COLO 205

onnistunut Soluviljely:

*lue seuraavat tärkeät tekniset tiedot ennen kuin käsittelet ECACC: n toimittamia solulinjoja*. Nämä tiedot ovat saatavilla myös PDF-tiedostona päävalikostamme kohdasta “Asiakaspalvelu” (klikkaa tästä).

pakastettujen kennojen varastointi

vastaanotettaessa pakastetut ampullit on viipymättä siirrettävä suoraan kaasufaasiseen nestemäiseen typpeen, ellei niitä ole tarkoitus käyttää heti. Älä käytä -80°C: n pakastinta vaihtoehtona; tämä johtaa elinkelpoisuuden menetykseen.

näin käsittelet pakastettuja soluja vastaanotettaessa

saatuaan lähetyksen ecacc: n toimittamia pakastettuja solulinjoja on tärkeää, että loppukäyttäjä kiinnittää lähetykseen viipymättä huomiota. Ennen ampullien irrottamista kuivajäästä kannattaa tutustua solulinjojen mukana tulevaan tekniseen neuvontaan. Oikea käsittely välittömästi vastaanottamisen jälkeen on ratkaisevan tärkeää, jotta solulinja voidaan määrittää onnistuneesti loppukäyttäjän laboratoriossa.

solulinjaa tilattaessa loppukäyttäjien olisi myös harkittava uuden solulinjan viljelyolosuhteita ja varmistettava, että sopiva väliaine on saatavilla solujen saapuessa.

Solulaskennan merkitys

Suorita elinkelpoinen soluluku, kun elvytät ja korjaat soluviljelmiä. Yksi yleisimmistä syistä solujen määrittämisen epäonnistumiseen viljelmässä johtuu siitä, että elvytyshetkellä käytetään väärää elinkykyisen solun kylvötiheyttä, eli solut kylvetään liian alhaisiksi tai liian korkeiksi. Tämä voidaan välttää tekemällä elinkelpoinen soluluku ja noudattamalla suositeltua kylvötiheyttä.

tietyn solulinjan kanssa työskentelet, Lue tiedot alla ‘kuvaus’välilehti sivuillamme. Nämä tiedot löytyvät myös solulinjan tietolomakkeesta, joka toimitetaan sinulle paperiversiona solulinjan lähetyksen kanssa. Kylvötiheys näkyy alakulttuurin rutiinitiedoissa. Kun soluja kylvetään välittömästi elvytyksen jälkeen, käytetään annetun kylvötiheysalueen puolivälistä yläpäähän.

pakastettujen solujen elvytys

on tärkeää käsitellä pakastettuja ampulleja huolellisesti; käyttää laboratoriotakkia, täydellistä suojaavaa kasvonaamiota ja käsineitä. Harvoissa tapauksissa ampullit voivat räjähtää lämpenemisen seurauksena loukkuun jääneen nestemäisen typen laajenemisen vuoksi.

1. Pidä pakasteampullin korkin ympärillä mikrobiologisessa turvakaapissa 70-prosenttiseen alkoholiin liotettua kudosta. Käännä suojusta neljänneskierros, jotta jäljelle jäänyt nestemäinen typpi vapautuu. Kiristä korkki uudelleen. Siirrä ampulli nopeasti 37oc-vesihauteeseen, kunnes jäljellä on vain yksi tai kaksi pientä jääkidettä (1-2 minuuttia). On tärkeää sulattaa nopeasti, jotta solukalvot eivät vaurioidu.
Huom.ampullia ei saa upottaa kokonaan, sillä se voi lisätä kontaminaatioriskiä.

2. Pyyhi ampulli 70% alkoholiin kastetulla kudoksella ennen avaamista.

3. Pipetoidaan ampullin koko sisältö steriiliin putkeen (esim.15 ml). Lisää sitten hitaasti 5 ml esilämmitettyä väliainetta, joka on jo täydennetty sopivilla ainesosilla. Solujen elinkykyinen tiheys määritetään trypaaninsinisellä tahralla, hemosytometrillä ja käänteisellä mikroskoopilla solujen laskemiseksi tai vastaavalla solulaskentamenetelmällä. Siirretään sopiva määrä solususpensiota, jotta saavutetaan solulinjan tiedonsyöttöön suositeltu solujen kylvötiheys.

kiinnittyneet solulinjat: säädetään väliaineen tilavuus ja tarvittaessa pullokoko, jotta saavutetaan solulinjan tietolomakkeessa suositeltu solujen kylvötiheys. Sentrifugointia edeltävä vaihe kryosuoja-aineen poistamiseksi ei yleensä ole tarpeen, koska ensimmäinen väliaineen vaihto poistaa kryosuoja-aineen jäännökset. Jos on, niin tämä tarkennetaan tiedotteessa. Jos solut on käytettävä välittömästi (esim.solupohjaisessa määrityksessä) alakasvatuksen sijaan, voi olla suositeltavaa suorittaa sentrifugointia edeltävä vaihe kryosuoja-aineen poistamiseksi.

suspensiosolulinjojen* osalta suositellaan sentrifugointia edeltävää vaihetta kryosuoja-aineen poistamiseksi, ts. kennoja pelletoidaan sentrifugoimalla 150 x g: n lämpötilassa 5 minuutin ajan ja suspendoidaan kennoselletti uudelleen tuoreeseen väliaineeseen käyttäen sopivaa tilavuutta oikean kylvötiheyden saavuttamiseksi.

1. Inkuboidaan pullot tietolomakkeessa suositeltuun lämpötilaan ja CO2-tasoon. Jos käytetään CO2: lla ruokittua inkubaattoria, pullossa on oltava tuuletusaukko kaasunvaihdon mahdollistamiseksi.

jäädytetyt Hybridoomaviljelmät

kun hybridoomaviljelmiä otetaan talteen pakastetuista, ei ole epätavallista, että kasvu on aluksi odotettua hitaampaa ja elinkelpoisuus saattaa heikentyä. Aktiivisesti leviävän kulttuurin perustaminen voi kestää jopa 2 viikkoa.

elvytyksessä sentrifugointivaihe kryoproteiinin poistamiseksi on välttämätön. Sulata pakasteampulli nopeasti vesihauteessa 37°C: ssa 1-2 minuuttia. Siirrä sisältö sentrifugiputkeen ja lisää hitaasti 5-10 ml esilämmitettyä kasvualustaa+. Otetaan näyte laskemista varten. Sentrifugoidaan 100 x g: ssa 2-3 minuutin ajan kennojen ja siementen pelletoimiseksi suhteellisen suurella tiheydellä 5-7 x 105 solua/ml. Viljelmäpullo asetetaan tasaiseksi ja sitä seurataan säännöllisesti, kunnes elinkelpoisia jakautuvia soluja havaitaan.

+usein hybridoomaviljelmät voivat hyötyä siitä, että ne sekoitetaan uudelleen väliaineeseen, jota on täydennetty 20%: lla FBS: ää viljelmän perustamisen varhaisessa kriittisessä vaiheessa välittömästi elvytyksen jälkeen.

kennojen Jäädytysmenettely

ECACC suosittelee varotoimenpiteenä, että solulinjat jäädytetään pian niiden saamisen jälkeen(2 – 4 x 106 solua/ml).

solulinjojen valmistukseen ja kylmäsäilytykseen tarjotaan seuraava opas.

1. Sadonkorjuu solut log vaiheessa kasvua samalla tavalla käytetään rutiininomainen alakulttuuri. Kiinnittyneiden solulinjojen sadonkorjuu on mahdollisimman lähellä 80-90% konfluenssia.

2. Vakiomenettely on käyttää 90% seerumia + 10% kryoproteiinia kaikille solulinjoille, ellei tiedotteessa toisin mainita. Jokaista ampullia kohti annetaan 1 ml. Useimmat solulinjat voidaan jäädyttää sopivassa viljelyaineessa, jota täydennetään 20-prosenttisella seerumilla ja 10-prosenttisella kryoproteiinilla. Tämä on yleensä DMSO, mutta tietyissä tapauksissa suositellaan glyserolia. Jos DMSO ei sovellu, solulinjan tietolomakkeessa ilmoitetaan vaihtoehto.

3. Pellettikennoja sentrifugoimalla esim.150 x g 5 minuutin ajan. Suspendoidaan solupelletit uudelleen sopivaan kylmäaineeseen, jolloin lopullinen solupitoisuus on 2-4 x 106 solua/ml ja pipetoidaan 1 ml kuhunkin ampulliin.

4. Kennot jäädytetään jäähdytysnopeudella 1-3oc / min käyttäen ohjelmoitavaa pakastinta tai sopivaa vaihtovirtaa1. Kun lämpötila on vähintään-130oc, siirrä ampulli kaasufaasiin nestemäisen typen säilytysastiaan.