hos mutante dyr under lysmikroskopet (data ikke vist).

ud over aneurisme viste mutante mus hyppig tarmforstørrelse og lejlighedsvis tarmbrud, hvilket resulterede i død (tabel 2). Cirka 60% af homosygøse mutante mus viste hudlæsioner, hvoraf den mest alvorlige blev præsenteret som et åbent sår med en længde på 1 cm i skulderområdet, som fuldstændigt trængte ind i huden og eksponeret subdermalt væv (Fig. 3). Sårene skyldtes ikke kampe mellem dyr, da de blev observeret hos dyr, der blev buret separat. Lysmikroskopisk analyse af hud, tarm og andre indre organer, herunder lever og lunge, påviste ingen åbenlys abnormitet hos mutante dyr (data ikke vist).

for at definere de strukturelle defekter hos mutante dyr blev elektronmikroskopiske analyser af aorta og hjerte udført. Fig. 4 viser, at kollagenfibrillerne er placeret mellem glatte muskelceller eller mellem glatte muskelceller og elastiske fibre (Fig. 4A, pile) var fraværende eller alvorligt reduceret i medierne af mutant aorta (Fig. 4B, pile). Mest slående, i adventitia, hvor størstedelen af kollagen er type I, var diameteren af kollagenfibriller af den mutante aorta meget variabel (sammenlign Fig. 4 D til C). Når fibrillerne blev talt, og diameteren af disse fibriller målt i et givet område af adventitia, fandt vi, at antallet af fibriller i mutanter blev reduceret til ca.en tredjedel af den af vildtype, mens den gennemsnitlige diameter af fibrillerne i mutanter var ca. dobbelt så stor som for vildtype mus (Fig. 5). I lighed med aorta blev kollagenfibrillerne mellem epicardium og myokardium reduceret eller savnet, og mikrovilli af epicardiet var underudviklet i hjertet af mutante mus (data ikke vist).

ud over det kardiovaskulære system blev hud, tarm, lever og lunge af mutante mus undersøgt ved elektronmikroskopi. Som med adventitia af aorta fibriller kollagen i i mutant hud (Fig. 4F, pile og pilespidser) var uorganiserede og var meget variable i diameter sammenlignet med mus af vildtype (Fig. 4e, pile). Denne ændring blev også set i lever og lunge hos mutante mus (data ikke vist). Desuden manglede eller stærkt reducerede kollagenfibriller i submucosa og serosa af mutante tarme (data ikke vist), hvilket tyder på, at kollagenfibriller i disse områder for det meste er type III kollagenfibriller.

tidligere undersøgelser, der introducerede målrettede mutationer i col1a1 -, Col2a1 -, Col5a2-og Col9a1-gener, har bragt vigtig indsigt i funktionen af disse collagener (24-27). Her viser vi, at type III kollagen har en kritisk rolle i fibrillogenese, hvilket er en vigtig del af udviklingen af sådanne organer som kardiovaskulærsystemet, tarmen og huden. Mangel på type III kollagen forstyrret fibrillogenese og resulterede i defekt udvikling og funktionssvigt i disse organer. Under fysiologiske forhold er type III-kollagen ikke kun en væsentlig bestanddel af fibriller i væv, såsom medierne i aorta, men også et vigtigt regulerende element i type i-kollagenfibrillogenese. Vores resultater antyder, at type III-kollagen regulerer diameteren af type i-kollagenfibriller, der fungerer som en mekanisme til at imødekomme de fysiologiske krav i forskellige væv eller af et væv i forskellige udviklingsstadier. Fænotypen af type III kollagenmangel mus ligner meget de kliniske manifestationer af Ehlers-Danlos syndrom type IV patienter, hvor døden skyldes blodkar eller tarmbrud (20). Disse mutante mus bør derfor vise sig at være gode dyremodeller til forståelse af denne sygdom og muligvis test af terapeutiske tilgange.