Base de connaissances Alpha CETSA

• CETSA®
• Types de cibles / échantillons
• Conditions d’analyse CETSA®
• Immunoessais Alpha CETSA®
• Analyse et interprétation des données CETSA®

Avertissement: À usage de recherche uniquement. CETSA® est une marque déposée de Pelago Bioscience AB. Veuillez noter qu’un abonnement CETSA® valide est requis pour l’utilisation du kit.

La méthode CETSA® elle-même

Q : Qu’est-ce que CETSA® ?

A : Le Test de déplacement thermique cellulaire est une méthode qui permet de quantifier l’Engagement cible (TE) d’un composé au sein de cellules vivantes ou dans des cellules perturbées. Le principe du test CETSA® est basé sur le changement du profil de dénaturation thermique de la protéine cible qui se produit suite à la liaison d’un composé. Le test CETSA® est réalisé en incubant les cellules avec le composé à tester, puis en chauffant les cellules traitées par le composé, puis en mesurant la protéine cible soluble restante.

Q: Qu’est-ce que le décalage thermique

A: Lors du chauffage, une protéine rencontrera une température à laquelle elle se dénature (parfois appelée point de fusion). Cette température de fusion est une propriété physique et une constante pour un ensemble donné de conditions (pH, pression, sels). Les composés qui interagissent avec une protéine modifieront la température de fusion (décalage thermique). Pour un site de liaison donné au sein d’une protéine, la taille du déplacement thermique peut être mesurée à différentes concentrations de composés (dose-réponse), et les valeurs CE50 dérivées de telles courbes peuvent être utilisées pour établir un ordre de puissance de rang d’une série de composés, qui est directement corrélé à l’ordre de rang d’affinité des composés. Il existe plusieurs variantes du test de déplacement thermique in vitro, mais la technique clé a été décrite pour la première fois par Semisotnov et al. (1991). Dans cette méthode, la protéine de fusion et de dépliage expose des surfaces hydrophobes qui permettent à SYPRO orange de se lier. La fluorescence de ces colorants est trempée dans l’eau, de sorte que la liaison à ces surfaces hydrophobes inverse cela et provoque un pic de fluorescence lorsque la protéine est complètement dépliée. Ce type de test de déplacement thermique ne peut être appliqué qu’aux protéines hautement purifiées et pour les espèces à faible abondance, cela peut signifier qu’un système de surexpression est nécessaire pour générer des quantités suffisantes.

Thermofluor – système de teinture sensible à la température (utilisant Sypro Orange)

Fluorimétrie à balayage différentiel (DSF) – méthodes alternatives à base de colorants

Systèmes de PCR quantitative (par exemple, Cycler léger Roche) : ceux–ci sont utilisés pour fournir l’événement de chauffage et peuvent mesurer les changements de fluorescence

Nanotemper – est un instrument dédié à la fabrication de l’entreprise qui chauffe l’échantillon et mesure la fluorescence. Il offre de meilleures performances que les systèmes PCR adaptés.

Q : Pourquoi la mesure de l’engagement des cibles Est-Elle importante?

R: En l’absence de confirmation qu’un composé interagit effectivement avec la cible souhaitée, les développeurs de médicaments peuvent perdre un temps et des ressources précieux en se déplaçant dans la mauvaise direction. Pour cette raison, la confirmation de l’engagement cible d’un composé a longtemps été considérée comme essentielle dans la découverte de médicaments. De tels tests permettent de faire des comparaisons directes de l’affinité d’un composé pour sa cible, en tant que telle, il s’agit d’une mesure essentielle pour sélectionner les composés à progresser à toutes les étapes de la génération et de l’optimisation de leads. Parce que l’engagement de la cible peut être corrélé à l’affinité, il permet aux chercheurs de sélectionner des composés qui ont les valeurs d’affinité les plus élevées. En tant que telle, il s’agit d’une mesure extrêmement utile pour assurer la hiérarchisation correcte des composés à chaque étape du processus de découverte du médicament.

Q : En quoi le CETSA® diffère-t-il des autres technologies d’analyse par déplacement thermique ?

R: Outre le CETSA ®, il existe de nombreuses méthodes pour évaluer l’Engagement de la cible (par exemple, Résonance Plasmonique de Surface, Polarisation de Fluorescence et Déplacement Thermique). Cependant, toutes ces méthodes reposent sur la disponibilité de protéines purifiées et ne peuvent être appliquées qu’in vitro, ce qui signifie que les valeurs d’affinité dérivées peuvent ne pas être prédictives de l’affinité réelle ou du potentiel de liaison dans les cellules vivantes. Être capable d’effectuer des tests de déplacement thermique dans un contexte cellulaire pertinent, où la protéine se trouve dans son environnement natif, en présence de ses protéines partenaires naturelles, avec des concentrations physiologiques de ses cofacteurs et substrats, donne des données beaucoup plus pertinentes, qui se traduiront mieux en modèles animaux et essais cliniques.

Bien que le Test de décalage Thermique cellulaire soit une méthode basée sur le même principe biophysique que les tests de décalage thermique standard (c’est-à-dire que des protéines spécifiques vont se dénaturer à une température définie), il ne mesure pas directement la température spécifique de déploiement, mais repose plutôt sur le fait que la présence d’un composé sur la protéine affectera la quantité de protéines solubles présentes après chauffage à une température définie. En tant que tel, le CETSA® est essentiellement un test de protéines totales effectué après un événement de chauffage spécifique. Les composés avec des puissances d’engagement cibles différentes modifieront les quantités relatives de protéines survivant à l’événement de chauffage. Parce que le test mesure cette protéine résiduelle, plutôt que l’événement de fusion réel, il peut être appliqué à des systèmes in vivo plus complexes tels que les cellules et les lysats (et dans certains formats CETSA® même des tissus solides). De plus, CETSA® peut identifier des composés qui déstabilisent une protéine (c’est-à-dire réduisent sa température de fusion), ce qui est moins simple avec les autres méthodes de déplacement thermique.

Q: En quoi Alpha CETSA® diffère-t-il des autres technologies de test de déplacement Thermique cellulaire ou d’autres Tests d’Engagement de Cibles cellulaires?

A: Comme mentionné ci-dessus, le CETSA® est essentiellement un test de protéines totales effectué après choc thermique. Alpha CETSA® utilise un système de détection de proximité à double anticorps. D’autres méthodes évitent l’utilisation d’un système à base d’anticorps en modifiant la protéine cible:

• Test de déplacement thermique de la nanoluciférase Promega (NaLTSA): Nanoluc Luciférase Fusionnée à la protéine cible (protéine exprimée de manière recombinante); Lorsque la cible protéique avec l’étiquette enzymatique Nanoluc s’agrège, le signal de luciférase diminue.
• Essai d’engagement de cible de NanoBRET de Promega: Étiquette de fusion de Luciférase combinée à des composés traceurs marqués qui, lorsqu’ils sont à proximité de la luciférase, conduiront à un Transfert d’Énergie par résonance de Bioluminescence (BRET). La liaison composée dans la même poche déplacera le traceur et le signal de BRET diminuera. Ce n’est pas une méthode de choc thermique.
• DiscoverX Incell Pulse: Basé sur la technologie de Complémentation de fragments enzymatiques (EFC) : la protéine cible est fusionnée avec un petit fragment donneur d’enzyme de β-galactosidase (β-gal). Une protéine rapporteuse ajoutée se liera à ce fragment pour reconstituer une enzyme active, qui hydrolysera un substrat et générera un signal chimioluminescent permettant la quantification de l’abondance des protéines. Après dénaturation à la chaleur, la protéine va s’agréger et limiter l’accès du composant luciférase plus gros à son partenaire sur la cible protéique.

La principale différence entre ces systèmes “CETSA® recombinant” ou “engagement cible recombinant” et Alpha CETSA®, est qu’ils ne peuvent pas être appliqués à des cellules natives et non modifiées. Cela a un certain nombre de conséquences négatives:

1. Bien que le coût de développement d’une nouvelle paire d’anticorps et les coûts subséquents par puits puissent être plus élevés que la simple transfection d’une seule lignée cellulaire, il est probable que tout programme de découverte voudra être testé avec une variété de lignées cellulaires modèles, chaque transfection a ses propres coûts et le clonage des lignées cellulaires suivantes prendra des semaines supplémentaires.
2. La génération d’une protéine marquée aura toujours des conséquences physiologiques sur la cellule et la protéine marquée peut être (i) surexprimée (mauvaise stoechiométrie vs. partenaires), (ii) ne se trouvant pas dans le bon compartiment cellulaire ou (iii) n’étant pas associé à des protéines partenaires clés et (iv) pouvant avoir un comportement de fusion différent de celui de la protéine native. Ce qui signifie que l’effet apparent d’un composé peut ne pas refléter son comportement réel dans les tissus du patient. Ces problèmes peuvent être amplifiés dans tout système de transfection temporaire.
3. Les inhibiteurs de la luciférase peuvent entraîner des résultats faussement positifs.
4. Dans les étapes ultérieures de l’optimisation du plomb, lorsque des modèles cellulaires plus complexes et physiologiquement plus pertinents (lignées cellulaires primaires, natives et tissus) sont nécessaires, les approches des protéines marquées ne sont tout simplement pas applicables.

Q : Quelles informations un test CETSA® fournit-il?

R: Le CETSA® fournit une mesure unique de la présence d’un composé sur la cible et peut être considéré comme une occupation cible. Cette occupation sera affectée à la fois par la capacité des composés à engager la cible et par la capacité du composé à être présent au bon endroit (i.e. a-t-il la bonne solubilité, perméabilité, stabilité métabolique et disponibilité au bon compartiment cellulaire). Les tests d’engagement de cibles non cellulaires offrent des mesures d’affinité qui ne sont corrélées qu’avec le comportement de la protéine dans des environnements hautement artificiels, souvent en utilisant des protéines cibles exprimées de manière recombinante purifiées.

Q : Le CETSA® peut-il être utilisé pour des études d’analyse SAR?

R: Il n’y a pas encore d’exemples publiés où CETSA® a été utilisé pour l’optimisation des composés. Cependant, Shaw et coll. ont clairement démontré le potentiel et l’applicabilité du CETSA® pour l’analyse du R-S et la confirmation de l’impact. par la comparaison des données de l’essai CETSA® avec des données d’essais biochimiques et cellulaires couramment utilisées (Shaw et al. 2018 SLA Discovery 1-12 DOI: 10.1177/ 2472555218813332). La publication démontre la valeur ajoutée de CETSA® pour le criblage, la confirmation du hit et la génération de DAS pour deux cibles protéiques : B-Raf et PARP1.

Types de cibles/échantillons

Q: Combien de cibles ont été validées dans CETSA® jusqu’à présent ?

A: Dans CETSA® HT (la plupart étant Alpha CETSA®, certains utilisant HTRF), plus de 30 cibles ont été validées avec succès, y compris des cibles avec localisation nucléaire, mitochondriale, cytoplasmique et de la membrane plasmique.

Plus de 100 cibles ont été validées à ce jour dans CETSA® Classic (détection basée sur le Western Blot).

CETSA® M/S génère des informations pour 6000 à 7000 cibles à la fois.

Q : Toutes les protéines cibles peuvent-elles être testées dans CETSA® ?

R : Certaines cibles sont ” aveugles ” dans CETSA®, c’est-à-dire la liaison des composés ne modifiera pas leur stabilité thermique. Cela peut se produire lorsque la protéine a plusieurs domaines et que le composé se lie à un seul domaine, et si la stabilisation de ce domaine unique n’a pas d’impact global sur la stabilité thermique de la protéine entière. Il y a quelques protéines qui ne fondent pas dans la plage de température typique appliquée dans les expériences CETSA®.

Pelago a accès à une grande base de données contenant des données de stabilité thermique provenant de projets avec lecture spectrométrique de masse (CETSA® MS), et ces informations sont prises en compte lorsque Pelago évalue la “bilité CETSA®” d’une cible protéique avant de développer un test Alpha CETSA®. Veuillez contacter Pelago pour demander ces informations.

Q : Les RCPG sont-ils compatibles avec le CETSA®?

R : Quelques exemples de RCPG ont été testés dans le CETSA®. Dans une publication récente d’Astra Zeneca (Kawatkar et al Chem Biology 2019), des tests CETSA® Classics ont été établis pour un ensemble de protéines liées à la membrane, y compris une cible protéique GPCR. Un défi potentiel avec CETSA® sur les RCPG peut être la disponibilité limitée d’anticorps pour la détection. De plus, la localisation membranaire intégrale des GPRC peut conduire à un comportement de fusion imprévisible.

Q: Quel type d’échantillons peut être testé dans CETSA®?

A : Il existe des exemples de tests CETSA® utilisant de nombreux types de matrices, y compris des lignées cellulaires immortalisées, des cellules primaires, des cellules iPS, des PBMC dérivés du patient, des sphéroïdes, des fractions nucléaires de cellules cultivées, des tissus traités ex vivo, des tissus d’études animales in vivo, des bactéries, des levures, des poissons zèbres et des insectes.

Q: Les échantillons peuvent-ils être congelés après l’étape de chauffage?

R: C’est possible, mais cela nécessite une validation au cas par cas car le processus de congélation peut dénaturer certaines protéines.

Q: Mes cellules ont besoin d’un revêtement de plaque de culture avec certaines protéines (p. ex. collagène ou Matrigel); faut-il prendre des précautions particulières pour éviter la préparation des échantillons?

R: Nous n’avons rencontré aucun problème avec les cellules cultivées sur plaques enrobées.

Conditions d’analyse CETSA®

Q : Quels sont les points d’optimisation d’analyse Alpha CETSA® typiques?

R: Si vous partez de zéro, l’immunodosage doit d’abord être développé et optimisé. Il est important et intéressant d’investir dans le développement d’un test Alpha très sensible, car il permettra de réduire le nombre de cellules par puits nécessaire au test CETSA®. Étant donné que le test CETSA® détruit une partie de la protéine qui doit être détectée, il faut généralement plus de cellules / puits dans un test CETSA® par rapport à d’autres tests à base de cellules. Veuillez vous référer aux guides de PerkinElmer pour le développement du test alpha pour savoir comment procéder et pour des conseils utiles, ainsi qu’aux manuels de la boîte à outils CETSA® si vous utilisez l’approche toolbox (anti mouse Ig X anti rabbit Ig beads).

Les points d’optimisation du test CETSA® comprennent:

• Titrage de la densité cellulaire
• Sélection du tampon de lyse cellulaire
• Temps d’incubation des cellules avec le composé à tester
• Température pour l’incubation des cellules avec le composé à tester
• Établissement des courbes de fusion et de déplacement
• Sélection de la température pour les expériences dose-réponse isothermes
• Paramètres de flux de travail et d’automatisation

Q: Pourquoi différents tampons de lyse cellulaire CETSA® sont-ils fournis et quel est l’impact de l’utilisation de différents tampons de lyse cellulaire?

A: Le tampon de lyse est important pour plusieurs aspects du dosage. Son rôle est multiple : lyser les cellules et libérer potentiellement la protéine cible des protéines partenaires susceptibles d’interférer avec la reconnaissance des anticorps, afin de rendre la cible disponible pour la détection par les anticorps; stabiliser la protéine cible pour rendre le test stable; éviter ou minimiser l’effet potentiel d’épiturbance; fournir les bonnes conditions physico-chimiques (pH, force ionique et nature des sels, type et concentration de détergent, …) pour l’immunoessai, As Comme différents immunoessai peuvent avoir des conditions optimales différentes, et comme différentes cibles protéiques, et différents types de cellules peuvent avoir des exigences différentes pour des performances optimales d’analyse, nous mettons à disposition 5 tampons de lyse cellulaire différents. Ceux-ci fournissent une variété de conditions de lyse cellulaire. Cependant, cela n’implique pas que des composants supplémentaires puissent être ajoutés dans des cas spécifiques, comme des types de détergents supplémentaires, pour améliorer encore les performances du test.

Q: Y a-t-il des inhibiteurs de protéase dans les tampons de lyse cellulaire CETSA®?

A : Les tampons de lyse cellulaire CETSA® 1, 4 et 5 contiennent des chélateurs de cations divalents, qui sont censés inhiber les protéases nécessitant de tels cations divalents pour leur activité (Métalloprotéinases matricielles par example). En outre, aucun autre inhibiteur de protéase n’est inclus dans les tampons de lyse cellulaire CETSA® car ceux-ci ne sont généralement pas nécessaires à la réalisation des tests Alpha CETSA®. Cependant, pour des types de cellules ou des échantillons de tissus spécifiques, vous pouvez ajouter des inhibiteurs typiques de la protéinase, tels que la leupeptine.

Q: Quelles sont les températures de fusion typiques?

A : La température de fusion (Tm) est définie comme la température à laquelle la moitié de la population protéique cible a été dénaturée (c’est-à-dire dans Alpha CETSA® à laquelle la moitié du signal Alpha a été perdue). Selon la cible, les températures de fusion sont le plus souvent comprises entre 40 ° C et 60 ° C, avec une température de fusion moyenne de 52 ° C. Certaines protéines, comme les protéines associées à la membrane, sont généralement plus stables et peuvent avoir une température de fusion plus élevée. Les données du test CETSA® pour des protéines ayant une température de fusion supérieure à 65 ° C peuvent être affectées par le fait que la perméabilité membranaire et l’intégrité cellulaire sont perturbées lorsque les cellules sont chauffées, ce qui a un impact sur la signification physiologique du test.

Selon notre expérience, la température de fusion est spécifique à la cible et dépend de la matrice de dosage et du tampon de lyse utilisé.

Q: La Mt devrait-elle être la même lorsque l’on travaille avec des cellules intactes et des cellules perturbées?

R: Pas nécessairement, comme lors de la perturbation des cellules, les interactions protéine-protéine qui stabilisent les protéines peuvent être perdues, ce qui peut entraîner une modification de la température de fusion par rapport aux cellules intactes. Pour un exemple, reportez-vous aux données du test Alpha CETSA® MEK1.

Q: Quelle température de chauffage dois-je sélectionner pour les tests composés?

A: Pour les composés stabilisants, il est recommandé de sélectionner la température la plus basse avec la fenêtre de dosage la plus grande, car elle devrait donner le dosage le plus sensible (valeurs CE50 inférieures). Pour les composés déstabilisants, il est recommandé de sélectionner la température la plus élevée avec la plus grande fenêtre de dosage. Des températures supérieures à 65 ° C peuvent avoir un impact sur la perméabilité cellulaire et réduire l’importance des données.

Q: Dois-je m’attendre à la même température de fusion dans CETSA® Classic (Western Blot) et Alpha CETSA®?

A: Pas nécessairement: la température de fusion apparente peut varier entre les deux méthodes, car les méthodes de détection sont différentes.

Q: Est-il important d’avoir un contrôle strict des temps de chauffage des échantillons?

R: Oui, cela est extrêmement important à contrôler car des temps de chauffage plus longs peuvent entraîner un décalage vers la droite de la courbe dose-réponse (voir ci-dessous les commentaires sur le temps de séjour). Le temps de chauffage standard est de 3 minutes.

Composés avec un temps de séjour court (c’est-à-dire une constante de vitesse de dissociation élevée koff; le temps de séjour T étant égal à 1/koff) va se dissocier plus rapidement de la cible lorsqu’elle est chauffée, par rapport aux composés ayant un temps de séjour long. Pour cette raison, la valeur CE50 ou ITDRF50 devrait augmenter avec l’augmentation des temps de chauffage. Pour plus d’explications sur la théorie CETSA®, voir Seashore-Ludlow B, Axelsson H, Almqvist H, Dahlgren B, Jonsson M, Lundbäck T. (2018) Interprétation quantitative de la Liaison et de la Cinétique Intracellulaires des Médicaments À l’aide du Test de déplacement Thermique cellulaire. Biochimie 57:6715-6725. https://dx.doi.org/10.1021/acs.biochem.8b01057. En théorie, la détection de différents temps de séjour de composés sur la cible, en variant le temps de chauffage, pourrait être possible mais il n’existe pas encore de rapports publiés à ce sujet.

Q: Le manuel indique de refroidir sur de la glace ou pendant 3 min à 25°C après le choc thermique. Cette étape de refroidissement est-elle importante et est-il important d’avoir un contrôle strict du temps de refroidissement?

A: Le refroidissement rapide de l’échantillon garantit que la phase de choc thermique est bien contrôlée. Le simple fait de permettre aux températures de se refroidir sans aide produirait certainement des vitesses de refroidissement différentes dans différents puits et affecterait la quantité de choc thermique fournie au système. La phase de refroidissement n’est pas aussi critique que la phase de chauffage, mais doit être conduite rapidement et de manière cohérente.

Q: Puis-je utiliser les kits ” Biomarqueur ” et “infaillible” de PerkinElmer (non CETSA®) pour effectuer un dosage CETSA®?

R: En théorie, tout dosage de protéines totales peut convenir à un protocole CETSA®, bien que chaque système doive être optimisé et validé. Cependant, la méthode CETSA® est brevetée et l’autorisation de Pelago Bioscience sera nécessaire. De plus, seule l’utilisation des kits cibles désignés est prise en charge par PerkinElmer. L’utilisation de la boîte à outils est prise en charge par Pelago Bioscience et n’est disponible que pour les titulaires de licence.

Q : Est-il possible de lire le signal Alpha directement à partir de la plaque PCR utilisée pour chauffer les échantillons?

D: Cela offrirait des avantages en termes de nombre d’étapes de pipetage, de consommation d’échantillons et de facilité d’automatisation, mais la possibilité d’utiliser des plaques PCR pour l’ensemble du processus – du traitement de l’échantillon à la détection – n’est pas encore démontrée. Les plaques PCR sont souvent très flexibles, ce qui conduit à un signal non uniforme sur la plaque, ou n’ont pas les bonnes dimensions pour leur permettre d’être manipulées par des lecteurs de plaques. La conversation croisée de puits à puits peut également être un problème dans de telles plaques PCR.

Q: La dénaturation chimique (par exemple en utilisant de l’urée ou de la guanidine) peut-elle être utilisée à la place de la chaleur?

A: L’avantage de l’utilisation de la température pour délivrer le choc thermique est qu’il est effectué de manière hautement contrôlée qui est susceptible d’être constante entre les échantillons et limitée sur une période de temps bien contrôlée. Un processus de dénaturation chimique peut fonctionner dans un extrait de protéine purifié; mais dans l’environnement cellulaire complexe, la variation du volume cellulaire, la capacité de mise en mémoire tampon, la teneur en lipides, etc., sont susceptibles de signifier que différentes lignées cellulaires présentent des caractéristiques de dénaturation différentes pour une protéine donnée.

Comme la dénaturation (temps de chauffage) est critique, cela peut être assez difficile à contrôler si vous utilisez une dénaturation chimique. De plus, la chaleur peut être appliquée sans perturber les cellules, ce qui permet de tester en contexte cellulaire réel. Ce ne serait pas le cas de la dénaturation chimique, car les cellules devraient être perturbées pour permettre l’accès de la cible à l’agent dénaturant, perdant ainsi les concentrations intracellulaires, les associations protéiques, etc.. Par conséquent, nous ne recommandons pas de remplacer le choc thermique par une dénaturation chimique.

Immunoessai Alpha CETSA®

Q: Lors du développement d’un dosage CETSA®, ai-je besoin d’anticorps monoclonaux ou peut-on également utiliser des anticorps polyclonaux?

A : Des anticorps monoclonaux ou polyclonaux peuvent être utilisés, en fonction bien entendu de la qualité des anticorps. Les anticorps monoclonaux présentent un avantage en termes d’apport de réactif stable, comme pour toute autre méthode de détection utilisant des anticorps.

Q: Lors de l’utilisation d’anticorps polyclonaux, le lot suivant fonctionnera-t-il de la même manière dans un test CETSA®?

A: Dans notre expérience, nous n’avons jamais été confrontés à une situation où le lot suivant d’un anticorps polyclonal se comportait différemment dans le test CETSA® par rapport aux lots précédents. Cependant, le test CETSA® doit être re-validé avec le lot suivant de l’anticorps polyclonal.

Q: Existe-t-il d’autres recommandations pour la sélection des anticorps?

R: Si disponible, les anticorps doivent être sélectionnés de manière à couvrir différents épitopes de la protéine cible, afin de maximiser les chances de trouver une paire d’anticorps appropriée qui fonctionnera dans le test Alpha CETSA®.

Les paires d’anticorps donnant des courbes plus raides (pente de colline plus élevée) et moins de fond sont préférées car elles fournissent généralement un signal plus spécifique. Une faible pente peut être le signe de la capacité d’une paire d’anticorps à reconnaître la protéine repliée.

Q: Les anticorps Alpha CETSA® sont-ils uniquement dirigés contre la protéine cible endogène ou la protéine cible endogène plus une petite molécule liée?

R: Sur la base des kits développés jusqu’à présent, les anticorps sont uniquement dirigés contre la cible protéique.

Q: Puis-je m’attendre à ce que les affinités des anticorps de détection soient différentes entre la petite molécule liée et non liée à la protéine cible?

A: Les petites molécules influençant le repliement des protéines au niveau des sites d’épitope risquent en effet de modifier la liaison des anticorps. Ce phénomène est appelé “épiturbance” et peut être une limitation à base d’anticorps – CETSA®. L’épiturbance n’est en général pas observée dans le format de test CETSA® Classic (Western Blot) car dans ce cas la protéine est entièrement dénaturée avant l’étape de détection des anticorps.

Q : Les IgG peuvent-elles uniquement être utilisées avec les kits CETSA® toolbox ?

A: En effet, les anticorps sur les billes anti-lapin et anti-souris sont spécifiques des IgG, et ne reconnaîtraient pas d’autres classes d’anticorps (i.e. IgA, IgM, etc. ne doivent pas être sélectionnés).

Q : Y a-t-il un avantage à utiliser Alpha CETSA® par rapport au CETSA® Classic (Western Blot)?

A: Outre une plus grande sensibilité du test Alpha CETSA® et des considérations de débit et d’automatisation, en raison de la difficulté possible d’analyser les protéines membranaires dans la méthode CETSA® Classic, Alpha CETSA® peut être plus performant pour de telles cibles, car il ne nécessite aucune étape de séparation.

Analyse et interprétation des données CETSA®

Q: Quels résultats faussement positifs peuvent être obtenus dans CETSA®?

R: La stabilité thermique de certaines protéines peut être affectée après le traitement du composé, même si elles ne sont pas directement liées par le composé à tester. Ces effets indirects peuvent résulter par example d’une phosphorylation protéique, d’un recrutement protéique par une protéine partenaire, ou d’un changement général de l’état Redox de la cellule. L’exécution du test CETSA® en parallèle sur des cellules intactes et sur des cellules perturbées peut discriminer les effets directs et indirects, car de tels effets indirects ne sont pas attendus lorsque les cellules sont perturbées et que les processus métaboliques sont arrêtés.

L’interéférence du dosage des composés peut être rencontrée dans Alpha CETSA® car les composés sont présents à l’étape de détection à une concentration relativement élevée. Cela peut donner des résultats trompeurs et il est important d’effectuer un contre-écran pour identifier ces composés.

Q : Comment interpréter la déstabilisation ciblée ?

A: La déstabilisation peut résulter de la perturbation par la liaison composée d’un complexe protéique qui stabilisait la protéine cible. D’après notre expérience, les protéines membranaires ont généralement une température de fusion plus élevée et sont plutôt déstabilisées que stabilisées par la liaison aux composés. Pour les kinases, cela pourrait aussi bien résulter du déplacement de l’ATP. Dans ce cas, il peut être utile de comparer le résultat des tests CETSA® effectués sur des cellules intactes (concentrations physiologiques d’ATP) et des cellules perturbées (perte d’ATP). Pour certaines cibles (voir le manuel du kit ErbB2 Alpha CETSA®), nous avons observé que des inhibiteurs irréversibles déstabilisaient la cible tandis qu’un inhibiteur réversible stabilisait la cible.

Q: Existe-t-il un moyen d’éviter l’effet d’épiturbance?

R: L’ajout d’une petite quantité de détergent, comme 0,01% de SDS, peut empêcher le phénomène d’épiturbance. Une explication pourrait être que le SDS donne accès à l’anticorps même en présence du composé. Certains tampons de lyse cellulaire CETSA® contiennent une petite quantité de SDS et peuvent donc éviter l’épiturbance par rapport aux autres tampons de lyse. Nous ne pouvons exclure qu’il faille ajouter d’autres FDS dans certains cas.

Il est à noter qu’un tel effet d’épiturbance n’est pas limité aux dosages CETSA®, mais peut également être rencontré dans tout dosage immunologique.

Q : Contre-écran / Comment vérifier si mon hit CETSA® est un faux positif ?

A : Dans le CETSA®, il existe une méthode simple permettant de déterminer si le composé agit sur la protéine cible (dé)de stabilisation elle-même, ou interfère avec la méthode de détection: une comparaison peut être faite entre (1) l’addition des composés aux cellules, puis l’incubation et le traitement thermique et (2) le chauffage des cellules en premier et l’ajout du composé seulement après. Si l’activité du composé n’est trouvée que dans le test 1, alors elle est vraiment active sur la cible. Si l’activité du composé se trouve dans 1 et 2, cela montre qu’elle interfère d’une manière ou d’une autre avec la technologie de détection (reportez-vous au guide d’interaction Protéine-protéine de PerkinElmer pour une liste des interférences alpha potentielles).

Q : Quels résultats faussement négatifs peuvent être obtenus dans CETSA® ?

A: Si un composé n’atteint pas la cible dans un contexte cellulaire, il peut apparaître comme positif dans les tests biochimiques, et être toujours négatif dans CETSA®. Il ne s’agit pas d’un faux négatif, mais simplement du fait que le composé n’est pas capable d’accéder à la cible dans des conditions cellulaires réelles, ce qui fait partie de la puissance de la méthode.

Q: Comment les valeurs de CETSA® se comparent-elles aux tests fonctionnels / y a-t-il une signification de l’amplitude du thermochift?

A: Lors de l’analyse des données CETSA®, il faut garder à l’esprit que le principe du test est très différent des tests fonctionnels typiques, tels que la phosphorylation des protéines, les concentrations d’ions, l’AMPc et d’autres marqueurs de transduction du signal, ou l’analyse phénotypique dans le criblage à haute teneur, et donc les données doivent être interprétées en conséquence.

L’amplitude du décalage thermique n’est PAS une mesure de l’affinité du composé.

Les valeurs CE50, ou ITDRF50, sont spécifiques à certaines conditions de dosage (température, temps de chauffage, time). Ceci n’est pas différent des tests fonctionnels, où les valeurs CE50 sont par exemple spécifiques aux temps de stimulation.

Q : Est-il possible de discriminer les antagonistes par rapport aux agonistes dans les dosages CETSA® ?

R : Normalement, il ne s’agit pas d’une information extraite des dosages CETSA®, mais de la publication de Shaw et al. (2018) RAPPORTS scientifiques / (2018) 8:163 / DOI: 10.1038 / s41598-017-18650- x. rapports que seuls les agonistes étaient capables de stabiliser le récepteur des androgènes dans le test CETSA® développé, tandis que l’antagoniste n’avait aucun effet direct dans le test CETSA®, mais pouvait être détecté comme concurrent de l’effet des agonistes dans le test CETSA®. Par conséquent, dans ce cas particulier, le test CETSA® a pu discriminer les agonistes et les antagonistes des récepteurs aux androgènes. Cela n’implique pas que cela soit possible pour n’importe quelle cible, car il existe de nombreux exemples où le test CETSA® détecte directement à la fois des agonistes et des antagonistes.

Q: Le CETSA® peut-il être utilisé pour détecter la toxicité d’un composé?

A: Les composés exerçant un effet toxique sur une cellule devraient entraîner une modification du niveau de certaines protéines (via des effets de dégradation et / ou de transcription) et des modifications de la thermostabilité de certaines protéines (via des modifications post-traductionnelles ou un changement général de l’état Redox des cellules). Pelago étudie la possibilité de générer des “empreintes digitales CETSA®” qui pourraient être liées à différents types de toxicité, à partir des données CETSA® MS. Cela pourrait également générer des connaissances sur les cibles que les médicaments ne devraient pas atteindre pour éviter une telle toxicité. Si une cible spécifique semble liée à une toxicité, l’utilisation d’Alpha CETSA® peut devenir une méthode de choix pour l’industrie pharmaceutique.

Q: Une protéine d’entretien ménager peut-elle être utilisée pour la normalisation des dosages CETSA®?

A: La normalisation n’est généralement pas nécessaire dans les dosages CETSA®, car le résultat important de l’essai est la valeur CE50. Cependant, dans certains cas, par exemple lorsque l’on travaille avec des échantillons de tissus, la quantité de matière engagée par point de données peut varier de manière assez significative et une normalisation peut alors être souhaitée. Dans le CETSA® Classic (Western blot), le SOD1 est couramment utilisé car son point de fusion de 80 °C en fait une bonne référence invariable pour n’importe quelle cible, et comme son poids moléculaire de 18 kDa le rend facile à détecter sur les Western blots. Le GAPDH ne serait pas recommandé en raison de sa température de fusion plus basse (55 ° C), ce qui en fait un contrôle impossible pour les cibles ayant une température de fusion plus élevée.

Si vous souhaitez normaliser le test Alpha CETSA®, la cofiline pourrait être essayée (il existe un kit AlphaLISA SureFire ultra pour la cofiline totale, avec des données préliminaires CETSA® mais pas encore de kit entièrement validé)