Détection et identification par PCR de Clostridium chauvoei dans des isolats cliniques, des fèces bovines et des substrats provenant d’une usine de biogaz

Échantillons provenant de cas suspects de jambe noire

Pour les échantillons musculaires provenant de cas suspects de jambe noire, les résultats de la culture sur plaques FAA suivis d’une PCR provenant d’une colonie les matériaux étaient en accord avec la méthode d’identification biochimique ou étaient encore meilleurs que la méthode d’identification biochimique (tableau 2). Ces résultats concordent avec ceux d’Uzal et coll. . Cette étude a démontré que la préparation de l’ADN à partir d’une culture avant PCR donnait de meilleurs résultats que la PCR appliquée directement sur la biomasse.

La culture suivie de méthodes d’identification biochimique est compliquée dans des échantillons à forte teneur en flore contaminante en raison de la nécessité d’une culture pure et la sensibilité était nettement inférieure à celle de la culture et de la PCR. Dans huit cas, il a été impossible de détecter C. chauvoei par culture et identification biochimique, mais l’organisme a été détecté par PCR (tableau 2). Pour établir un diagnostic de jambe noire, le tissu musculaire est prélevé à l’autopsie car la quantité de C. chauvoei est probablement plus élevée dans le tissu musculaire que dans le sang. L’échantillon de sang unique a été mal prélevé, mais la question était blackleg.

De même, dans une étude précédente d’une flambée de pattes noires, la culture et la détection par PCR ont donné de meilleurs résultats que l’analyse biochimique. Dans l’un des cas, la culture primaire d’un muscle sur une plaque de gélose sanguine a été envahie par C. septicum, mais a donné des résultats clairement positifs pour C. chauvoei dans la PCR.

Dans la plupart des cas cliniques de jambe noire, la quantité de C. le chauvoei dans les tissus infectés est élevé et peut facilement être détecté par la méthode PCR indépendamment de la flore contaminante. De plus, la méthode PCR est beaucoup plus rapide que la méthode de détection biochimique traditionnelle, qui prend au moins cinq jours, et il est important d’avoir une culture pure de la souche, ce qui pourrait nécessiter un temps supplémentaire pour la culture. Pour éviter de contaminer la flore, le tissu musculaire ne doit pas être trop petit; environ 100 à 200 g suffiraient. Sans culture pure, aucune souche ne peut faire l’objet d’études ultérieures à l’avenir, ce qui présente un inconvénient d’utiliser la détection par PCR comme seule méthode.

Chez des bovins infectés expérimentalement par C. chauvoei, des analyses PCR ont été effectuées sur des muscles hachés et d’autres organes et C. chauvoei a été détecté dans tous les organes testés. Des morceaux de muscles émincés provenant de cas suspects de jambe noire ont été directement testés par PCR et comparés à la culture. La détection par PCR a donné de meilleurs résultats que la culture et l’identification biochimique, ce qui est en désaccord avec les résultats de la présente étude où seulement 12% (3 sur 24) des morceaux de sang ou de muscle dépassaient le seuil de détection de la PCR, tandis que 9% des échantillons de jus de viande dépassaient le seuil de détection (tableau 2). Des substances inhibitrices sont probablement présentes dans les tissus musculaires. Des inhibiteurs de la réaction enzymatique d’amplification par PCR ont été identifiés dans le foie, la rate et les reins et il peut y avoir des inhibiteurs similaires présents dans le tissu musculaire. Les résultats des morceaux musculaires macérés dans des échantillons de sérum physiologique stériles (26%) ne correspondaient pas bien à ceux du test biochimique. La PCR directe sur du tissu musculaire ou d’autres échantillons similaires ne convient probablement pas pour remplacer les étapes de culture suivies de tests biochimiques ou de PCR.

Échantillons musculaires prélevés par écouvillons

Pour déterminer s’il est nécessaire d’envoyer du tissu musculaire pour l’analyse de C. chauvoei ou s’il suffit d’utiliser des écouvillons pour le prélèvement d’échantillons, un service postal a été simulé. Sur les 22 tissus musculaires étudiés, 64% dépassaient le seuil de détection de la PCR. Pour les écouvillons provenant des mêmes échantillons après la simulation du service postal, 36 % à 47 % des écouvillons dépassaient le seuil de détection (tableau 3). Il serait plus pratique de prélever des échantillons avec des écouvillons au lieu de tissus musculaires si les écouvillons sont suffisants pour l’analyse de C. chauvoei. Cependant, les tissus musculaires ont donné des échantillons plus positifs que des écouvillons lorsque les deux ont été analysés par culture et PCR (tableau 3). L’incidence de C. chauvoei sur les écouvillons des cas de tissus musculaires positifs semblait être aléatoire. Cependant, il semblait ne faire que peu ou pas de différence si les écouvillons étaient stockés pendant 1, 3 ou 6 jours.

Échantillons provenant d’usines de biogaz

Clostridium chauvoei a été détecté dans 3 échantillons sur 11 dans le substrat de biogaz avant la pasteurisation, mais il n’a pas pu être détecté après la pasteurisation ou après digestion (tableau 4). Les bactéries contenues dans ces types d’échantillons pourraient provenir de fumier ou de sous-produits animaux de l’abattoir, ces deux sources étant utilisées pour la production de biogaz. Aucune des exploitations échantillonnées dans cette étude n’envoie son fumier aux usines de biogaz en raison de la distance géographique, mais les animaux sont envoyés à l’abattoir local. Des cas de jambe noire ont également été signalés dans la zone de captage de l’usine de biogaz.

Après traitement du biogaz, les résidus digérés sont utilisés comme engrais. Les bactéries formant des spores peuvent survivre à la pasteurisation et à la digestion dans les usines de biogaz et les résidus digérés des usines de biogaz peuvent donc être capables de propager la jambe noire dans de nouvelles zones. Cependant, pas de C. chauvoei a été détecté dans le produit transformé, de sorte que l’environnement dans le digesteur ne convient peut-être pas à C. chauvoei, ou la flore dans le digesteur dépasse C. chauvoei. Les spores clostridiales peuvent survivre pendant de longues périodes dans le sol, ce qui doit être pris en compte dans d’autres études sur C. chauvoei dans le digesteur.

Échantillons provenant de fermes

Malgré le fait que toutes les fermes étudiées avaient signalé des cas suspects de jambe noire au cours des dernières années, tous les échantillons provenant des fèces, du sol et de l’ensilage se sont révélés négatifs pour C. chauvoei. Il pourrait y avoir plusieurs explications à cela. Des spores pourraient encore être présentes dans le matériau, mais en dessous du niveau de détection. De plus, des inhibiteurs de PCR peuvent être présents dans les échantillons et la PCR peut être entravée. Les fèces de bovins contiennent des acides gras volatils (AGV) et les échantillons de sol peuvent contenir des traces de métal, qui sont tous deux connus pour interférer avec la réaction de PCR. Cependant, l’étape de culture avant PCR réduit l’influence des substances inhibitrices.

Depuis C. chauvoei est une bactérie du sol certaines variations saisonnières peuvent se produire, par exemple de fortes pluies peuvent contribuer à la propagation des spores et la quantité de spores dans le sol peut être plus accessible aux bovins. La plupart des prélèvements ont été effectués au début de l’automne lorsque le temps était ensoleillé et la concentration de spores dans les échantillons devrait donc être faible. Le nombre d’échantillons peut avoir été insuffisant pour détecter la contamination de l’environnement. Cependant, pour des raisons pratiques, un très grand nombre d’échantillons environnementaux sont rarement disponibles sur le terrain.

Des cas suspects de jambe noire dans les fermes étaient principalement survenus chez des veaux et des génisses, mais une ferme a signalé un cas chez une vache adulte. Sept des onze fermes A-K avaient des programmes de vaccination en place au moment de l’échantillonnage (tableau 1).

Deux des fermes ont entreposé du fumier avant l’épandage et les autres ne l’ont pas fait, mais aucune des fermes n’a épandu du fumier sur les pâturages. Les vétérinaires locaux auraient vu plus de cas de jambe noire après le défrichement des arbustes sur l’île d’Öland, en particulier sur Alvaret (une plaine calcaire stérile, longue de près de 40 km et large de 10 km, avec une flore particulière en fonction du sol mince et du pH élevé). Alvaret est généralement utilisé comme pâturage par les fermes voisines. Peu de défrichements d’arbustes avaient été effectués l’année de l’échantillonnage.

PCR

Les procédures culturales sont coûteuses et longues, et la contamination par d’autres bactéries anaérobies qui dépassent la croissance de C. chauvoei pose souvent des problèmes. Lors de l’utilisation de la PCR, l’ADN des cellules viables et non viables est amplifié. Si seules des cellules viables doivent être détectées, une étape d’enrichissement peut être appliquée. Dans cette étude, la culture sur plaques FAA avant la PCR a été utilisée pour éviter la détection de bactéries non viables et de réactions de PCR faussement positives. L’ADN est facile à amplifier à partir de cultures pures, mais des problèmes se posent avec des échantillons contaminés, tels que des échantillons de biodéchets. La détection de l’ADN par PCR peut être entravée par de nombreuses substances, notamment les acides humiques, l’AGV, les graisses et les protéines. Cependant, l’étape de culture avant PCR a été utilisée comme étape d’enrichissement et, par conséquent, réduit l’influence des substances inhibitrices. En raison de la flore grouillante, aucune purification des plaques FAA n’a pu être effectuée.

Seuil de détection de la méthode PCR

Le niveau de détection était de 200 ufc / g. Cela peut sembler être un niveau de détection médiocre mais cela peut s’expliquer par le fait que des échantillons tels que le fumier, le sol et le substrat de biogaz sont fortement contaminés par la flore environnante. Sasaki a signalé un taux de détection de 10 UFC/g, apparemment dans des échantillons plus propres. Cependant, puisque le niveau de détection dans notre étude était de 200 ufc / g et que ces échantillons devaient contenir un faible nombre de C. chauvoei. Ainsi, la méthode utilisée dans la présente étude n’est pas pratiquement applicable.

Aspects environnementaux

Le seuil de détection de la méthode PCR après préculture n’est guère à l’état actuel adapté pour garantir l’absence d’infection des animaux ou pour déterminer le statut des pâturages. Au lieu de cela, les recommandations actuellement appliquées doivent être utilisées, car la méthode ne peut pas être utilisée comme base pour les routines de vaccination. Dans les zones où la jambe noire est endémique, la vaccination annuelle avant le pâturage est recommandée, malgré les coûts et le temps requis.

Cette étude a donné une indication que C. chauvoei ne passe pas par le processus de biogaz. Le nombre de C. chauvoei dans les biodéchets a peut-être diminué dans le digesteur jusqu’en dessous du seuil de détection de la méthode et le risque de propagation des résidus digérés est donc négligeable. D’autres études sur la survie des clostridiaux à travers le processus de biogaz sont nécessaires avant de pouvoir tirer des conclusions définitives. Cependant, les avantages des résidus digérés en tant qu’engrais l’emportent peut-être sur le risque de propagation de la jambe noire.