Arabidopsis cmt3 kromometylaasimutaatiot estävät endogeenisen geenin ei-CG-metylaation ja hiljentämisen | Jiotower

tulokset ja keskustelu

tunnistaaksemme tekijät, jotka ohjaavat ws PAI-geenien metylaatiota ja hiljentämistä, eristimme WS: n mutanttimuunnoksen, pai1C251Y, jossa metyloidun singletin pai2-geenin hiljentäminen voidaan visualisoida sinisen fluoresoivan kasvin fenotyypin voimakkuudella ultra-violetti (UV) valo (bartee and Bender 2001). Pai1c251y-kannassa ainoat mahdolliset Pai-entsyymin toiminnan lähteet ovat missense-mutaation rampauttama PAI1-geeni ja vaiettu PAI2-geeni. Tämän PAI-puutoksen vuoksi kantaan kertyy fluoresoivia tryptofaanireitin välituotteita sekä keltavihreän lehtien pigmenttiä, pienempää kokoa, runsastunutta tuuheutta ja alentunutta hedelmällisyyttä. Kuitenkin toisen sivuston mutaatiot, jotka lievittävät PAI2-hiljentymistä, tukahduttavat PAI-puutteelliset fenotyypit (Bartee and Bender 2001). Niinpä me mutagenisoimme pai1c251y-kannan ja seuloimme taimet, joilla on tukahdutettu heikko fluoresoiva fenotyyppi. Toissijaisena seulontana testasimme Pai-metylaatiota Southern blot-analyysillä metylaatioherkillä restriktioentsyymeillä. Erityisesti määritimme metylaation Isoschizomeerit HpaII ja MspI, jotka tunnistavat sekvenssin 5 ‘- CCGG-3’. HpaII on herkkä sekä sisempien (CG) että ulompien (CNG) sytosiinien metylaatiolle, kun taas MspI on herkkä vain ulompien sytosiinien metylaatiolle. Nämä entsyymit hajoavat kerran kussakin WS PAI-lokuksessa ja paljastavat kunkin geenin tiheyden ja metylaation mallin (Bender and Fink 1995; Luff et al. 1999; Melquist ym. 1999).

tästä seulontastrategiasta eristimme 11 toimimatonta alleelia CMT3-geenistä (KS.alla sekä materiaalit ja menetelmät). Pai1c251y-taustan cmt3-mutantit osoittivat voimakkaasti vähentynyttä fluoresenssia taimien varhaiskehityksessä ja osittain vähentynyttä fluoresenssia aikuisilla kasveilla, jolloin niiden koko kasvoi, tuuheus väheni ja hedelmällisyys lisääntyi(Kuva. (Kuva.1).1). Nämä välivaiheen fluoresoivat cmt3-isolaatit eivät palanneet havaittavalla taajuudella nonfluoresenssiin, joka on pai2-metylaatiojäännöksen häviämisen diagnostinen menetelmä (Bender and Fink 1995). Heillä näkyi osittain lisääntynyt pilkkominen HpaII: lla ja voimakkaasti lisääntynyt pilkkominen MspI: llä Pai-geenien osalta suhteessa vanhempien pai1c251y: hen (Kuva. (Kuva.2 A).2 A). Pilkkoutumistapa viittasi siihen, että cmt3-mutantit kärsivät eniten Pai-geenien CNG-metylaation ylläpidosta. Selvittääksemme, vaikuttivatko cmt3-mutantit myös erittäin toistuvan genomisekvenssin metylaatioon, toistelimme HpaII / MspI Southern blot-luotaimella 180-bp centromere-associated repeat (Cen) – sekvensseihin (Vongs et al. 1993). Tämä koetin paljasti vähän vaikutusta HpaII pilkkoutuminen, mutta lisääntynyt MspI pilkkoutuminen, Yhdenmukainen havaittu malli Pai geenit (Fig. (Kuva.2b).2b). Samanlaista MspI-pilkkoutumisen lisääntymistä havaittiin myös toistuvissa rDNA-tutkimuksissa (tietoja ei näy). Kaikilla testatuilla 11 cmt3-alleeleilla oli näissä määrityksissä identtiset metylaatiomallit. Lisäksi kun cmt3-alleelit erotettiin pai1c251y-alleelista villityyppiseen ws-taustaan, niillä oli myös identtiset metylaatiomallit näissä määrityksissä (Kuva. (Kuva.2).2). PAI-ja CEN-metylaatiomallit erosivat tyypillisten ddm1-ja metylaatiopuutteisten mutaatioiden aiheuttamista kuvioista (Fig. (Kuva.2; 2; Bartee ja Bender 2001).

cmt3-mutanttitaustan metylaatiokuvioiden tarkemmaksi määrittämiseksi suoritimme edustavan cmt3-alleelin pai1 – ja PAI2-promoottorialueiden metylaatiokuvioiden genomisekvenssin natriumbisulfiittimutageneesin avulla (Frommer et al. 1992). Tämä analyysi osoitti, että suurin osa metyloiduista sytosiineista (87% pai1: ssä ja 70% PAI2: ssa) esiintyi CG-jäämissä (Kuva. (Kuva.3; 3; Taulukko Taulukko1).1). Verrattuna villityyppiseen WS PAI1-promoottoriin (Luff et al. 1999; Taulukko 1),1), CG-metylaatiota vähennettiin 34%, CNG-metylaatiota poistettiin ja asymmetristä metylaatiota vähennettiin 93%; PAI2-promoottorissa CG-metylaatiota vähennettiin 8%, CNG-metylaatiota vähennettiin 92% ja ei-CG-metylaatiota vähennettiin 75%. CMT3-funktion häviämisellä on siis voimakas vaikutus CNG: n ja epäsymmetrisen metylaation ylläpitoon ja heikompi vaikutus CG-metylaation ylläpitoon. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia raporttien kanssa, joiden mukaan Arabidopsis CMT3 ja maissi ZMET2 ovat tärkeitä CNG-metylaation ylläpidossa eri genomialueilla (Lindroth et al. 2001; Papa et al. 2001), mutta ne osoittavat edelleen, että CMT3 on tärkeä myös Pai-geenien epäsymmetrisen metylaation ylläpitämisessä. Tämä tulos merkitsee joko sitä, että CMT3 ohjaa suoraan sekä symmetristä että epäsymmetristä metylaatiota tai että symmetrisen metylaation väheneminen cmt3-mutanttitaustalla aiheuttaa toissijaisena seurauksena asymmetrisen metylaation vähenemisen. Koska pai2 reporter-geenin promoottorin ja ensimmäisen eksonin metyloidut sekvenssit (∼370 bp) sisältävät vain 16 hajanaista CG-motiivia, ei-CG-metylaation menetys hypometyloi merkittävästi geenin tätä aluetta (Kuva. (Kuva.3), 3), mikä selittää tehostetun pai2-ilmaisun vaimennusmutantissa.

cmt3 – mutanttiosasto pai1c251y cmt3-suppressori-isolaateissa kartoitettiin risteyttämällä polymorfisen kannan ND-0 kanssa, jolla on samanlainen tiheästi metyloituneiden PAI-geenien järjestely kuin WS: ssä (Melquist et al. 1999). F2-jälkeläiset, joiden heikosti fluoresoivat fenotyypit diagnosoitiin homotsygoottisuudella sekä pai1C251Y: n että cmt3: n osalta, tunnistettiin silmämääräisellä tarkastuksella UV-valossa ja MspI Southern blot vahvisti voimakkaan Pai-pilkkoutumisen, joka oli samanlainen kuin vanhempien vaimentaja-isolaateissa. Nämä kriteerit täyttävien F2-kasvien kartoituspopulaatiota käytettiin sitten suppenevaan fenotyyppiin liittyvien genomisten lokusten pisteytykseen. Kartoitusanalyysi paljasti yhteyden yhteen lokukseen kromosomi 1: n alahaarassa. Koska CMT3-oletettu sytosiinimetyylitransferaasigeeni kartoittaa tämän lokuksen, keskityimme tähän geeniin ehdokkaana. Jokaisesta kartoituspopulaatiosta löysimme täydellisen yhteyden polymorfiseen markkeriin, joka on 100 kb: n sisällä CMT3-geenistä. Vahvistaaksemme, että CMT3-geeni oli itse asiassa metylaatiosuppressorimutaatioiden paikka, kloonasimme ja sekvensoimme geenin 11 mutanttisolaatista. Sekvensointi paljasti yhden emäsmuutoksen CMT3 – koodausjärjestyksessä jokaisessa isolaatissa. Kolme mutanttialleelia vaikutti täysin säilyneisiin aminohappoihin metyylitransferaasin katalyyttisessä domeenissa, mukaan lukien edustava cmt3G456D-alleeli, jota käytetään bisulfiittien sekvensointiin. Toisen alleelin ennustettiin lopettavan proteiinin ennenaikaisesti. Kaksi alleelia loi liitoskohtamutaatioita. Loput viisi alleelia vaikuttivat metyylitransferaasi motif IV: n ja proteiinin C-Terminuksen välisiin aminohappoihin, jotka ovat erittäin säilyneitä CMT-geenien joukossa (Fig. (Kuva.4).4).

vahvistaaksemme, että CMT3-geeni oli mutanttilokus, muutimme pai1c251y cmt3-isolaatit villin tyypin WS-genomikloonilla CMT3-geenistä. Muuntuvat taimet olivat voimakkaasti fluoresoivia, samoin kuin pai1c251y-kannan (Kuva. (Kuva.1).1). T2-sukupolven Southern blot-analyysillä määritetyt transformanttilinjat osoittivat pai2-geenin remetylaation alkuperäisen pai1C251Y-kannan tasolle (tietoja ei näy). Näin kloonattu CMT3-geeni voisi täydentää mutanttimetylaatiovirheitä. Kontrollina myös edustava pai1c251y cmt3G456D-mutantti muuntui villityypin WS-genomikloonilla CMT2-geenistä. CMT2 – muuntajan taimet olivat heikosti fluoresoivia, samoin kuin muuntamattoman vanhempaislajin taimet (Kuva. (Kuva.1), 1) ja ei osoittanut havaittavaa pai2: n remetylaatiota. Tämä analyysi osoittaa, että CMT2 ei voi korvata CMT3-funktiota. Tässä suhteessa on mielenkiintoista huomata, että CMT2 eroaa CMT3: sta ensisijaisesti N-terminaalisarjallaan (Kuva. (Kuva.44).

aiemmin tunnettu metylaatiopuutteinen Arabidopsis-kanta, jossa on vikoja joko SWI2 / SNF2 kromatiinin remodeling factor-related geeni DDM1: ssä(Jeddeloh et al. 1999)tai dnmt1-sukuinen MET1-sytosiinimetyylitransferaasigeeni näyttää eteneviä kehityshäiriöitä (Finnegan et al. 1996; Kakutani et al. 1996; Ronemus et al. 1996). Alustavassa analyysissämme kuuden sukupolven sisäsiittoisista pai1C251Y cmt3-ja kahden sukupolven sisäsiittoisista cmt3-kannoista ei löytynyt selvää morfologisten muutosten erottelua. Tämä ero cmt3: n ja muiden metylaatiopuutteesta kärsivien mutanttien välillä johtuu todennäköisesti siitä, että CMT3: ssa CG-metylaatio säilyy suuremmassa määrin kuin ddm1: ssä tai met1: ssä (kuva. (Kuva.2; 2; Bartee ja Bender 2001). Koska monet endogeeniset metyloituneet paikat Arabidopsis genomin, kuten CEN toistaa (Kuva. (Kuva.2; 2; Vongs et al. 1993; Lindroth ym. 2001), ja FWA homeo-domain-geenin promoottori (Soppe et al. 2000; Lindroth ym. 2001), kuljettaa pääasiassa CG-metylaatiota, cmt3-mutaatioiden ei odoteta vaikuttavan voimakkaasti näihin lokuksiin. Sen sijaan CMT3 todennäköisesti toimii vahvistavana metylaasina, joka lisää ylimääräisen metylaatiokerroksen tietyille genomialueille, kuten PAI-geeneille, joissa lisääntynyt metylaatiotiheys johtaa lisääntyneeseen hiljentymiseen. Erityinen malli on, että muiden toimintojen, kuten MET1, tarjoama CG-metylaation tyvikerros voisi toimia ohjeena CMT3: lle, joka sitten koristaisi tyvikerroksen ylimääräisellä CG: llä ja ei-CG-metylaatiolla. CMT3: n rekrytointi kohdealueille voi liittyä kromatiiniproteiinin vuorovaikutuksiin kromodomiinimotiivin kanssa (Henikoff ja Comai 1998) sekä ainutlaatuisten N-terminaalisten sekvenssien välittämiin vuorovaikutuksiin.

koska sienet kuten Neurospora crassa ja Ascobolus immersus voivat ylläpitää Ei-CG-metylaatiota (Selker et al. 1993; Goyon ym. 1994), nämä organismit saattavat koodata CMT-geenejä. Toisaalta, koska eläimillä, kuten ihmisillä ja hiirillä, ei ole CG-metylaatiota, näiltä organismeilta ennustetaan puuttuvan CMT-geenejä, kuten nykyisten sekvenssitietokantojen analyyseistä käy ilmi. CMT: n kaltaisten metylaasien näennäinen puuttuminen eläinten genomeista (Finnegan and Kovac 2000) viittaa siihen, että eläimillä on kehittynyt vaihtoehtoisia mekanismeja kromatiinitilojen vahvistamiseksi.