(a) Le cycle de vie sexuel de Chlamydomonas reinhardtii consiste… / Télécharger le Diagramme Scientifique

… la nature des substances génétiques qui défiaient la loi de Mendel. Des études approfondies au cours du siècle dernier, utilisant de nombreuses techniques, notamment la microscopie électronique, la génétique, la biologie moléculaire et la biochimie, ont révélé que les substances génétiques sont en fait des génomes dans les chloroplastes et les mitochondries (Kuroiwa, 1991; Birky, 1995). On pense que les chloroplastes (cp) et les mitochondries (mt) sont issus de relations endosymbiotiques ancestrales entre les cellules nucléées et les bactéries vivantes – les cyanobactéries et les bactéries alpha–pourpres, respectivement. Ils contiennent leurs propres génomes, qui sont vraisemblablement des vestiges de leurs progéniteurs (Gray, 1992). Aujourd’hui, nous savons que les gènes cp et mt sont transmis à la descendance uniquement à partir du parent maternel dans les divers taxons de plantes supérieures, de fougères, de mousses, d’algues (Kuroiwa 1991), de champignons (Mitchell et Mitchell 1952; Kawano et al. 1987), et les animaux (Hutchison et al. 1974), y compris les humains. L’hérédité uniparentale des génomes cp / mt a longtemps été considérée comme un résultat passif basé sur le fait que les œufs contiennent plusieurs nombres d’organites, tandis que les gamètes mâles, au mieux, n’en contribuent que quelques-uns (Gyllensten et al. 1991). Cependant, le processus d’héritage uniparental est susceptible d’être plus dynamique. Un exemple classique et frappant serait l’apparition d’un héritage non mendélien chez l’algue verte unicellulaire, Chlamydomonas reinhardtii, qui produit des gamètes de tailles identiques (isogames) (Sager 1954). Le cycle de vie de C.reinhardtii est d’une simplicité exquise. Il existe deux types d’accouplement de C. reinhardtii, le type d’accouplement plus (mt+) et le type d’accouplement moins (mt), contrôlés par un seul loci complexe de type d’accouplement sur le groupe de liaison VI (Ferris et al. 2002). C. reinhardtii subit un cycle de vie sexuel, qui comprend des étapes définies de différenciation (Figure 1). Les cellules végétatives se différencient en gamètes dans des conditions de privation d’azote et d’irradiation lumineuse (Pan et al. 1996). Quelques minutes après le mélange, les gamètes de types d’accouplement opposés adhèrent les uns aux autres par leurs flagelles et fusionnent pour former des zygotes. Après une période obligatoire de dormance, le zygote subit une méiose et une germination pour produire quatre descendants haploïdes. Plus de 90% des descendants qui se forment héritent de caractères chloroplastiques (cp), préférentiellement du parent mt+, un phénomène décrit pour la première fois il y a plus de 50 ans (Sager 1954). Sager a décrit les schémas d’hérédité de deux mutations induites par les UV, sr1 et sr2. La mutation sr1 confère une résistance à de faibles niveaux de streptomycine antibiotique, et la mutation sr2 confère une résistance à des niveaux élevés de streptomycine. Lorsque sr1 a été croisé à une souche sensible à la streptomycine, de faibles niveaux de résistance à la streptomycine ont été hérités, conformément à la loi de Mendel. En revanche, lorsqu’un parent mt+ porteur de la mutation sr2 a été croisé à un parent mt-sensible, toutes les descentes méiotiques étaient résistantes à des niveaux élevés de streptomycine. Dans le croisement réciproque, les descendants méiotiques étaient tous sensibles à la streptomycine (Sager, 1954). En 1962, la preuve de l’existence de l’adNPC provient de travaux au microscope optique et électronique de Ris et Plaut (Ris et Plaut 1962). Un an plus tard, Sager et Ishida ont décrit l’isolement de l’adNPC par centrifugation par gradient de densité de chlorure de césium (CsCl) (Sager et Ishida, 1963). En 1989, il a été démontré que la mutation sr2 se localisait dans le gène rps12 du génome cp (Liu et al. 1989). En 1972, une étude biochimique a montré que la quantité d’adNPC-mt diminuait par rapport à l’adNPC+mt, 6 à 24 h après l’accouplement (Sager et Lane, 1972). L’ADN des gamètes mt+ et mt- a été marqué avec 14 N- ou 15 NH 4 Cl, et la centrifugation par gradient de densité du CsCl a été utilisée pour surveiller le devenir de l’ADN nucléaire et de l’adNPC chez les zygotes de 6 et 24 h. Six heures après le développement du zygote, le signal représentant l’adNPC-mt était nettement inférieur à l’adNPC+mt, indiquant une réduction préférentielle de l’adNPC-mt par rapport à l’adNPC+mt. En 1980, les premières preuves moléculaires de la réduction préférentielle de l’adNPC-mt ont été fournies par Grant et al. (Grant et coll. 1980). Les auteurs ont surveillé le comportement des adNCP mt+ et mt-, en tirant parti des polymorphismes de longueur de fragment de restriction (RFLP), chez une souche mutante de C. reinhardtii ac-u-g-23 qui porte deux petites délétions dans son ADN chloroplastique. Les auteurs ont constaté que les délétions dans l’adNPC et le phénotype non photosynthétique étaient héréditaires uniparent. Le génome chloroplastique de 203 kb de C. reinhardtii (Maul et al. 2002) est présent à ~ 80-100 copies par cellule, et est organisé en 5-10 complexes ADN-protéines, appelés nucléoïdes chloroplastiques (Kuroiwa et al. 1981). En 1982, Kuroiwa et al. on a constaté que les nucléoïdes mt-cp colorés au DAPI (fluorochrome spécifique de l’adNDD, 4′, 6-diamidino-2-phénylindole) disparaissaient préférentiellement chez les jeunes zygotes dans les 50 minutes suivant l’accouplement (Kuroiwa et al. 1982). En 1999, la disparition préférentielle des nucléoïdes mt-cp a été observée chez un zygote vivant, en utilisant le vert SYBR I (fluorochrome spécifique de l’adNDD pouvant pénétrer dans les cellules vivantes) (Figure 1) (Nishimura et al. 1999). L’interprétation de ce phénomène dramatique était cependant controversée car la disparition préférentielle des nucléoïdes fluorescents mt-cp s’est produite bien avant que la réduction de l’ADN ne soit détectée par des méthodes biochimiques ou biologiques moléculaires (6 à 24 h après l’accouplement) (Sager et Lane, 1972). Deux possibilités principales ont été proposées pour expliquer cela. Une possibilité était que la désintégration des nucléoïdes cp puisse conduire à la dispersion des molécules d’adNPC, et la deuxième possibilité était que la digestion rapide des molécules d’adNPC puisse conduire à la disparition des nucléoïdes de l’adNPC. Un problème pour répondre à cette question est que la réaction d’accouplement est effectuée en utilisant des millions de gamètes mt + et mt- (Figure 2). La population cellulaire est inévitablement un mélange hétérogène de cellules, telles que des gamètes mt+ et mt- non appariés, des zygotes avec ou sans nucléoïdes mt-cp et des zygotes méitotiques exceptionnels (1 à 5%) qui ne forment pas de zygotes méitotiques (Ebersold 1967). En général, les méthodes moléculaires et biochimiques nécessitent de grandes quantités d’échantillons homogènes pour des analyses précises, et toute hétérogénéité dans les échantillons confondrait les résultats. En d’autres termes, les “personnalités” de cellules ou d’organites individuels au sein d’une population seraient diluées et très probablement perdues au cours des analyses. En revanche, la microscopie peut révéler les “personnalités” au niveau morphologique, mais pas au niveau moléculaire. Pour étudier l’état des molécules d’adNPC lors de la disparition des nucléoïdes mt-cp, il était nécessaire de collecter des zygotes en fonction de la présence ou de l’absence de nucléoïdes mt-cp, et d’analyser les zygotes individuels à l’aide de techniques de biologie moléculaire. Pour ce faire, des pinces optiques ont été utilisées (figure 3). L’utilisation de pinces optiques est une technique nouvelle pour manipuler des cellules vivantes ou des organites sous observation microscopique directe (Ashkin et al. 1987). Dans cette étude, un seul zygote avec ou sans nucléoïdes cp a été collecté à l’aide d’une pince à épiler optique, et la présence ou l’absence de molécules d’adNPC-mt a été déterminée par analyse PCR imbriquée. Les destins individuels des adNPC mt+ et mt-zygotiques ont été suivis séparément à l’aide d’un transformateur de chloroplaste LO3c, qui abrite le gène bactérien aadA (aminoglycoside adényl transférase). Les zygotes simples obtenus avec la pince à épiler optique ont été soumis à une analyse par PCR imbriquée hautement sensible pour l’aadA (Figure 4) (Nishimura et al. 1999). Lorsque les gamètes mt+ de L03c ont été croisés avec des gamètes mt-de type sauvage, des séquences de gènes aadA ont été détectées chez tous les zygotes examinés. Au contraire, lorsque les gamètes mt-L03c ont été croisés avec des gamètes de type sauvage, les séquences aadA n’ont été amplifiées que chez les zygotes plus jeunes (10 et 30 min après la formation des zygotes). Après la disparition des nucléoïdes fluorescents mt-cp, les séquences aadA n’ont plus été détectées dans les zygotes (90 et 120 min après la formation des zygotes). Ces résultats indiquent que les molécules d’adNPC-mt sont complètement digérées en 10 min, pendant lesquelles les nucléoïdes cp-mt disparaissent, et qu’au moins une nucléase très efficace est activée dans le chloroplaste mt juste après la formation du zygote. Cette digestion active de l’adNPC-mt est probablement à la base de l’héritage maternel de l’adNPC. Le modèle le plus simple pour l’héritage uniparental de l’adNPC est que le processus consiste en deux événements distincts susceptibles de se produire à différents stades du cycle de vie: une “protection” de l’adNPC mt +, peut-être pendant la gamétogenèse, et un “destructeur” de l’adNPC mt non protégé au début du développement du zygote. A) Hypothèse de restriction-méthylation En 1972, Sager et ses collègues ont proposé que l’adNPC-mt était digéré par l’action d’enzymes de restriction, alors que l’adNPC–mt+ était protégé par la méthylation – un modèle analogue au système bactérien de restriction-méthylation (Sager et Lane, 1972). Sager et ses collègues ont rapidement accumulé des preuves convaincantes montrant une augmentation du niveau de méthylation de l’adNPC mt +, détectée 7 h après l’accouplement (Burton et al. 1979; Royer et Sager 1979; Sano et al. 1980). De plus, la purification des ADN méthyltransférases spécifiques aux gamètes mt+, avec des poids moléculaires de 60 kDa et 20 kDa, a été rapportée (Sano et al. 1981). Cet événement de méthylation spécifique au gamète mt+ était apparemment réversible, comme on pouvait s’y attendre pour la protection (Sano et al. 1984). Le gène de l’ADN méthyltransférase résidente du chloroplaste a finalement été identifié en 2002, et son expression spécifique du gamète mt+ et sa localisation du chloroplaste ont été confirmées (Nishiyama et al. 2002). D’autre part, une série d’articles de groupes indépendants a par la suite soutenu que la méthylation de l’adNPC mt + ne pouvait pas expliquer la protection de manière adéquate. Bolen et coll. isolé un mutant nucléaire me1 qui méthyle constitutivement l’ADNCPC à un niveau plus élevé dans les cellules mt+ et mt- (Bolen et al. 1982). Lorsque des gamètes me1 ont été utilisés pour des croisements, des modèles d’héritage uniparentaux normaux ont été observés, incompatibles avec le…