Activité clastogène de la 2-chlorodésoxyadénosine dans les cellules somatiques de mammifères
MUTAGENÈSE
ARTICLE de RECHERCHE
Activité clastogène de la 2-chlorodésoxyadénosine dans les cellules somatiques de mammifères
Gilmara Ausech AntonucciI; Catherine He TakahashiI; II
Iuniversité de São Paulo, Faculté de Médecine de Ribeirão Preto, Département de Génétique, Ribeirão Preto, SP, Brésil.
IIUniversidade de São Paulo, Faculté de Philosophie, Sciences et Lettres de Ribeirão Preto, Département de Biologie, Ribeirão Preto, SP, Brésil.
Correspondance
RÉSUMÉ
de l’analogue de base 2-chlorodésoxyadénosine (2-CdA) utilisé en thérapie dans les troubles lymphoprolifératifs chroniques et avancés, est cytotoxique pour les lymphocytes diviseurs et non diviseurs. Le présent travail a évalué le potentiel clastogène de ce médicament in vitro dans des lymphocytes humains en culture et in vivo dans des cellules de moelle osseuse de souris BALB / c. Dans les lymphocytes humains, l’effet clastogène du 2-CdA a été étudié dans les phases G1, S et G2 du cycle cellulaire, en utilisant trois concentrations différentes (10, 20 et 40 mg / mL). Les paramètres analysés comprenaient l’indice mitotique (MI), l’indice de prolifération (PI), l’échange de chromatides sœurs (SCE) et l’aberration chromosomique (CA). L’analyse statistique par un test de variance (ANOVA) a montré une augmentation significative (p < 0.05) en fréquences de CA pour les cellules traitées pendant la phase S, mais l’IM n’a pas varié. Les concentrations testées n’ont pas produit d’augmentation significative de la fréquence moyenne des SCE, ni modifié la cellule PI dans les phases G1 et S. Les concentrations testées in vivo étaient de 0,25, 0,375 et 0,5 mg/kg de poids corporel. Dans ce test, aucune altération des fréquences de CA et d’IM n’a été observée aux doses testées. Par conséquent, les résultats indiquent un effet clastogène du 2-CdA dans les cultures de lymphocytes humains.
Mots clés: lymphocytes humains, 2-CdA, aberrations chromosomiques, ECS, cycle cellulaire.
Introduction
Les analogues de la purine sont très actifs dans le traitement des troubles lymphoprolifératifs (Pott-Hoeck et Hiddemann, 1995). La cladribine, la 2-chlorodésoxyadénosine (2-CdA), est un analogue nucléosidique avec un atome d’halogène remplacé en position 2 dans son cycle purine, ce qui confère une résistance à la désamination par l’adénosine désaminase (ADA). Le 2-CdA est un médicament de choix dans le traitement de la leucémie à cellules velues, mais il est également très efficace dans d’autres tumeurs malignes lymphoïdes de bas grade, y compris la leucémie lymphoïde chronique (LLC). Les rapports dans la littérature ont montré que le 2-CdA donne un taux de réponse complète (CR) et un taux de réponse globale (OR) similaires à la fludarabine, mais l’influence des deux agents sur les taux de survie des patients atteints de LLC est encore incertaine. Le taux de CR induit par le 2-CdA est significativement plus élevé que chez les patients traités par chimiothérapie conventionnelle (Robak, 2001). Le 2-CdA est un autre nouvel analogue chimiothérapeutique de la purine, avec une toxicité spécifique pour les lymphocytes (Schrimer et al., 1997). La cytotoxicité se produit dans les cellules proliférantes et quiescentes, entraînant des événements tels que l’inhibition de la synthèse de l’ADN et des protéines, ainsi que l’induction de l’apoptose (Robertsson et al., 1993). Malgré la toxicité, de bons résultats en matière de réponse thérapeutique ont été obtenus, et ce médicament est la principale option dans le traitement de la tricoleukémie où les patients présentent une leucémie à cellules velues (HCL) (Tallman et al., 1992; Tallman et coll., 1993).
Les désoxynucléosides d’adénine induisent une apoptose dans les lymphocytes quiescents et sont des médicaments utiles pour le traitement des maladies lymphoprolifératives indolentes. Plusieurs mécanismes ont été proposés pour expliquer la toxicité de la désoxyadénosine et de ses analogues dans les cellules quiescentes, notamment la liaison directe du dATP au facteur pro-apoptotique Apaf-1 et l’activation des voies caspase-9 et-3 (Genini et al., 2000).
Un patient atteint de leucémie myéloïde aiguë traité par 2-CdA et Ara-C présentait un retard de récupération de la moelle, une sinusite et une septicémie à Candida tropicalis. Elle a développé une défaillance multisystémique des organes et est décédée 1 mois après le début du traitement par LAM. L’examen post-mortem, limité à la poitrine et à l’abdomen, a révélé une candidose disséminée impliquant les poumons, le cœur, le foie, les reins et la rate (Mathew et al., 2000).
Zwaan et al. (2002) ont observé que les patients atteints de t (9: 11) semblaient être significativement plus sensibles que les autres patients atteints de LAM aux médicaments suivants: cytarabine (médiane: 2,9 fois), doxorubicine (4,5 fois), mitoxantrone (8,0 fois), 2-chlorodésoxyadénosine (10,0 fois).
Les analogues nucléosidiques (NA) tels que la cytosine arabinoside, la fludarabine, la cladribine et la gemcitabine sont des composants essentiels du traitement d’induction de la LAM (leucémie myéloïde aiguë); ils sont également efficaces pour traiter les troubles lymphoprolifératifs et ont été utilisés dans le traitement de certaines tumeurs solides. Ces composés importants partagent certaines caractéristiques communes, notamment en termes de transport par des transporteurs membranaires spécifiques, de métabolisme et d’interaction avec des cibles intracellulaires. Cependant, ils diffèrent en ce qui concerne les types de transporteurs, et leur interaction préférentielle avec certaines cibles pouvant expliquer l’efficacité contre les tumeurs à prolifération rapide (Galmarini et al., 2001).
Compte tenu de ces informations, il est important d’évaluer le potentiel clastogène du 2-CdA, sur la base des rapports selon lesquels ce médicament induit une cytotoxicité (Tallman et al., 1992; Tallman et coll., 1993) et des ruptures à un brin d’ADN (Liliemark et Juliusson, 1994). Le but de cette étude était d’évaluer la capacité de cet agent chimiothérapeutique à induire des lésions chromosomiques dans les lymphocytes humains et les cellules de moelle osseuse de souris BALB / c.
Matériaux et méthodes
Agent chimique
La 2-chlorodésoxyadénosine antitumorale a été gracieusement fournie par le Centre de chimiothérapie de l’Hôpital de Clínicas de l’École de Médecine de Ribeirão Preto (Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP) pour les expériences in vitro et in vivo.
Lymphocytes du sang périphérique humain
Des échantillons de sang ont été prélevés sur six volontaires sains non fumeurs (trois femmes et trois hommes), âgés de 25 à 35 ans et soumis à un traitement pendant les phases G1, S et G2 du cycle cellulaire, pour analyse de l’anomalie chromosomique (CA) et de l’indice mitotique (MI). De plus, les lymphocytes de trois individus (deux femelles et deux mâles) ont été utilisés pour l’analyse de l’échange de chromatides sœurs (ECS) et de l’indice de prolifération (IP). Les lymphocytes ont été cultivés dans un milieu RPMI-1640 à 78% (Sigma Chemical Co., St. Louis, États-Unis) additionné de sérum de veau foetal à 20% (Cultilab, Brésil) et additionné de pénicilline (5 mg /mL) et de streptomycine (10 mg/mL). Les cellules ont été stimulées avec 2% de phytohémagglutinine (Life Technologies, Grand Island, NY). Pour chaque 5 mL de milieu de culture, 1 mL de plasma a été ajouté et les cultures ont été incubées à 37 °C pendant 52 h pour l’analyse de CA. Des solutions de 2-CdA ont été diluées dans de l’eau désionisée aux concentrations suivantes : 10, 20 et 40 mg/mL de milieu de culture, selon Preston et al. (1987). Un contrôle négatif a été inclus dans toutes les expériences. La préparation et la coloration des lames ont été effectuées par des techniques standard (Moorhead et al., 1960). Des lames pour l’analyse de l’échange de chromatides sœurs (SCE) et de l’indice de prolifération (PI) ont été obtenues à partir de cultures parallèles auxquelles la 5-Bromo-2′-désoxyuridine (Sigma Chemical Co., St. Louis, États-Unis; 10 mg / mL) a été ajouté en plus du 2-CdA. La coloration différentielle des chromatides sœurs a été obtenue par la technique de fluorescence plus Giemsa, en utilisant Hoechst 33258 (Calbiochem-Behring Corp.; Solution de Hank à 0,05 mg/mL) et Giemsa à 5% (Merck). Cette méthode est une modification de celles publiées par Korenberg et Freedlender (1974) et Perry et Wolff (1974). Les diapositives ont été exposées à la lumière blanche pendant la nuit. Des préparations de métaphases avec 46 ± 1 chromosomes ont été analysées dans un test à l’aveugle. Les chromosomes ont été dessinés schématiquement pour le marquage SCE, ainsi que pour l’analyse de l’AC.
Protocoles de traitement
Traitement par 2-CdA de cultures de lymphocytes à différentes phases du cycle cellulaire
Aberrations chromosomiques (CAs)
Après sept heures d’initiation de la culture (phase G1), les cultures de lymphocytes ont été traitées par 2-CdA pendant 1 h à 37 °C en milieu de culture sans sérum. Les cellules ont été fixées 52 h après le début de la culture. Après traitement par 2-CdA, les cellules ont été lavées deux fois en milieu sans sérum et réincubées en milieu complet. Pour le traitement en phase S, 24 cultures h ont été traitées avec du 2-CdA pendant 6 h. Les cellules ont été lavées deux fois en milieu sans sérum, réincubées en milieu complet et fixées après 52 h d’incubation. Pour le traitement en phase G2, 69 cultures h ont été traitées avec du 2-CdA pendant 3 h, et les cellules ont été fixées après 72 h d’incubation. La colchicine (Merck 0,016%) a été ajoutée 1,5 h avant la fixation. Pour déterminer l’IM, 1000 cellules ont été notées par culture et 100 métaphases de chaque culture ont été analysées pour le CA, totalisant 6000 cellules et 600 métaphases, respectivement, pour chaque traitement.
Échanges de chromatides sœurs (ECS)
Des cultures de lymphocytes provenant de 4 donneurs sains (deux femelles et deux mâles) ont été traitées avec du 5-BrdU (10 µg/mL) au début de l’incubation, et lorsque les cellules ont atteint la phase G1 (7 h après le début de la culture), du 2-CdA plus 5-BrdU a été ajouté pendant 1 h à 37 °C dans un milieu de culture sans sérum. Après traitement, les cellules ont été lavées deux fois en milieu sans sérum, du 5-BrdU a été ajouté à nouveau puis les cellules ont été réincubées en milieu complet. Pour le traitement en phase S, 24 cultures h ont été traitées avec 2-CdA plus 5-BrdU en milieu sans sérum pendant 6 h. Après le traitement, les cellules ont été lavées deux fois en milieu sans sérum et réincubées en milieu complet avec 5-BrdU. Pour l’analyse SCE et PI, les cellules (phases G1 et S) ont été fixées 72 h après le début de la culture. Cinquante métaphases de deuxième division par culture ont été notées pour SCE, et cent métaphases de chaque culture ont été notées pour la première, la deuxième et la troisième division cellulaire, totalisant 200 métaphases et 400 cellules par traitement, respectivement. Le PI a été obtenu en utilisant l’équation suivante :
PI =
où M1 et M3 sont les nombres des métaphases de première et de troisième division, respectivement (Degrassi et al., 1989).
Animaux
Les animaux utilisés étaient des souris BALB / c (Mus musculus), obtenues auprès de la Maison des Animaux de l’École de Médecine de Ribeirão Preto.
Test in vivo sur des cellules de moelle osseuse de souris Balb /c
Des souris pesant environ 30 g (5-6 semaines) ont été divisées en groupes de 8 animaux (4 mâles et 4 femelles) et traitées par injection intrapéritonéale avec 0.5 mL / volume final de solution de 2-CdA diluée avec de l’eau distillée aux concentrations suivantes: 0,25, 0,375 et 0,5 mg / kg de poids corporel. Vingt-deux heures après le traitement (soit deux heures avant le sacrifice), les souris ont reçu une injection de 0,3 mL/volume final d’une solution de colchicine à 1% (Sigma) et ont été tuées par inhalation d’éther 2 h plus tard. Le groupe témoin négatif a reçu 0,5 mL d’eau distillée / volume final / animal et le groupe témoin positif a reçu du cyclophosphamide (CP), 25 mg / kg de poids corporel. Les préparations de moelle osseuse pour les cellules métaphasiques ont été obtenues par la technique standard (Ford et Hamerton, 1956). Les diapositives ont été analysées dans un test à l’aveugle et 100 métaphases par animal ont été dessinées schématiquement. L’IM a été obtenu en comptant le nombre de cellules mitotiques dans 1000 cellules analysées par animal, et 100 cellules ont été notées pour CA.
Analyse statistique
Une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) a été réalisée sur le nombre de métaphases anormales et le nombre total de CA, MI, SCEs et PI, avec des calculs des valeurs de P pour chaque phase du cycle cellulaire. Chaque fois que p < 0.05 a été trouvé, les valeurs moyennes de chaque traitement ont été comparées par le test Student-Newman Keuls. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide des progiciels Sigma Stat (Jandel Corporation).
Résultats
Lymphocytes humains
Les lymphocytes du sang périphérique ont été traités avec différentes concentrations (10, 20 et 40 mg/mL) de 2-CdA dans les phases G1, S et G2 du cycle cellulaire. Les aberrations chromosomiques (CA) et l’indice mitotique (IM) ont été analysés dans les lymphocytes traités de six individus sains (trois femelles et trois mâles) (tableau 1). Pour les cellules traitées pendant la phase S, on a observé une augmentation significative des fréquences de CA (p < 0,05) à toutes les concentrations, par rapport aux fréquences témoins. Les types d’aberrations chromosomiques les plus courants observés étaient les lacunes chromatides et isochromatides (données non montrées) et les ruptures, suivies de minutes doubles, de fragments doubles et de fragments simples. Pour les cellules traitées pendant les phases G1 et G2, les fréquences de CA n’ont montré aucune différence statistiquement significative entre les cultures traitées et les valeurs témoins. Bien qu’il y ait eu une légère variation pour l’IM, une différence statistiquement significative (p < 0,05) n’a été observée dans aucun des traitements par rapport aux indices témoins.
Les fréquences moyennes des échanges de chromatides sœurs (ECS) et de l’indice de prolifération (IP) ont été déterminées chez quatre témoins et dans des cultures de lymphocytes traitées par 2-CdA pendant les phases G1 et S dans des cultures récoltées après 72 h (tableau 2). Les concentrations testées (10, 20 et 40 mg/mL) n’ont pas entraîné d’augmentation significative de la fréquence moyenne des SCE, ni modifié la cellule PI pendant les phases G1 et S (Tableau 2).
Système médullaire de souris Balb/c
Les fréquences CA et MI ont été analysées dans des cellules médullaires de 8 souris Balb/c (4 femelles et 4 mâles) après un traitement intrapéritonéal avec 0,25, 0,37 et 0,50 mg/kg p.c. de 2-CdA (tableau 3). Dans le test in vivo, le 2-CdA n’a montré aucun effet cytotoxique pour aucune des doses testées concernant les fréquences de CA ainsi que les valeurs d’IM, lorsque tous les groupes de traitement ont été comparés. La plupart des aberrations étaient des ruptures de type chromatide. Aucune différence significative (p < 0,05) n’a été trouvée ni chez les animaux ni entre les mâles et les femelles pour les paramètres analysés.
Discussion
Au cours des dernières années, plusieurs études ont montré l’effet antiprolifératif des médicaments utilisés dans le traitement des tumeurs malignes lymphoïdes. Le 2-CdA est un analogue de base utilisé en chimiothérapie pour un type particulier de leucémie, la leucémie à cellules velues. Il existe également des données démontrant que le 2-CdA peut être utilisé en association avec d’autres médicaments, dans le traitement du lymphome non Hodgkinien réfractaire et récurrent de bas grade (LNH) (Laurencet et al., 1999; Robak et coll., 1999). Dans le présent travail, une étude cytogénétique in vitro a été réalisée pour évaluer le potentiel clastogène du 2-CdA dans les lymphocytes humains en ce qui concerne l’induction de CA et de SCE. Selon Moore et Bender (1993), les CAS structuraux peuvent entraîner une perte de matériel chromosomique. Le type de CA formé dépend de la nature de la lésion induite dans l’ADN et de la phase du cycle cellulaire au cours de laquelle les cellules ont été exposées (Natarajan et al., 1996).
Des cultures de lymphocytes ont été traitées avec trois concentrations de 2-CdA (10, 20 et 40 mg/mL) pendant différentes phases du cycle cellulaire. L’effet clastogène du médicament a été démontré par l’augmentation significative (p < 0,05) des fréquences de CA pour toutes les concentrations testées pendant la phase S du cycle cellulaire. Pour le traitement pendant cette phase, le 2-CdA a été laissé pendant 6 heures dans les cultures. Pour les agents agissant pendant une phase spécifique du cycle cellulaire, la séquence d’administration peut déterminer l’efficacité et la toxicité d’une association thérapeutique (Smorenburg et al., 2001).
Ces résultats concordent avec ceux rapportés par d’autres auteurs (Carson et al., 1983), suggérant que le 2-CdA est incorporé dans l’ADN produisant des cassures à un brin (SSB). Les SSB peuvent provenir à la fois directement, de la désintégration des sucres endommagés, ou indirectement, via le clivage enzymatique du squelette phosphodiester. Les SSB directs proviennent principalement d’une attaque par des radicaux libres tels que les espèces réactives de l’oxygène, tandis que les SSB indirects sont principalement des intermédiaires normaux de la réparation par excision de base de l’ADN (BER). Les SSB sont également les lésions les plus courantes induites par des génotoxines exogènes telles que les rayonnements ionisants, les agents alkylants et le poison topo1, la camptothécine et ses dérivés anticancéreux (Caldecott, 2004).
Certains rapports montrent que l’analogue de base a besoin d’une période de temps plus longue pour que la phosphorylation se produise (Gandhi et al., 1997). Ce mécanisme peut expliquer l’augmentation de la fréquence des aberrations chromosomiques totales pendant la phase S du cycle cellulaire. Le même mécanisme se produit dans les cellules traitées avec de la mitomycine C, un composé dépendant du S, qui nécessite une réplication de l’ADN pour convertir les dommages à l’ADN en aberrations chromosomiques (Evans et Scott, 1964; Traganos et al., 1980). D’autres agents antitumoraux représentent le même mécanisme et l’action de la 2-CdA, tels que la fludarabine et la 1-b-D-arabinosylcitosine (ara-C).
Les analogues nucléosidiques cytotoxiques ont une large utilisation clinique. Ils ont été parmi les premiers agents chimiothérapeutiques utilisés dans le traitement des maladies malignes. Les nucléosides anticancéreux comprennent des analogues de la pyrimidine physiologique et des nucléosides de purine. Ces agents agissent comme des antimétabolites, en compétition avec les nucléosides naturels lors de la synthèse de l’ADN ou de l’ARN et comme inhibiteurs des enzymes cellulaires clés (Szafraniec et al., 2004), sont spécifiques du S et doivent être phosphorylés pour activer les triphosphates (Plunkett et al., 1980). Pendant la phase S du cycle cellulaire, lorsque le matériel génétique est dupliqué par la machinerie de réplication de l’ADN, les cellules sont particulièrement vulnérables à l’insulte génotoxique. Alors que les points de contrôle G1 et G2 / M arrêtent la progression du cycle cellulaire à des points bien définis par l’inhibition des kinases dépendantes des cyclines, les points de contrôle intra-phase S sont connus pour se produire à tout moment de la phase S et impliquent de multiples voies de signalisation (Sidorova et Breeden, 2003; Andreassen et al., 2003)
Il est très important d’analyser le mécanisme de la réponse au médicament au cours des différentes phases du cycle cellulaire. Le niveau élevé de lésion chromosomique peut être dû à la cytotoxicité du 2-CdA causée par sa conversion en 2-CdATP, qui induit une inhibition de la synthèse de l’ADN et de la réparation de l’ADN, impliquant les enzymes ribonucléotide réductase et ADN polymérases. Ce composé présente une résistance à l’activité de l’adénosine désaminase (ADA), qui est conférée par un atome de chlore et le remplacement de l’hydrogène en position 2 du cycle purine adénosine (Baltz et Montello, 1993).
Les ECS sont souvent considérés comme un paramètre pour évaluer la génotoxicité, car leur fréquence est clairement augmentée par l’exposition à de nombreux produits chimiques mutagènes et cancérigènes. Dans la présente expérience, les fréquences des ESC dans les cultures traitées avec 2-CdA ont présenté une légère augmentation par rapport aux cultures témoins. L’augmentation observée au cours des deux phases n’a pas varié de manière significative.
Étant donné que de nombreux médicaments sont activés après leur métabolisation, des tests de mutagénicité in vivo sont recommandés pour évaluer l’activité clastogène des composés nécessitant une activation métabolique. Une telle approche fournit également des conditions similaires à celles trouvées chez l’homme (Legator et Ward Jr., 1991). Bien qu’il existe des différences entre les rongeurs et les humains, il est recommandé que toute évaluation repose à la fois sur des études in vitro et in vivo, et non simplement sur l’une ou l’autre d’entre elles (Huggett et al., 1996).
Dans la présente étude, l’effet clastogène du 2-CdA a également été analysé dans des cellules de moelle osseuse de souris BALB / c à des concentrations de 0,25, 0,375 et 0,5 mg / kg de poids corporel. Les résultats ont montré que le 2-CdA n’était pas efficace pour induire des aberrations chromosomiques. L’absence d’effet in vivo peut être due à la quantité limitée de 2-CdA disponible, car elle a été donnée dans des conditions diluées. Des effets génotoxiques de la gemcitabine analogue de base ont été rapportés dans des cellules de moelle osseuse de souris en utilisant les systèmes de test du micronoyau et de l’aberration chromosomique. Aydemir et Bilaloglu (2003) ont montré que la gemcitabine n’induisait aucun CAs significatif et qu’elle ne provoquait pas non plus de réduction de l’IM pendant une période de traitement de 6 h à des doses de 2,0, 4,0 et 8,0 mg/ kg p.c., par rapport au témoin négatif; en revanche, la fréquence du CAs total a été significativement augmentée par la gemcitabine (p < 0,0001) sur une période de traitement de 24 h avec les mêmes doses.
En conclusion, le 2-CdA a montré un effet clastogène dans des cultures de lymphocytes humains traitées in vitro pendant la phase S du cycle cellulaire, mais un effet clastogène non significatif a été observé dans les cellules traitées pendant les phases G1 et G2. Dans le test in vivo chez la souris, le 2-CdA n’a montré aucun effet clastogène aux doses testées.
Remerciements
Nous sommes reconnaissants au Prof. Dr. A.T. Natarajan, Dr. Elza T. Sakamoto Hojo et le Dr Lusania G. Antunes pour leurs précieux commentaires sur le manuscrit et à M. Luiz Augusto da Costa Jr., M. Silvio A. dos Santos et Mme Sueli A. Neves pour leur précieuse assistance technique. Le procédé CAPES et FAPESP n. 99/10643-7 a soutenu cette recherche. Le Comité d’éthique de la recherche a approuvé le projet (Processus: CONEP n. 25000.074430/2001-88).
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