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Cultivo Exitoso de Sus Células:

*Lea la información técnica importante que sigue antes de manipular las líneas celulares suministradas por ECACC*. Esta información también está disponible en formato PDF en nuestro menú principal, en “Atención al cliente” (haga clic aquí).

Almacenamiento de Células Congeladas

Una vez recibidas, las ampollas congeladas deben transferirse directamente a nitrógeno líquido en fase gaseosa sin demora, a menos que deban utilizarse inmediatamente. NO utilice un congelador de -80°C como alternativa; esto provocará una pérdida de viabilidad.

Cómo Manejar Células Congeladas en el Recibo

Al recibir un envío de líneas celulares congeladas suministradas por ECACC, es importante que el usuario final preste atención al envío sin demora. Se debe consultar el asesoramiento técnico que acompaña a las líneas celulares antes de retirar las ampollas del hielo seco. El manejo correcto inmediatamente después de la recepción es fundamental para establecer con éxito la línea celular en el laboratorio del usuario final.

En el momento en que se pide una línea celular, los usuarios finales también deben considerar las condiciones de cultivo para la nueva línea celular y asegurarse de que el medio apropiado esté disponible cuando lleguen las células.

Importancia del Recuento de Células

Realice un recuento de células viables cuando resucite y coseche cultivos celulares. Una de las razones más comunes para no establecer células en cultivo se debe al uso de una densidad de siembra celular viable incorrecta en el momento de la reanimación, es decir, sembrar células demasiado bajas o demasiado altas. Esto se puede evitar realizando un recuento de células viables y siguiendo la densidad de siembra recomendada.

Para la línea celular específica con la que está trabajando, lea la información proporcionada en la pestaña “Descripción” en nuestra página web. Esa información también se puede encontrar en la Hoja de Datos de la línea Celular, que se le proporcionará como copia impresa con su envío de la línea celular. La densidad de siembra se muestra en la información de rutina de subcultura. Al sembrar células inmediatamente después de la reanimación, use el extremo medio a superior del rango de densidad de siembra indicado.

Reanimación de Células Congeladas

Es importante manejar las ampollas congeladas con cuidado; use un abrigo de laboratorio, una máscara facial protectora completa y guantes. En raras ocasiones, las ampollas pueden explotar al calentarse debido a la expansión del nitrógeno líquido residual atrapado.

1. En un armario de seguridad microbiológica, sostenga un tejido empapado en alcohol al 70% alrededor de la tapa de la ampolla congelada. Gire la tapa un cuarto de vuelta para liberar cualquier residuo de nitrógeno líquido que pueda quedar atrapado. Vuelve a apretar la tapa. Transfiera rápidamente la ampolla a un baño de agua a 37oC hasta que solo queden uno o dos pequeños cristales de hielo, si los hay (1-2 minutos). Es importante descongelar rápidamente para minimizar cualquier daño a las membranas celulares.
Nota: No sumerja totalmente la ampolla, ya que esto puede aumentar el riesgo de contaminación.

2. Limpie la ampolla con un pañuelo empapado en alcohol al 70% antes de abrirla.

3. Pipetee todo el contenido de la ampolla en un tubo estéril (por ejemplo, 15 ml de capacidad). Luego, agregue lentamente 5 ml de medio precalentado que ya se haya complementado con los componentes apropiados. Determinar la densidad celular viable utilizando tinción azul tripano, un hemocitómetro y un microscopio invertido para contar las células o un método de recuento celular equivalente. Transfiera el volumen apropiado de suspensión de células para lograr la densidad de siembra de células recomendada en la entrada de datos de la línea celular.

Para líneas celulares adheridas: Ajuste el volumen del medio y, si es necesario, el tamaño del matraz para alcanzar la densidad de siembra de células recomendada en la hoja de datos de líneas celulares. Normalmente no es necesario un paso previo a la centrifugación para eliminar el crioprotector, ya que el primer cambio de medio eliminará el crioprotector residual. Si lo es, se especificará en la hoja de datos. Si las células se van a utilizar inmediatamente (por ejemplo, para un ensayo basado en células), en lugar de ser subculturadas, puede ser aconsejable realizar un paso previo a la centrifugación para eliminar el crioprotector.

Para líneas de células de suspensión*: Se recomienda un paso previo a la centrifugación para eliminar el crioprotector, p. ej. pellet las células mediante centrifugación a 150 x g durante 5 minutos y resuspender el pellet de la célula en medio fresco utilizando el volumen adecuado para lograr la densidad de siembra correcta.

1. Incubar los matraces a la temperatura y al nivel de CO2 recomendados en la hoja de datos. Si se utiliza una incubadora alimentada con CO2, el matraz debe tener una tapa de ventilación para permitir el intercambio gaseoso.

Cultivos De Hibridomas Congelados

Cuando se recuperan cultivos de hibridoma de cultivos congelados, no es inusual que el crecimiento inicial sea más lento de lo esperado y se puede observar una disminución de la viabilidad. El establecimiento de una cultura que prolifere activamente puede tardar hasta 2 semanas.

En la reanimación, es esencial un paso de centrifugación para eliminar el crioprotector. Descongelar rápidamente la ampolla congelada en un baño de agua a 37 ° C durante 1-2 minutos. Transfiera el contenido a un tubo de centrífuga y agregue lentamente 5-10 ml de medio de cultivo precalentado+. Retire una muestra para contar. Centrifugar a 100 x g durante 2-3 minutos para pelar células y sembrar a una densidad relativamente alta de 5-7 x 105 células/ml. Coloque el frasco de cultivo plano y observe regularmente hasta que se vean células proliferantes viables.

+A menudo, los cultivos de hibridoma pueden beneficiarse de la resuspensión con medios suplementados con 20% de FBS en la etapa crítica temprana del establecimiento del cultivo inmediatamente después de la reanimación.

Procedimiento para Congelar Células

ECACC recomienda congelar un stock de sus líneas celulares poco después de recibirlas(entre 2 y 4 x 106 células/ml) como precaución.

La siguiente guía se ofrece para la preparación y criopreservación de líneas celulares.

1. Coseche las células en la fase logarítmica de crecimiento de la misma manera que se usa para el subcultivo de rutina. Para líneas celulares adherentes, coseche lo más cerca posible de un 80-90% de confluencia.

2. El procedimiento estándar es utilizar un crioprotector al 90% de suero + 10% para todas las líneas celulares, a menos que se especifique lo contrario en la hoja de datos. Dejar 1 ml por cada ampolla. La mayoría de las líneas celulares se pueden congelar en el medio de cultivo adecuado complementado con un 20% de suero y un 10% de crioprotector. Esto suele ser DMSO, pero en ciertos casos se recomienda glicerol. Si DMSO no es adecuado, se especificará una alternativa en la Hoja de Datos de la Línea Celular.

3. Células de pellets por centrifugación, por ejemplo, 150 x g durante 5 minutos. Resuspender los gránulos de células en el medio de congelación adecuado para obtener una concentración final de células entre 2 y 4 x 106 células / ml y pipetear 1 ml en cada ampolla.

4. Congele las celdas a una velocidad de enfriamiento de entre 1 y 3oC / min utilizando un congelador controlado por velocidad programable o una alternativa adecuada1. Cuando la temperatura alcance al menos-130oC, transfiera la ampolla a un recipiente de almacenamiento de nitrógeno líquido en fase gaseosa.