Anatomie et physiologie

La présente étude a été réalisée, avec des règles et une réglementation pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire de la maison animale et l’expérience respective a été approuvée par le Comité Central d’éthique Animale. 25 souris albinos suisses femelles avec un âge moyen de 45 jours et un poids de 25 à 35gm ont été choisies au hasard dans des animaleries, de différentes colonies reproductrices. Ces adultes femelles non gravides ont été intentionnellement copulés par des souris mâles de la même variété dans le but d’obtenir 10 petits de génération ultérieure. Dans la cage en plastique polycarbonate avec des garnitures en acier inoxydable, un seul mâle hétérozygote fort et robuste a été placé avec une seule femelle dans une atmosphère maintenue en continu à 20-25C et 55 ± 5% d’humidité, 12 heures après le cycle clair et sombre. Les souris femelles ont été examinées pour détecter un bouchon croisé vaginal et la présence d’un bouchon bien visualisé a été marquée comme une grossesse déterminée et un jour zéro de grossesse attribué. Les jours 7, 8 et 9 de la gestation, les femelles branchées ont été testées pour la grossesse par palpation abdominale.

Caractérisation des AGNP

Les nanoparticules d’argent provenant de sources d’achat de recherche ont été évaluées pour leur taille primaire par MET et pour leur agglomération dans le milieu cellulaire par spectroscopie de corrélation croisée de photons (PCCS) et spectroscopie ultraviolette–visible (UV-Vis), Diffusion dynamique de la lumière et potentiel Zêta. Des photos GFT représentatives des AGNP ont été montrées. Les images TEM des AGNP revêtus de PVP dispersées et suspendues en 1.Le NaCl 5M a confirmé la taille des particules primaires indiquée par les fabricants. Les nanoparticules d’argent non revêtues ont trouvé une distribution hétérogène dans la plage de 50 à 100 nm, la plupart d’entre elles étant d’environ 71 nm.

Dans le cas des AGNP en poudre en suspension, les images TEM ont montré que dans un environnement aqueux, les nanoparticules d’argent s’agglutinent et forment de gros agrégats, dont beaucoup sont supérieurs à 50 nm. Ce résultat est conforme aux résultats de la distribution de taille hydrodynamique qui a été obtenue à partir de la méthode de diffusion dynamique de la lumière (zeta sizer). Les analyses EDX ont confirmé que seul l’argent élémentaire était présent dans les AGNP colloïdaux et en poudre sèche. Selon les résultats de l’ICP-AES, les concentrations d’ions Ag dans les stocks digérés par l’acide d’AGNP de poudre colloïdale et en suspension étaient respectivement de 1908,1 et 447,2 mgl-1. De plus, les résultats du diagramme XRD confirment la cristallinité des AGNPS de type pulvérulent et la présence d’argent cristallin élémentaire, d’autres phases, à l’exception de l’argent métallique, n’étaient pas présentes dans l’échantillon. De plus, les résultats XRF ont montré que la pureté des AGNP de type poudre était de 97,86%.

Exposition de la solution colloïdale d’AgNps par gavages oraux répétés

Des souris gravides ont été administrées en double avec une solution saline normale (contrôle fictif) comme véhicule et à une dose de 5, 10, 15, 20 mg / kg de poids corporel ont été administrées par gavages oraux répétés, de 7 à 12 jours de gestation à l’aide d’une aiguille d’alimentation à tige incurvée à pointe émoussée et d’une camionnette attachée. Les animaux témoins fictifs sont inclus dans l’expérience avec des animaux traités et des animaux non traités.

Dissection et éviscération

Au GD 18, les cornes droite et gauche de l’utérus de la mère enceinte ont été extériorisées à la suite d’une laparotomie ventrale sous anesthésie profonde à l’éther / chloroforme et 250 digues fraîches prélevées par dissection ont été lavées à l’eau du robinet sur boîte de Pétri pour éliminer le sang et le liquide amniotique et séchées par papier filtre et déshydratées dans de l’alcool à 95% pendant 48 heures, enfin exposées à 1% de KOH pour une éviscération de consistance et de l’alizarine protocole de coloration pour une visualisation correcte des os normaux ou anormaux.13

Méthode (Évaluation de la dysmorphologie squelettique par la technique d’éviscération et de coloration à l’alizarine) -:

L’étude de la dysmorphologie squelettique a été réalisée par la technique d’éviscération et de coloration à l’alizarine. Tous les spécimens (50 chiots) de chaque groupe ont été déshydratés dans 95% d’alcool (alcool rectifié) pendant 48 heures, puis retirés et lavés à l’eau courante du robinet, puis éviscérés par une solution de KOH à 1% (KOH 1gm + 100ml d.w.). Après la laparotomie ventrale, les organes vitaux sont enlevés. Les échantillons ont été plongés à fond dans une solution abondante d’hydroxyde de potassium (KOH) à 1% pendant au moins 2 à 4 jours jusqu’à ce que la chair, le tendon, les muscles et les viscères soient transparents & et se dissolvent, suivis d’une visibilité cristalline des os et des cartilages. Chaque solution de jour a été changée quand elle est décolorée et gaspillée.

L’échantillon visible d’os et de cartilage cristallin a ensuite été placé dans le même KOH à 1%, puis 6 à 8 gouttes de teinture d’Alizarine à 1% ont été ajoutées pour le colorer en rouge violacé profond. La solution a été doucement secouée quelques fois par heure. Ensuite, la même procédure a été poursuivie pendant encore 2-3jours afin de donner une couleur rouge violacé profond aux os et aux cartilages. Pour éliminer toute sur-coloration et lisser les échantillons, ceux-ci sont ensuite passés à travers 40%, 80% (40 ml de glycérol + 60 ml d’eau distillée, 80 ml de glycérol + 20 ml d’eau distillée) et 1 à 2 cristaux de thymol ajoutés pour une conservation à long terme finalement maintenus dans 100% de glycérol, servis pour une photographie & observation de lentilles à la main puissante.

Au total, 250 fœtus ont été collectés auprès de 25 mères de 1, 2, 3, 4 et 5 groupes parmi lesquels tous les échantillons ont été exposés à une expérimentation de dysmorphologie squelettique. 60 fœtus ont été observés en résorption.

Statistiques

Le pourcentage de malformation squelettique a été évalué dans chaque groupe et évalué en fonction du nombre d’os impliqués dans la dysmorphologie et enfin les pourcentages ont été comparés entre le groupe et au sein du groupe pour le facteur de tératogénicité dépendant de la dose. Test multi ANOVA et statistiques descriptives (analyse post hoc) utilisé à cet effet.

Observation et résultats

Le pourcentage de dysmorphologie squelettique était plus élevé et plus élevé chez les chiots du groupe traités à 15 mg d’AgNps et à 20 mg d’AgNps/kg de poids corporel (tableau 1).

Les groupes traités par AgNps à dose plus faible (0,5 & 1 mg/kg p.c.) ont été observés des pourcentages très minimes d’anomalies squelettiques, de sorte que ces groupes traités étaient presque considérés comme des fœtus du groupe témoin (figure 1).

Figure 1 Tache d’alizarine du fœtus témoin vue dorsale (A) et vue latérale (B).

L’un des chiots du groupe traités à 5 mg d’AgNps/ kg de poids corporel a montré un 5e segment sternal non ossifié de la barre sternale et un segment de Manumbrium non ossifié qui est diagnostiqué comme une fente sternale. D’autres fœtus ont présenté une hypoplasie maxillaire et mandibulaire, un os frontal, pariétal et nasal non osseux, une défaillance de la fusion du segment postérieur de l’os de la hanche, 10,11 et 12e côte vue rudimentaire sur le côté gauche de l’un des fœtus. L’absence de tige médiane de la 6e à la 12e côte ainsi que l’augmentation de l’espace entre les côtes successives ont été notées chez plusieurs fœtus de différents groupes et diagnostiquées comme une augmentation de l’espace de la toile, L’absence de processus épineux & du corps est observée dans des segments vertébraux thoraciques entiers qui est diagnostiquée comme une anomalie du tube neural de type proche dans 1% des cas de fœtus de ce groupe traité. Le pourcentage de dysmorphologie squelettique calculé dans ce groupe était de 32% (figure 2).

Figure 2 Tache d’Alizarine du fœtus du groupe traité par AgNps à 5 mg vue dorsale (A) et (B), vue latérale (C) vue ventrale (D) et vue dorsale (E)

Les fœtus du groupe traités par AgNps à 10 mg ont présenté une dysmorphologie squelettique sous forme d’absence de vertèbre lombaire et sacrée, d’absence d’os de la hanche, de côtes gravement dégénérées sans cartilages, d’os frontal et pariétal non ossifié et non développé, une scoliose est observée dans la région thoracique et lombaire chez l’un des fœtus, une absence de vertèbre cervicale est observée, une hypoplasie maxillaire, une divulgation et des sutures coronales sont également visibles. Les os des membres inférieurs non développés sont visibles des deux côtés de l’un des fœtus. Le pourcentage de dysmorphologie squelettique calculé dans ce groupe était de 44% (figure 3).

Figure 3 Tache d’alizarine du fœtus du groupe traité par AgNps à 10 mg vue dorsale (A, B).

Parmi les chiots du groupe 8 traités par AgNps à 15 mg, on a observé une absence de vertèbres cervicales avec absence de 12e côte et le reste des vertèbres a été observé une apophyse épineuse non développée, une fente métatarsienne est également observée sur la vue dorsale du pied de l’un des fœtus, un os de la hanche non ossifié sur la vue ventrale avec absence de fibrose du segment & est également observé, un os temporal non osseux qui se trouve fibrosé sur la vue latérale du crâne, une absence de segment proximal de l’os innominé, une anomalie de la colonne vertébrale a été observée avec une 6e et 9e côte et l’absence de 10e, 11e et 12e est observée des côtes chez l’un des fœtus, un os pariétal non osseux ont également été observés, une anencéphalie avec vertèbres de scoliose a été observée en L1-L5 chez l’un des fœtus, un os de la hanche non ossifié a été vu, des omoplates non ossifiées des deux côtés ont été vues sur la vue dorsale de l’un des fœtus, L’absence de cartilage a été observée de la 6e à la 12e côte chez l’un des fœtus. Le pourcentage de dysmorphologie squelettique calculé dans ce groupe était de 60% (figure 4).

Figure 4 Coloration d’Alizarine du fœtus du groupe traité par AgNps à 15 mg vue dorsale (A, B) et vue ventrale (C)

Le 20mg/kg m.c. Les fœtus du groupe traités par AgNps présentaient le pourcentage le plus élevé de dysmorphologie squelettique (76 %). Une scoliose a été observée dans la région lombaire de l’un des fœtus, un fœtus a présenté un os occipital non osseux, des omoplates et des os de la hanche non osseux, une grande fibrose est observée dans les os maxillaires, frontaux et pariétaux, la même est également observée dans le deuxième au sixième segment du sternum., une fente est observée dans l’articulation de la cheville, un espace accru est observé entre la 1ère et la 2ème côte et les 5ème à 8ème côtes du côté gauche de l’un des fœtus, une fente est également observée dans l’articulation symphisis pubienne de l’un des fœtus, une hypoplasie mandibulaire non ossifiée, une absence de processus épineux avec des côtes ondulées est également observée, chez un fœtus, nous avons observé une fusion complète des 2ème à 8ème vertèbres cervicales qui est clairement différenciée du reste de la 1ère vertèbre cervicale. Nous avons également observé une scoliose légère et un os occipital et pariétal non osseux et une absence d’omoplates sur le côté droit de l’un des fœtus, des vertèbres hypo-plastiques sont également observées (Figure 5).

Figure 5 Tache d’alizarine du fœtus du groupe traité par AgNps à 20 mg vue dorsale.