Chymotrypsinogène A

C.A.S.: 9035-75-0

Réaction enzymatique (l’image s’ouvrira dans une nouvelle fenêtre)

La chymotrypsine est une endopeptidase sérine produite par les cellules acineuses du pancréas. La chymotrypsine devient activée après la protéolyse du chymotrypsinogène par la trypsine. Alors que la trypsine s’hydrolyse au niveau de la lysine et de l’arginine, la chymotrypsine clive sélectivement les liaisons peptidiques formées par les résidus aromatiques (tyrosine, phénylalanine et tryptophane) (Hedstrom et al. 1992). Deux formes prédominantes de chymotrypsine, A et B, se trouvent en quantités égales dans le pancréas des bovins. Ce sont des protéines très similaires (identiques à 80%), mais ayant des caractéristiques protéolytiques significativement différentes (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et coll. 1968, et Gráf et coll. 2004). Les informations ci-dessous concernent principalement la forme A de chymotrypsinogène et de chymotrypsine.

Histoire:

Au début des années 1900, Vernon a proposé que les préparations pancréatiques puissent donner naissance à un activateur intrinsèque de ses propres enzymes (Vernon 1901). Les expériences de coagulation du lait de Vernon ont déterminé qu’il y avait au moins deux enzymes présentes et que l’une était plus stable que l’autre (Vernon, 1902). Cependant, cette idée n’a été largement acceptée qu’en 1934, lorsque Kunitz et Northrop ont confirmé la présence d’une enzyme en plus de la trypsine, la nommant chymotrypsine. Ils ont pu cristalliser la chymotrypsine, ainsi que le précurseur inactif, le chymotrypsinogène (Kunitz et Northrop, 1934). En 1938, Kunitz a isolé différentes formes actives de chymotrypsine, les désignant comme alpha, bêta et gamma (Kunitz 1938).

Au début des années 1940, Fruton et Bergmann ont étudié plus avant la spécificité de la chymotrypsine, en rapportant plusieurs nouveaux substrats (Fruton et Bergmann, 1942). Jacobsen a rapidement identifié d’autres formes de chymotrypsine, les désignant comme delta et pi (Jacobsen 1947). En 1948, Schwert a encore caractérisé les poids moléculaires de la chymotrypsine et du chymotrypsinogène.

En 1954, Hartley et Kilby ont rapporté la première preuve du mécanisme en trois étapes de l’hydrolyse des substrats d’amide et d’ester par la chymotrypsine, qui ont émis l’hypothèse de la présence d’un intermédiaire enzymatique acylique, ce qui s’est avéré plus tard vrai (Henderson, 1970). En 1955, Laskowski a obtenu un deuxième chymotrypsinogène cristallin, le nommant chymotrypsinogène B. En 1964, Hartley a déterminé la séquence d’acides aminés de la chymotrypsine A, qui a ensuite été raffinée par Meloun et al. en 1966. En 1968, Smillie et coll. a déterminé la séquence d’acides aminés de la chymotrypsine B, qui a révélé une identité de séquence de 80% avec la chymotrypsine A. Tout au long des années 1970 et 1980, des recherches ont été menées pour mieux comprendre le mécanisme d’action et identifier les différences dans les séquences d’acides aminés entre la trypsine et la chymotrypsine (Steitz et al. 1969, Cohen et coll.1981, Asbóth et Polgár 1983, et Gráf et coll. 1988).

Dans les années 1990, la chymotrypsine a été purifiée à partir d’autres sources, notamment la morue franche (Ásgeirsson et Bjarnason, 1991) et le chameau (Al-Ajlan et Bailey, 1997). Des travaux ont également commencé sur l’étude des inhibiteurs (Baek et al. 1990), et Frigerio et al. élucidé la structure cristalline de la chymotrypsine bovine à une résolution de 2,0 Å (Frigerio et al. 1992).

Des recherches récentes ont étudié le repliement et la dénaturation de la chymotrypsine dans une gamme de concentrations (Ghaouar et al. 2010), l’interaction de la chymotrypsine avec des substrats de nanoparticules (You et al. 2006, et Jordan et coll. 2009), et l’augmentation de la stabilité de la chymotrypsine en se conjuguant aux molécules PEG (Castellanos et al. 2005, et Rodríguez-Martínez et coll. 2009).

Spécificité:

La chymotrypsine est activée par clivage de la liaison entre l’arginine et l’isoleucine (R15 et I16) par la trypsine, provoquant des modifications structurelles et la formation du site de liaison du substrat (Sears 2010). La chymotrypsine diffère de la trypsine en ce que la trypsine clive les peptides au niveau des résidus d’arginine et de lysine, tandis que la chymotrypsine préfère les gros résidus hydrophobes (Hedstrom et al. 1992). La chymotrypsine catalyse préférentiellement l’hydrolyse des liaisons peptidiques impliquant les isomères L de la tyrosine, de la phénylalanine et du tryptophane. Il agit également facilement sur les amides et les esters d’acides aminés sensibles. La spécificité de la chymotrypsine pour les résidus hydrophobes de grande taille peut s’expliquer par une liaison hydrophobe S1 formée par les résidus 189 à 195, 214 à 220 et 225 à 228 (Cohen et al. 1981).

Bien que la structure du site S1 de la trypsine et de la chymotrypsine ne présente qu’une seule différence (à la position 189), la mutagénèse dirigée de la trypsine et de la chymotrypsine n’a pas réussi à échanger des spécificités, ce qui suggère que le mécanisme par lequel la trypsine et la chymotrypsine réalisent une catalyse spécifique au substrat n’est pas entièrement compris (Steitz et al. 1969, et Gráf et coll. 1988).

Composition:

Les trois résidus d’acides aminés de la triade catalytique (H57, D102 et S195) sont essentiels au clivage des liaisons peptidiques et sont stabilisés par des liaisons hydrogène (Sears 2010, et Gráf et al. 2004). G193 et S195 constituent le trou d’oxyanion et interagissent avec le groupe carbonyle de la liaison peptidique scissile, l’orientant pour former l’intermédiaire tétraédrique (Rühlmann et al. 1973, Huber et Bode 1978, et Gráf et al. 2004).

Caractéristiques moléculaires :

La chymotrypsine A et B partagent 80% d’identité de séquence (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et coll. 1968, et Gráf et coll. 2004). Les acides aminés de la triade catalytique (H57, D102 et S195) sont fortement conservés dans les séquences des peptidases de la famille S1 (Gráf et al. 2004). La sérine en position 214 est également très conservée dans la famille et a été proposée comme quatrième membre de la triade catalytique (Ohara et al. 1989, et McGrath et coll. 1992).

Numéro d’accession aux protéines: P00766

Classification CATH (v. 3.3.0):

• Classe: Principalement Bêta
• Architecture: Baril bêta
• Topologie: Protéase sérine de type Trypsine

Poids moléculaire:

• 25.6 kDa (Wilcox 1970)

Ph optimal : 7,8-8,0 (Rick 1974)

Point isoélectrique:

• 8.52 (Chymotrypsinogen, Theoretical)
• 8.33 (Chymotrypsin, Theoretical)

Extinction Coefficient:

• 51,840 cm-1 M-1 (Theoretical)
• E1%,280 = 20.19 (Chymotrypsinogen, Theoretical)
• E1%,280 = 20.57 (Chymotrypsin, Theoretical)

Active Site Residues:

• Histidine (H57)
• Aspartate (D102)
• Serine (S195)

Activators:

• Cetyltributylammonium bromide (Spreti et al. 2008)
• Dodecyltrimethylammonium bromide (Abuin et al. 2005)
• Hexadecyltrimethylammonium bromide (Celej et al. 2004)
• Tetrabutylammonium bromide (Spreti et al. 2001)

Inhibitors:

• Hydroxymethylpyrroles (Abell and Nabbs 2001)
• Boronic acids (Smoum et al. 2003)
• Courmarin derivatives (Pochet et al. 2000)
• Peptidyl aldehydes (Lesner et al. 2009)
• Peptides from natural sources (Telang et al. 2009, Roussel et al. 2001, and Chopin et al. 2000)
• Peptides containing an unnatural amino acid (Legowska et al. 2009, and Wysocka et al. 2008)

Applications:

• Analyse de séquence
• Synthèse peptidique
• Cartographie peptidique
• Empreinte peptidique