Ciblage par anticorps de la claudine-1 en tant que thérapie potentielle du cancer colorectal

Échantillons CRC

Pour le profilage de l’expression génique, nous avons sélectionné 143 échantillons de tumeurs de 143 patients inclus dans trois cohortes: l’étude prospective monocentrique REGP (19 patients) (GSE62322), l’étude multicentrique rétrospective COSIVAL (19 patients), 68 patients) et l’étude multicentrique prospective BIOCOLON (56 patients) (GSE62080 et GSE72970). Pour ces trois études, les critères d’inclusion étaient les suivants: adénocarcinome du côlon prouvé histologiquement, tumeur avancée et mesurable bidimensionnellement (stade IV), âge entre 18 et 75 ans et état de performance ≤2 de l’Organisation mondiale de la Santé (OMS). Avant tout traitement, tous les patients ont subi une intervention chirurgicale pour résection tumorale primaire ou biopsie endoscopique.

Pour l’analyse par western blot, 13 échantillons de tumeurs supplémentaires provenant de l’étude prospective à un seul centre REGP mais non inclus dans les 143 échantillons ont été utilisés.

Pour l’analyse immunohistochimique, des échantillons de tissus de 52 patients supplémentaires atteints de CRC ont été sélectionnés rétrospectivement dans les fichiers de pathologie de l’Institut du Cancer de Montpellier uniquement lorsque des échantillons normaux de muqueuse, d’adénome et d’adénocarcinome étaient disponibles pour le même patient.

Toutes les études utilisant des échantillons de tissus humains ont été approuvées par les comités d’éthique compétents et tous les participants ont été informés des objectifs et des méthodes de l’étude et ont signé un consentement éclairé écrit avant l’inscription.

Analyse de l’expression génique

Des échantillons de côlon (échantillons de côlon normal, de tumeur primitive et de métastases hépatiques pour l’étude REG / P, mais uniquement des échantillons de tumeur primitive pour les essais COSIVAL et BIOCOLON) ont été prélevés au moment de la chirurgie suivant une procédure standardisée pour obtenir un ARN de haute qualité. Des échantillons ont ensuite été hybridés à des matrices du génome humain U133 plus 2.0 (Affymetrix Inc., Santa Clara, Californie).

Pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour la thérapie à base d’anticorps dans le CCRm, nous avons comparé les profils d’expression génique d’échantillons de tissus de muqueuse normale (n = 17), de tumeur primitive (n = 20) et de métastases hépatiques (n = 19).

Comme l’hétérogénéité du CRC doit être prise en compte lors de la comparaison des profils d’expression génique, les échantillons de tumeurs primaires (n = 143) ont été classés en utilisant les classifications moléculaires du CRC basées sur des profils d’expression génique proposés par trois groupes indépendants et la classification consensuelle récente. Brièvement, De Sousa E. Melo et al. il est proposé de regrouper les tumeurs en trois classes: CCS1 (CRC avec instabilité microsatellitaire, MSI), CCS2 (cancer avec instabilité chromosomique, CIN) et CCS3 (nouveau sous-type). Sadanandam et coll. cinq sous-types moléculaires ont été identifiés, en fonction du phénotype cellulaire: en forme de gobelet, Amplifiant le Transit (TA), Entérocytaire, en forme de tige et Inflammatoire. Marisa et coll. décrit six sous-types moléculaires (C1 à C6) avec les principales caractéristiques suivantes: C1 = CIN et régulation négative des voies immunitaires, C2 = MSI, C3 = KRAS mutés, C4 = phénotype de cellules souches, C5 = CIN et régulation positive des voies WNT, et C6 = CIN et profil d’expression génique de type normal. Enfin, à partir de six signatures précédemment publiées, un consortium international a présenté une classification avec quatre sous-types de consensus: MSI (CMS1), canonique (CMS2), métabolique (CMS3) et mésenchymateux (CMS4) (pour examen). La distribution de l’échantillon CRC selon le sous-type moléculaire est indiquée dans le fichier supplémentaire 1: Tableau S1.

Analyse immunohistochimique

Des échantillons ont été assemblés dans un micro-réseau tissulaire (TMA) à l’aide de trois noyaux tissulaires (de 0,6 mm de diamètre chacun) comme décrit précédemment. Brièvement, des sections de 3 µm de la TMA ont été dé-paraffinées et réhydratées dans des alcools gradués. La récupération de l’antigène induite par la chaleur a été réalisée en incubant des coupes de TMA dans du tampon EDTA (pH 9) à 98 ° C au bain-marie pendant 20 min. Après neutralisation de l’activité peroxydase endogène, des coupes TMA ont été incubées avec un anticorps polyclonal anti-CLDN1 (JAY-8, Zymed laboratories Inc, CA, USA) ou un diluant d’anticorps (Dako, Glostrup, Danemark) seul pendant 60 min. La liaison primaire des anticorps a été visualisée à l’aide du système Envision® et du Dako Autostainer® (Dako, Glostrup, Danemark). Le pourcentage de cellules CLDN1 positives et l’intensité de coloration (0, pas de coloration; 1, jaunâtre; 2, marron; et 3, brun foncé) ont été évalués pour chaque tache de TMA individuelle.

Analyse Western blot

Des échantillons de tissus tumoraux provenant de patients ont été broyés directement dans du tampon de lyse (150 mm NaCl, 10 mm Tris pH 7,4, 1 mm EDTA, 1 mm EGTA, 1% SDS, 1% Triton X-100, 0,5% NP-40, 2 mm PMSF, 100 mm NaF, 10 mm orthovanadate de sodium, un comprimé inhibiteur de la protéase cocktail pour 10 ml) utilisation d’une unité Mixer Mill® MM 300 (Qiagen, Valencia, CA). La concentration en protéines a été déterminée avec le test de Bradford (Test de Pierce Coomassie Plus de protéines). Ensuite, 50 µg de protéines totales ont été résolus par 12% de SDS-PAGE et transférés sur des membranes de nitrocellulose (Whatman® Protran®, taille des pores 0,45 µm). Des sites de liaison non spécifiques ont été bloqués avec du lait non gras à 5% (poids/vol) dans du PBS avec du Tween 20 (PBS-T) à 0,1% (vol/vol) à température ambiante pendant 1 h, puis des membranes ont été incubées à 4 °C avec un anticorps polyclonal anti-CLDN1 (JAY-8) pendant une nuit. Les membranes ont ensuite été lavées et incubées avec l’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort approprié pendant 1 h. La révélation a été réalisée avec un système de chimiluminescence (Amersham Biosciences); l’expression de la β-tubuline a été utilisée pour la normalisation.

Extraction de protéines subcellulaires

L’extraction de protéines a été réalisée comme décrit précédemment. Pour chaque échantillon, des sections de 20 µm d’épaisseur ont été découpées avec un cryotome, mélangées à de l’azote liquide et broyées doucement avec un micro-pilon. Pour l’extraction des protéines subcellulaires, le Kit d’extraction du protéome subcellulaire ProteoExtract a été utilisé conformément aux instructions du fabricant (Calbiochem). Des fractions subcellulaires (10 µg/chacune) ont été chargées sur des gels SDS-PAGE à 12%. L’immunoblot a été réalisé comme décrit ci-dessus avec les anticorps primaires suivants : anti-CLDN1 (JAY-8), -CD71 (Invitrogen), -Histone H3 (Pierce) et -β-tubuline (Sigma T4026).

Lignées cellulaires

Les lignées cellulaires CRC humaines suivantes ont été utilisées: SW480 (ATCC CCL-228), SW620 (ATCC CCL-227), Caco-2 (ATCC HTB-37), Difi (un cadeau de C. Montagut, Département d’oncologie médicale, Hôpital del Mar, Barcelone, Espagne), HCT116 (CCL-247) et LS174T (ATCC CL-188). Pour obtenir la lignée cellulaire SW480 CLDN1-positive (SW480-CLDN1), les cellules SW480 ont été transfectées de manière stable avec le clone d’ADNc CLDN1 humain (collection Invitrogen MGC) ou avec un vecteur vide (ADNc PC) à l’aide du réactif de transfection jetPRIME™ (Polyplus-transfection Inc., France). Des clones CLDN1 positifs ont été sélectionnés par croissance de cellules transfectées en présence de 500 µg/ml de généticine. Pour le silençage de CLDN1, SW620 a été transduit avec le vecteur pSIREN contenant le shRNA contre CLDN1 (SW620shCLDN1) ou contre la luciférase (shLUC, contrôle négatif). Après 24 h, des cellules ont été sélectionnées avec 1 µg/mL de puromycine et des clones stables ont été mis en commun. Toutes les transfections transitoires ont été effectuées à l’aide du réactif de transfection jetPRIME™.

Production d’anti-CLDN1 mAb 6 F6

Pour la production d’anticorps, des souris BALB/c femelles âgées de 6 à 8 semaines (Harlan, Gannat, France) ont été remises en question par injection intra-péritonéale (i.p.) de 4 millions de cellules NIH de souris transfectées transitoirement avec l’ADNc CLDN1 (cellules NIH-CLDN1) toutes les deux semaines (cinq injections au total). Les cellules NIH-CLDN1 ont été mélangées avec l’adjuvant de Freund complet (Sigma) pour la première injection et avec l’adjuvant de Freund incomplet (Sigma) pour les quatre autres injections. Une injection intraveineuse de rappel de cellules NIH-CLDN1 a été administrée trois mois après la cinquième vaccination. Trois jours plus tard, des cellules de rate de souris immunisées ont été fusionnées avec la lignée cellulaire de myélome de souris P3-X63-Ag.8.653 pour produire des hybridomes de souris. Les surnageants provenant de clones nouvellement générés ont été criblés par tri de cellules activées par fluorescence (FACS) à l’aide de cellules SW480-CLDN1 et SW480 (témoins négatifs). Les résultats du dépistage ont été confirmés en effectuant un dépistage supplémentaire à l’aide de cellules SW620 et SW620-shCLDN1. Le clone de l’hybridome 6 F6 anti-CLDN1 a été sélectionné et cloné par dilution limitante. L’isotypage des anticorps a montré que 6 F6 était un IgG3k.

Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées dans le respect des directives du gouvernement français pour les études expérimentales sur les animaux (accord CEEA-LR-12052).

Radiomarquage et imagerie SPECT-CT

Des souris nues athymiques femelles (âgées de 6 à 8 semaines) ont été achetées à Harlan. Le mAb 6 F6 a été radiomarqué avec du 125I (Perkin Elmer) à l’activité spécifique de 370 MBq/mg pour l’imagerie par tomodensitométrie à émission monophotonique (SPECT), en utilisant l’IODO-GEN (Pierce Chemical Co.) méthode. Après l’injection dans la veine de queue de 16 MBq / 50 µg de 6 F6 marqués au 125I, des images de tomographie par émission de photons simples / tomodensitométrie (SPECT/ CT) du corps entier ont été acquises avec une caméra NanoSPECT multi-sténopé à multiplexage à 4 têtes (Bioscan Inc., Washington, États-Unis) à divers moments (48, 72 et 96 h). En même temps, des images de micro-tomodensitométrie du corps entier ont été acquises pour coenregistrement anatomique avec les données SPECT. Les données SPECT et CT reconstruites ont été visualisées et co-enregistrées à l’aide d’Invivoscope®.

Dosage clonogénique

Les cellules cancéreuses colorectales ont été ensemencées dans une plaque à 6 puits (150, 250 ou 400 cellules/puits) et laissées adhérer à 37 °C pendant la nuit. Ensuite, 1 ml de RPMI avec ou sans 6 mAb F6 (concentration finale: 100 µg/ml) a été ajouté à chaque puits et les cellules ont été cultivées pendant six jours. Après six jours supplémentaires dans un milieu sans anticorps, les plaques ont été lues à l’aide d’un cytomètre d’imagerie Celigo™ et de l’application “Vérification de colonie unique”. Le cytomètre Celigo™ est un système d’analyse cellulaire in situ de paillasse qui fournit des images de puits à l’aide d’un éclairage en champ lumineux (Nexcelom Bioscience, MA, USA).

Établissement de cultures sphéroïdes tridimensionnelles (3D)

Des plaques à 96 puits à fond rond à fixation ultra faible (Costar de Corning) ont été utilisées pour la formation de sphéroïdes. Les cellules SW480, SW480-CLDN1 ou SW620 ont été ensemencées à une densité de 5 × 104. Cellules agrégées et fusionnées en sphéroïdes 3D en 24-72 h. Des images de puits ont été prises avec un microscope à contraste de phase à l’aide d’un objectif 5× ou capturées avec le cytomètre d’imagerie Celigo™ à l’aide de l’application “Tumorosphere”. La viabilité cellulaire a été évaluée avec le Test de viabilité cellulaire luminescente CellTiter-Glo (Promega, Madison, WI, USA). Après addition de 100 µl de réactif CellTiter Glo dans chaque puits pendant 10 min, la luminescence a été mesurée sur un lecteur de microplaques à luminescence 1450 MicroBeta TriLux (Perkin Elmer).

Analyse du cycle cellulaire et de la prolifération dans des sphéroïdes

Des sphéroïdes ont été préparés en plaquant 1000 cellules DiFi par puits dans des plaques à 96 puits à très faible attachement et en les cultivant en présence de 100 µg/ml de mAb 6 F6 ou de mAb non pertinent (retuximab) pendant 5 jours. Pour l’analyse du cycle cellulaire, les cellules ont été granulées, trypsinisées, lavées avec du PBS, fixées dans de l’éthanol à 75% et colorées avec 40 µg / ml d’iodure de propidium en présence de 100 µg ml−1 RNase (Qiagen). La distribution du cycle cellulaire a été déterminée avec un cytomètre en flux Beckman Coulter FC500 utilisant le canal FL-3. Les cellules ont été bloquées sur un tracé à points qui affichait le pic d’impulsion d’ADN par rapport à la zone d’impulsion d’ADN pour exclure les doublets. Les distributions du cycle cellulaire ont été illustrées à l’aide du logiciel d’analyse Flow Jo (Treestar, FLOWJO, Ashland, OR, USA).

Au jour 4 de la culture, la prolifération cellulaire a été mesurée en incubant des cellules avec de la 5-éthynyl-2′-désoxyuridine (EdU) pendant 24 h. L’EdU est incorporée à l’ADN lors de la synthèse active de l’ADN. Ensuite, après trypsinisation cellulaire et fixation / perméabilisation dans de l’éthanol / PBS à 75%, l’EdU incorporé a été marqué et détecté avec le kit de test de cytométrie en flux Alexa Fluor 488 de Click-iT EDU (Invitrogen). Les cellules ont ensuite été incubées avec 1 µg/ml de 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans du PBS/Triton X100 à 0,1% à 37 °C pendant 30 min. L’application Celigo™ “Analyse d’expression ” (Masque Cible 1+) a été utilisée pour quantifier le signal fluorescent et pour l’analyse des données. Les cellules ont été identifiées à l’aide de la tache nucléaire DAPI et la synthèse de l’ADN a été quantifiée en mesurant l’incorporation d’EdU.

Des modèles de xénogreffe de souris

1,5 ×106 cellules SW620 ou 3 × 106 cellules DiFi ont été mis en suspension dans le milieu de culture et injectés par voie sous-cutanée (c.s.) dans le flanc droit de souris nues athymiques femelles âgées de 6 à 8 semaines de Harlan. Lorsque le volume tumoral a atteint environ 100 mm3, les souris ont été randomisées dans différents groupes et traitées par injection i.p. de NaCl à 0,9% ou de 6F6 mAb (15 mg / kg par injection) deux fois par semaine pendant trois semaines consécutives pour la première expérience et trois fois par semaine pour la deuxième expérience. Les tumeurs ont été mesurées deux fois par semaine avec un étrier et les volumes calculés avec la formule: D1 x D2 x D3 / 2.

Modèle de colonisation hépatique intrasplénique

Dans chaque expérience, 2 millions de cellules SW620 exprimant la luciférase (cellules SW620-LUC) ont été injectées dans la rate de souris nues athymiques femelles âgées de 6 à 8 semaines. La rate a été retirée 2 min après l’injection cellulaire. Le jour 1 après l’injection, les souris ont été réparties aléatoirement en deux groupes de 10 souris traitées soit avec 15 mg/kg de 6 mAb F6 soit 0,9% de NaCl par injection i.p., trois fois par semaine. Pour évaluer la formation et la dissémination métastatiques, l’expression de la luciférase a été surveillée par imagerie de luminescence après injection de luciférine (Camera Ivis Lumina II, PerkinElmer®) une fois par semaine. À la semaine 5 après la chirurgie, des souris ont été sacrifiées, des foies ont été retirés, photographiés et des métastases macroscopiquement visibles à la surface du foie ont été comptées.

Analyse statistique

L’analyse statistique a été réalisée à l’aide du logiciel STATA 13.0 (StataCorp). Pour les expériences d’expression génique ou d’immunohistochimie, les différences entre les groupes ont été analysées à l’aide du test de Kruskall Wallis/Dunn. Les corrélations entre l’expression du gène CLDN1 et la survie sans progression (SSP) et la survie globale (OS) ont été évaluées dans l’ensemble du groupe (n = 143 patients) et selon le sous-type moléculaire de la tumeur. À cette fin, les 143 patients ont été divisés en deux groupes en fonction de l’expression médiane du gène CLDN1 (soit 9,75). Les valeurs de la SSP et de l’OS ont été comparées à l’aide de la méthode de Kaplan-Meier et les différences entre les distributions de survie ont été évaluées à l’aide du test de rang log.

Le test t apparié a été utilisé pour comparer l’effet de l’incubation avec le mAb 6 F6 dans des expériences in vitro.

Dans des expériences in vivo, un modèle de régression mixte linéaire a été utilisé pour déterminer la relation entre la croissance tumorale et le nombre de jours après l’injection. La partie fixe du modèle comprenait des variables correspondant au nombre de jours post-greffe et aux différents groupes de traitement. Des termes d’interaction ont été intégrés au modèle; des interceptions aléatoires et des pentes aléatoires ont été incluses pour prendre en compte l’effet temporel. Les coefficients du modèle ont été estimés par maximum de vraisemblance. Les taux de survie ont été estimés à partir de la date de l’injection jusqu’à la date à laquelle la tumeur a atteint un volume de 1500 mm3 en utilisant la méthode de Kaplan–Meier. Les courbes de survie ont été comparées à l’aide du test de rang log. Pour les expériences de colonisation hépatique, les différences entre les groupes ont été évaluées avec le test U de Mann-Whitney. Pour toutes les expériences, les différences ont été considérées comme significatives lorsque P < 0,05.