Chloramphénicol acétyltransférase comme marqueur de sélection pour la transformation chlamydienne
pGFP::SW2, le vecteur navette construit par Wang et al, contenait un gène β-lactamase comme marqueur de sélection. Il porte également un gène de CHAT qui est fusionné au gène GFP. Nous avons constaté que E. coli transformé avec le plasmide pGFP::SW2 pouvait se développer dans un milieu contenant du chloramphénicol (concentration finale: 170 µg/ml), suggérant que le gène du CHAT peut également être utilisé comme marqueur de sélection pour des expériences de transformation de la chlamydia. Comme l’ont averti Wang et coll., un effet indésirable du chloramphénicol sur les mitochondries de l’hôte, comme l’ont démontré Li et al. peut affecter l’utilité de cet antibiotique pour la transformation de la chlamydia. Dans Li et coll.selon le rapport, la concentration toxique minimale de chloramphénicol était de 10 µg / ml, ce qui a entraîné une légère réduction de 20% de la production d’ATP. Nous avons déterminé que la concentration apparente de chloramphénicol la plus faible inhibait complètement la formation d’inclusion dans le C exempt de plasmide. la souche L2 de trachomatis désignée L2R n’était que de 0,05 µg/ml (données non présentées), ce qui était très inférieur aux concentrations toxiques pour les cellules hôtes. Par conséquent, nous avons estimé que cet antibiotique pouvait être utilisé pour sélectionner des transformants exprimant le CHAT sans stresser de manière significative les cellules hôtes.
Nous avons transformé L2R avec pGFP::SW2 et sélectionné la moitié des cellules transformées avec de l’ampicilline et l’autre moitié avec du chloramphénicol. Les antibiotiques (2 µg/ml d’ampicilline ou 0,1 µg/ml de chloramphénicol) ont été ajoutés aux cultures 10 h après transformation. À partir du passage 2, leurs concentrations ont été augmentées à 5 et 0,2 µg/ml, respectivement, et elles ont été ajoutées au moment de l’inoculation. Le rapport de division entre les passages est resté de 1:1 depuis le passage 1 jusqu’au passage 4. Même si la CMI du chloramphénicol, qui a été déterminée à une faible multiplicité d’infection (~ 0,1 unités formant une inclusion par cellule), était de 0,05 µg / ml, certaines des chlamydias non transformées devaient former des inclusions en présence de 0,1-0.2 µg / ml l’antibiotique, car nous avons utilisé un rapport EB / cellule élevé pour la transformation, et l’efficacité de l’inhibition de la croissance de la chlamydia par les antibiotiques est influencée par la multiplicité de l’infection. Avec le protocole de sélection décrit ci-dessus, dans des cultures sélectionnées avec de l’ampicilline, au microscope à contraste de phase, près de 100% des cellules ont été trouvées pour contenir une inclusion avec des RBs aberrants au passage initial. Les inclusions aberrantes contenant du RB étaient encore présentes dans une faible proportion de cellules au passage 2, mais ont été pour la plupart remplacées par des inclusions apparemment normales au passage 3. Des inclusions normales ont été trouvées dans environ 20% des cellules et des inclusions anormales ont rarement été observées au passage 4. Au passage 5, qui résulte d’une inoculation avec une récolte de 10% du passage 4, des inclusions ont été trouvées dans 80% des cellules; apparemment, aucune de ces inclusions ne contenait de RBs aberrant.
Étant donné que le chloramphénicol ne provoque pas la formation de chlamydiae de RBs aberrants, nous avons évalué la résistance à l’antibiotique en fonction de la taille d’inclusion. Des inclusions de tailles plus petites que la normale ont été détectées dans presque toutes les cellules au passage 1. Certaines inclusions, mais de très petite taille, ont été trouvées au passage 2, et la plupart de ces inclusions ont été remplacées par des inclusions de taille normale par le passage 3. Des inclusions de taille normale ont été trouvées dans plus de 20 % des cellules au passage 4. Au passage 5, obtenu après inoculation avec une récolte de 10% au passage 4, et une augmentation de la concentration en chloramphénicol (de 0,2 µg/ml à 0,5 µg/ml), des inclusions de taille normale ont été trouvées dans près de 100% des cellules 0000000.
En plus de la résistance apparente aux agents de sélection, nous avons utilisé l’expression de la GFP et la restauration de la synthèse du glycogène comme marqueurs supplémentaires pour une transformation réussie. Les EB récoltés dans le passage 5 ont été utilisés pour infecter les cellules de McCoy à un taux de dilution de 1:100 (équivalence du nombre de cellules) pour des expériences déterminant l’expression de la GFP et la synthèse du glycogène (Figure 2). Comme prévu, ni le C. trachomatis L2 (434/bu) de type sauvage (Figure 2A) ni le L2R sans plasmide non transformé (Figure 2B) n’ont exprimé de GFP. Conformément aux résultats établis selon lesquels la synthèse du glycogène dans C. trachomatis a besoin de son plasmide, la coloration iodée a montré que du glycogène s’est accumulé dans les inclusions de type sauvage L2 (Figure 2A) mais pas celles de L2R (Figure 2B). En présence de 5 µg / ml d’ampicilline, qui inhibe la division du RB, le L2R non transformé (Figure 2C) a formé des inclusions contenant du RBs géant sans produire de glycogène; tandis que le chloramphénicol (concentration finale: 0,5 µg / ml) a complètement inhibé la formation d’inclusions visibles dans les cellules infectées par le L2R (Figure 2D). En accord avec les données publiées par Wang et coll. , pGFP::Le L2R transformé par SW2 sélectionné avec de l’ampicilline a formé des inclusions GFP positives avec du glycogène (Figure 2E). pGFP:: Le L2R transformé en SW2 sélectionné avec du chloramphénicol a également formé des inclusions GFP positives contenant du glycogène (Figure 2F). Comme prévu, les transformants sélectionnés par l’ampicilline ont pu former des inclusions contenant du glycogène de taille normale, GFP-positives, en présence de chloramphénicol (Figure 2G); de même, les transformants sélectionnés par le chloramphénicol étaient complètement résistants à l’ampicilline, exprimaient la GFP et produisaient du glycogène (Figure 2H). Ces résultats suggèrent que le gène du CHAT dans le pGFP::Le plasmide SW2 est fonctionnel dans les chlamydieset la résistance au chloramphénicol peut être utilisée comme marqueur de sélection pour la transformation de la chlamydia.
Inclusion, expression de GFP et synthèse de glycogène de pGFP :: transformants SW2 de C. trachomatis L2. La souche 434/bu (A) non transformée, la souche L2R (B-D) exempte de plasmides non transformée et la L2R transformée sélectionnées avec soit de l’ampicilline (E, G), soit du chloramphénicol (F, H) ont été cultivées soit avec un milieu contenant un antibiotique indiqué, soit avec un milieu exempt d’antibiotiques. Des images d’inclusions dans des cultures non colorées et colorées à l’iode ont été acquises par microscopie à contraste de phase ou par microscopie à fluorescence 48 h après l’inoculation. Dans tous les panneaux, le contraste de phase et les images GFP sont superposables.
Nous avons ensuite retiré le gène β-lactamase du pGFP::plasmide SW2 tel que décrit dans la section “Méthodes”, et utilisé le plasmide pGFP-CAT:: SW2 résultant pour transformer L2R. Les chlamydies transformées ont été soumises à une sélection avec du chloramphénicol en utilisant le même schéma que décrit ci-dessus. Des inclusions résistantes au chloramphénicol sont apparues dans environ 20% des cellules infectées de la culture du passage 4. La microscopie à fluorescence et la coloration à l’iode ont révélé des inclusions positives à la GFP et au glycogène dans des cellules infectées par l’EBs récoltées dans le passage 5 et cultivées en présence de chloramphénicol (Figure 3, panneau supérieur). Cependant, en raison d’un manque de β-lactamase dans le plasmide pGFP-CAT:: SW2, les transformants n’ont pas pu former d’inclusions normales en présence d’ampicilline; au lieu de cela, leurs inclusions ont été remplies de RBs aberrants. Alors que les inclusions irrégulières étaient toujours positives pour la GFP, elles étaient en grande partie exemptes de glycogène (figure 3, panneau inférieur). Après le passage 5, les transformants pGFP-CAT::SW2 ont été cultivés avec 0,5 µg/ml de chloramphénicol pour quatre passages supplémentaires à un rapport de division de 1:100 pour chaque passage. Toutes les inclusions au passage 9 avaient la même apparence que les inclusions de chlamydiés remplis de plasmides et non celle du L2R exempt de plasmides, et toutes exprimaient la GFP (données non représentées). Ces résultats prouvent que le gène CAT du plasmide pGFP-CAT::SW2, similaire au plasmide pGFP::SW2, fonctionne comme marqueur de sélection pour la transformation de C. trachomatis.
Inclusion, expression de GFP et synthèse de glycogène dans le L2R transformé avec pGFP-CAT::SW2. Les cellules infectées par des transformants sélectionnés au chloramphénicol ont été exposées au chloramphénicol ou à l’ampicilline. Des images d’inclusions dans des cultures non colorées et colorées à l’iode ont été acquises par microscopie à contraste de phase ou par microscopie à fluorescence 48 h après l’inoculation. Le contraste de phase et les images GFP sont superposables.
Il convient de noter que Tam et al. a déjà tenté de développer un système de transformation avec le gène CAT comme marqueur sélectif. Dans cette étude, un vecteur navette contenant un gène CAT a été électroporé en EBs de C. trachomatis E (souche UW-5/CX) et L2 (souche 434/Bu). Bien que l’ARNm du CHAT et l’activité enzymatique aient été détectables dans les cultures initiales de chlamydiés transformés, les auteurs n’ont pas réussi à obtenir des transformants stables après sélection avec le chloramphénicol pendant 4 passages. Il est important de noter que les deux souches électroporées contiennent un plasmide natif qui partage la même origine de réplication avec le plasmide recombinant utilisé pour la transformation. Depuis Wang et al. ont pu obtenir des transformants stables résistants à la pénicilline uniquement à partir de L2R, un C exempt de plasmide. la variante de trachomatis L2, mais pas la 434/Bu de type sauvage, remplie de plasmides, dans des contextes expérimentaux par ailleurs identiques, il n’est rétrospectivement pas surprenant que Tam et al. impossible de dériver des chlamydies stables résistantes au chloramphénicol.
