Cistron

Biogenèse de PTX

Les cinq sous-unités PTX sont codées par des cistrons contigus au sein d’un seul opéron polycistronique, dont l’expression est régulée par le système BvgA/S. Via ce système à deux composants, la production de toxines peut être modulée par la présence de MgSO4 ou d’acide nicotinique, ou pendant la croissance à basse température (pour examen, voir). La BvgS est une protéine couvrant la membrane interne exprimant de multiples activités kinases. À l’état actif, il active la BvgA par phosphorylation. La BvgA phosphorylée, un régulateur transcriptionnel cytoplasmique, se lie ensuite aux sites opérateurs de la région promotrice du gène PTX, où elle interagit avec l’ARN polymérase et active la transcription. Bien que des modulateurs interférant avec la signalisation BvgS aient été identifiés, aucun ligand BvgS requis pour déclencher la signalisation n’est connu, ce qui suggère que BvgS est activé par défaut.

Après transcription, les sous-unités individuelles sont produites sous forme de préprotéines contenant des peptides de signal clivables. Lors de la translocation à travers la membrane interne (très probablement via une voie dépendant de la Sec), les peptides de signal sont éliminés. Bien que les peptides signal présentent des caractéristiques typiques des substrats de la peptidase leader I, leur clivage par la peptidase leader I d’Escherichia coli est très inefficace. La coexpression du gène lep de B. pertussis chez E. coli augmente considérablement la maturation des sous-unités PTX. Dans l’espace périplasmique, des liaisons disulfures intra-sous-unitaires se forment et l’holotoxine est ensuite assemblée avant la sécrétion à travers la membrane externe. PTX contient un total de 11 liaisons disulfures intra-sous-unitaires, une dans S1, deux dans chaque S4 et S5 et trois dans chaque S2 et S3. Toutes les cystéines présentes dans le PTX sont impliquées dans les liaisons disulfures intra-chaîne. La formation de disulfures est importante pour la biogenèse de la toxine, car l’altération de l’une ou l’autre cystéine dans S1 empêche cette sous-unité de s’assembler avec l’oligomère B. La bonne formation de disulfures repose sur le système DsbA / DsbC, qui s’est avéré essentiel pour l’assemblage et la sécrétion de PTX. Cependant, les mutations du dsbC, codant pour l’une des trois isomérases disulfures, n’ont apparemment aucun effet sur l’assemblage de la toxine, bien qu’elles altèrent sa sécrétion, suggérant que le DsbC agit sur un composant spécifiquement requis pour la sécrétion de PTX.

La sécrétion n’est pas nécessaire pour les activités biologiques du PTX, mais l’assemblage complet de l’holotoxine est important pour une sécrétion efficace, car les souches conçues pour produire uniquement S1 ou seulement l’oligomère B présentent un défaut de sécrétion. Cependant, un oligomère B entièrement fonctionnel peut être sécrété dans une certaine mesure en l’absence de S1, ce qui indique que la présence de S1 n’est pas une exigence absolue pour la sécrétion d’oligomères B. En revanche, S1 seul ne peut pas être sécrété en l’absence de l’oligomère B, ce qui suggère que les déterminants de la sécrétion sont situés à l’intérieur de l’oligomère B, bien que la présence de S1 puisse certainement améliorer l’efficacité de la sécrétion. Certaines mutations du gène S1 ont un fort effet délétère sur la sécrétion, en particulier dans la région autour d’Arg-57, suggérant que cette région de S1 joue un rôle dans la sécrétion de PTX. En l’absence de l’oligomère B, S1 cloisonne très probablement la membrane externe, peut-être via son domaine hydrophobe C-terminal. Il peut s’agir du site d’assemblage avec l’oligomère B avant la sécrétion à travers la membrane externe.

Les étapes moléculaires de l’assemblage des holotoxines sont encore mal comprises. Les sous-unités individuelles des souches mutantes qui ne produisent pas les autres sous-unités sont rapidement dégradées. Certaines combinaisons de sous-unités semblent se stabiliser mutuellement. Par exemple, la stabilité de la sous–unité S2 est grandement améliorée par la présence de S4 et vice versa, ce qui est cohérent avec la formation de dimères S2-S4 révélée par la structure cristalline de l’holotoxine. Il est également possible que des sous–ensembles du dimère S2-S4 avec la sous-unité S1 soient formés en l’absence de S3 et S5. Le dimère S2–S4 n’a pas été sécrété dans B. la coqueluche, alors que l’ajout de S1 à ce dimère peut entraîner un certain niveau de sécrétion.

Le transport du PTX à travers la membrane externe de B. pertussis repose sur un système de sécrétion de type IV (T4SS) composé de neuf protéines différentes, nommées PtlA à PtlI. Ces protéines sont homologues à celles de T4SSs provenant d’autres bactéries, notamment Agrobacterium tumefaciens, Bartonella tribocorum, Brucella suis, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila et Rickettsia prowasekii. Les gènes ptl se trouvent directement en aval des cinq gènes PTX structuraux et sont sous le contrôle du promoteur ptx. Cependant, les protéines Ptl semblent être produites à des niveaux inférieurs à ceux des sous-unités PTX, comme en témoignent les fusions translationnelles du gène phoA avec divers gènes ptx et ptl. La production de certaines protéines Ptl semble être une étape limitante de la sécrétion de PTX. Au cours d’une croissance exponentielle, on a estimé que les bactéries sécrètent trois molécules de toxine / min / cellule bactérienne, et des sous-unités se sont accumulées dans l’espace périplasmique, à la fois sous forme de sous-unités individuelles et assemblées en holotoxines. L’accumulation de sous-unités se produit tout au long de la croissance exponentielle, même si les niveaux de certaines protéines Ptl augmentent entre 30 et 1 000 molécules par cellule. Ainsi, la sécrétion plutôt que la production ou l’assemblage de toxines peuvent limiter la vitesse. Curieusement, en l’absence des protéines Ptl, certaines combinaisons de sous–unités, telles que le dimère S2-S4 en présence de S1, peuvent être sécrétées, bien que la sécrétion de l’holotoxine dépende fortement de la présence des protéines Ptl.

On pense que les protéines Ptl forment un complexe couvrant à la fois les membranes interne et externe, et toutes (au moins PtlA-H) semblent nécessaires à la sécrétion de toxines, comme l’ont étudié les mutations de chaque gène ptl individuel. Certaines des mutations introduites en trans dans des souches de ptl+ de type sauvage ont abouti à un phénotype de sécrétion négatif dominant, confirmant qu’au moins les PtlC à PtlH font partie d’un complexe multimérique. Une étape clé de la sécrétion de PTX est évidemment sa capacité à traverser la couche de peptidoglycane, et il a été démontré que la PtlE exprime l’activité de la peptidogycanase. Cette protéine longue de 276 résidus contient des similitudes au site actif avec d’autres glycohydrolases, et il a été démontré que les substitutions d’alanine à ce site diminuent considérablement l’activité peptidoglycanase de la PtlE recombinante. Les mêmes substitutions dans la PtlE naturelle abolissent également la sécrétion de PTX par B. pertussis, suggérant fortement que la PtlE est la peptidoglycanase requise pour que la toxine traverse la couche de peptidoglycane.

La sécrétion de PTX nécessite également très probablement de l’énergie. Deux des protéines Ptl, PtlC et PtlH, contiennent des sites de liaison présumés à l’adénosine triphosphate (ATP) et pourraient ainsi fournir l’énergie nécessaire à la sécrétion de toxines. Il a été démontré que les deux protéines sont nécessaires à la sécrétion, et dans les deux cas, les sites putatifs de liaison à l’ATP sont essentiels à la fonction. Pour les deux, un phénotype négatif dominant est observé lorsque les allèles mutants sont coexprimés avec l’allèle de type sauvage, suggérant que les deux fonctionnent comme des multimères ou font partie du complexe de sécrétion. Il a été démontré que la PtlH est associée à la membrane interne, et des mutations dans le site de liaison à l’ATP de la PtlH affectent sa localisation cellulaire et abolissent ses interactions avec d’autres protéines Ptl. Le rôle précis de PtlC n’est pas encore connu. Le PtlD est également une protéine membranaire interne et contient cinq domaines transmembranaires. Il est nécessaire pour la stabilité de PtlE, PtlF et PtlH via ses résidus C-terminal 72. Cependant, cette région C-terminale n’est pas suffisante pour la sécrétion de toxines. La PtlF présente des caractéristiques des protéines de la membrane externe (OMPs), mais elle peut également être associée à la membrane interne. Dans des conditions non réductrices, le PtlF et le PtlI migrent sous forme de complexe pendant l’électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide, indiquant que le PtlI se lie au PtlF par formation de liaisons disulfures. La bonne formation de liaison disulfure entre PtlI et PtlF pourrait dépendre de DsbC, car des mutations du gène dsbC affectent la sécrétion sans affecter l’assemblage des toxines.