COLO 205
Culture réussie de Vos Cellules:
* Veuillez lire les informations techniques importantes qui suivent avant de traiter les lignées cellulaires fournies par ECACC*. Ces informations sont également disponibles au format PDF dans notre menu principal, sous “Support client” (cliquez ici).
Stockage de Cellules Congelées
Dès réception, les ampoules congelées doivent être transférées directement à l’azote liquide en phase gazeuse sans délai, sauf si elles doivent être utilisées immédiatement. N’utilisez PAS un congélateur à -80 ° C comme alternative; cela entraînera une perte de viabilité.
Comment Gérer les Cellules congelées à la réception
Lors de la réception d’un envoi de lignées cellulaires congelées fournies par ECACC, il est important que l’utilisateur final prête attention à l’envoi sans délai. Les conseils techniques accompagnant les lignées cellulaires doivent être consultés avant de retirer les ampoules de la glace carbonique. Une manipulation correcte dès réception est essentielle pour établir avec succès la lignée cellulaire dans le laboratoire de l’utilisateur final.
Au moment où une lignée cellulaire est commandée, les utilisateurs finaux doivent également tenir compte des conditions de culture de la nouvelle lignée cellulaire et s’assurer que le milieu approprié sera disponible lorsque les cellules arriveront.
Importance du Comptage cellulaire
Effectuez un comptage cellulaire viable lorsque vous réanimez et récoltez des cultures cellulaires. L’une des raisons les plus courantes de l’échec de l’établissement de cellules en culture est due à l’utilisation d’une densité d’ensemencement de cellules viables incorrecte au moment de la réanimation, c’est-à-dire l’ensemencement de cellules trop faible ou trop élevé. Cela peut être évité en effectuant un comptage cellulaire viable et en suivant la densité d’ensemencement recommandée.
Pour la lignée cellulaire spécifique avec laquelle vous travaillez, lisez les informations fournies sous l’onglet “Description” sur la page de notre site Web. Ces informations se trouvent également dans la fiche technique de la lignée cellulaire, qui vous sera fournie sous forme de copie papier avec votre envoi de lignée cellulaire. La densité d’ensemencement est indiquée dans les informations de routine de sous-culture. Lors de l’ensemencement des cellules immédiatement après la réanimation, utilisez l’extrémité moyenne à supérieure de la plage de densité d’ensemencement indiquée.
Réanimation de Cellules Congelées
Il est important de manipuler les ampoules congelées avec soin; portez un manteau de laboratoire, un masque protecteur complet et des gants. En de rares occasions, les ampoules peuvent exploser lors du réchauffement en raison de l’expansion de l’azote liquide résiduel emprisonné.
1. Dans une armoire de sécurité microbiologique, tenez un tissu imbibé d’alcool à 70% autour du capuchon de l’ampoule congelée. Tournez le bouchon d’un quart de tour pour libérer l’azote liquide résiduel qui pourrait être piégé. Resserrer le bouchon. Transférer rapidement l’ampoule dans un bain d’eau de 37oC jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un ou deux petits cristaux de glace, le cas échéant, (1-2 minutes). Il est important de décongeler rapidement pour minimiser les dommages aux membranes cellulaires.
Remarque: Ne pas immerger totalement l’ampoule car cela pourrait augmenter le risque de contamination.
2. Essuyez l’ampoule avec un mouchoir imbibé d’alcool à 70% avant l’ouverture.
3. Pipeter tout le contenu de l’ampoule dans un tube stérile (par exemple, capacité de 15 ml). Ajoutez ensuite lentement 5 ml de milieu préchauffé qui a déjà été complété avec les constituants appropriés. Déterminer la densité cellulaire viable à l’aide de la teinture bleue trypan, d’un hémocytomètre et d’un microscope inversé pour compter les cellules ou d’une méthode de comptage cellulaire équivalente. Transférer le volume de suspension cellulaire approprié pour atteindre la densité d’ensemencement cellulaire recommandée dans la saisie des données de la lignée cellulaire.
Pour les lignées cellulaires adhérentes: Ajustez le volume du milieu, et si nécessaire la taille du flacon, pour atteindre la densité d’ensemencement des cellules recommandée sur la fiche technique de la lignée cellulaire. Une étape de pré-centrifugation pour éliminer le cryoprotecteur n’est normalement pas nécessaire car le premier changement de milieu éliminera le cryoprotecteur résiduel. Si c’est le cas, cela sera spécifié sur la fiche technique. Si les cellules doivent être utilisées immédiatement (par exemple pour un dosage à base de cellules), plutôt que sous-cultivées, il peut être conseillé d’effectuer une étape de pré-centrifugation pour éliminer le cryoprotecteur.
Pour les lignées cellulaires en suspension* : Une étape de pré-centrifugation pour éliminer le cryoprotecteur est recommandée, c’est-à-dire pelleter les cellules par centrifugation à 150 x g pendant 5 minutes et remettre la pastille cellulaire en milieu frais en utilisant le volume approprié pour obtenir la densité d’ensemencement correcte.
1. Incuber les flacons à la température et au niveau de CO2 recommandés sur la fiche technique. Si un incubateur alimenté en CO2 est utilisé, le flacon doit avoir un bouchon ventilé pour permettre les échanges gazeux.
Cultures D’Hybridomes Congelées
Lors de la récupération de cultures d’hybridomes congelées, il n’est pas rare que la croissance initiale soit plus lente que prévu et il peut y avoir une diminution de la viabilité observée. L’établissement d’une culture en prolifération active peut prendre jusqu’à 2 semaines.
Lors de la réanimation, une étape de centrifugation pour retirer le cryoprotecteur est essentielle. Décongeler rapidement l’ampoule congelée au bain-marie à 37 ° C pendant 1 à 2 minutes. Transférer le contenu dans un tube à centrifuger et ajouter lentement 5 à 10 ml de milieu de croissance préchauffé +. Retirez un échantillon pour le comptage. Centrifuger à 100 x g pendant 2-3 minutes dans les cellules en granulés et les graines à une densité relativement élevée de 5-7 x 105 cellules / ml. Placez le flacon de culture à plat et observez régulièrement jusqu’à ce que des cellules proliférantes viables soient visibles.
+ Souvent, les cultures d’hybridomes peuvent bénéficier d’une remise en suspension avec des milieux additionnés de 20% de FBS au stade critique précoce de l’établissement de la culture immédiatement après la réanimation.
Procédure de Congélation des Cellules
ECACC recommande de congeler un stock de votre ou vos lignées cellulaires peu après réception (entre 2 et 4 x 106 cellules / ml) par précaution.
Le guide suivant est proposé pour la préparation et la cryoconservation de lignées cellulaires.
1. Récoltez les cellules dans la phase log de croissance de la même manière que celle utilisée pour la sous-culture de routine. Pour les lignées cellulaires adhérentes, récoltez le plus près possible de 80 à 90% de confluence.
2. La procédure standard consiste à utiliser 90% de sérum + 10% de cryoprotecteur pour toutes les lignées cellulaires, sauf indication contraire sur la fiche technique. Prévoir 1 ml pour chaque ampoule. La plupart des lignées cellulaires peuvent être congelées dans le milieu de culture approprié additionné de sérum à 20% et de cryoprotecteur à 10%. Il s’agit généralement de DMSO, mais dans certains cas, le glycérol est recommandé. Si le DMSO ne convient pas, une alternative sera spécifiée sur la fiche technique de la lignée cellulaire.
3. Cellules de granulés par centrifugation par exemple 150 x g pendant 5 minutes. Remettre les pastilles cellulaires en suspension dans le milieu de congélation approprié pour obtenir une concentration cellulaire finale comprise entre 2 et 4 x 106 cellules / ml et pipeter 1 ml dans chaque ampoule.
4. Congelez les cellules à une vitesse de refroidissement comprise entre 1 et 3oC/min à l’aide d’un congélateur programmable à débit contrôlé ou d’une alternative appropriée1. Lorsque la température atteint au moins – 130oC, transférer l’ampoule dans un récipient de stockage d’azote liquide en phase gazeuse.
