Comment concevoir un ARNR pour l’édition du génome CRISPR?
Le gRNA guide le système CRIPR Cas9 vers le bon emplacement génomique pour effectuer une rupture à double brin.La spécificité de ciblage du système CRISPR Cas9 est déterminée par les 20 nucléotides à l’extrémité 5′ de l’ARNG. La base gRNA se couple au brin complémentaire de la séquence cible et la nucléase Cas9 effectue une rupture à double brin.
Lors de la conception d’un gRNA, les éléments suivants doivent être pris en compte.
1) Teneur en GC: La plage typique se situe entre 40% et 80%. Une teneur en GC plus élevée stabilise le duplex ARN-ADN tout en déstabilisant les hybridations hors cible
2) Longueur: La longueur peut être ajustée et varie de 17 à 24 paires de bases. Une séquence plus courte conduit à des effets hors cible minimisés. (17 pb est la limite la plus basse de la longueur de la séquence de guidage, toute longueur de la séquence de guidage toute longueur inférieure à 17 a une chance statistique de cibler plusieurs locus génomiques.)
3) Effets hors cible potentiels: La tolérance à l’inadéquation et le site cible sont ce qui conduit à des effets hors cible. Cela peut être réduit par des recherches d’effets cibles à l’échelle du génome.
Il existe de nombreux sites Web qui aident à concevoir des GRNA. Certains d’entre eux sont Chop Chop (Harvard), Broad Institute sgRNA designer et Biotools.
J’explique comment utiliser le site Web de Chop Chop ici,
1) aller à https://chopchop.cbu.uib.no/
2) Sélectionnez l’espèce
3) Sélectionnez l’id du gène spécifique à l’espèce ou coupez et collez le nucléotide d’intérêt et commencez l’analyse.
Une fois l’analyse terminée, une représentation graphique de l’aRNG spécifique au site sera affichée. Chaque ARNr potentiel montrera également les effets possibles hors cible. Sélectionnez ceux avec moins d’effets hors cible.
