Diagnostic de l’inflammation et de l’infection dans le système urinaire via la protéomique

Sources d’échantillons pour évaluer les données protéomiques urinaires à des fins de diagnostic urinaire

La collecte de 120 échantillons d’urine présentés dans cette étude ne s’est pas limitée au diagnostic, à l’évaluation de la progression ou au traitement d’une maladie spécifique. Une analyse d’urine (UA) des échantillons a été ordonnée par les médecins traitants pour diverses raisons, notamment une blessure aiguë, des saignements vaginaux, des étourdissements / nausées, une hyperlipidémie, un diabète de type II et des complications associées, des douleurs abdominales / nausées, une hypertension non spécifiée, une hypertension vésicale, une polyurie idiopathique et une infection urinaire suspectée. Étant donné que l’infection URINAIRE est une maladie infectieuse très répandue liée à certains des symptômes cliniques susmentionnés (par exemple, douleurs abdominales / nausées) et à des facteurs de risque (par exemple, diabète), nous nous attendions à un diagnostic fréquent de bactériurie ou d’infection urinaire à partir de ces échantillons. Les analyses protéomiques ont été limitées aux échantillons où les rapports d’analyses d’urine fournissaient un soutien provisoire pour les infections urinaires d’origine bactériologique (voir Méthodes). Nous n’avons pas analysé les échantillons d’urine dans les cas où le diagnostic spécifique de bactériurie asymptomatique était disponible. Des données détaillées sur l’AU ont été obtenues pour l’ensemble des 120 échantillons. Cela comprenait des tests sur jauge, un examen microscopique des sédiments urinaires pour divers types de cellules et de mucus et, dans 46% des cas, des données sur la culture d’urine (UC). Les données sur l’apparence de l’urine telles que la turbidité, la couleur et la couleur et le volume des granulés d’urine ont également été examinées. Les résultats de l’analyse d’urine ont permis une comparaison complète des méthodes conventionnelles de diagnostic des maladies des voies urinaires avec les données des enquêtes métaprotéomiques (fichier supplémentaire 3: Tableau A3).

Les neutrophiles, les effecteurs dominants des réponses immunitaires innées dans les voies urinaires, sont responsables de niveaux élevés d’inflammation dans de nombreux échantillons

Les données protéomiques ont fourni de solides preuves du rôle important des neutrophiles en tant qu’effecteurs et messagers de l’inflammation dans les voies urinaires. Les neutrophiles libèrent des molécules antimicrobiennes et inflammatoires à partir de granules sécrétoires qu’ils produisent et tuent les agents pathogènes envahissants dans les phagolysosomes après leur phagocytose. Une analyse de regroupement hiérarchique optimisée pour l’ordre des feuilles des échantillons (HCLSO) a identifié quatre groupes d’échantillons avec des profils d’abondance de protéines humaines dominés par les neutrophiles (23 cas sur 111; groupes de NAD1 sur la figure 1) et deux groupes avec des quantités de protéines spécifiques aux neutrophiles comparables à celles associées au cytosquelette (25 cas; groupes de NAD2 sur la figure 1). Les protéines cytosquelettiques sont fortement exprimées dans les cellules épithéliales tapissant le tractus urogénital et constituent la majorité du protéome des sédiments urinaires en l’absence de conditions physiopathologiques dans les voies urinaires. Trente-cinq des 48 profils de grappes de NAD étaient positifs pour les ID d’un uropathogène incluant G. vaginalis, ce qui indique que la bactériurie et une réponse immunitaire envers les microbes envahisseurs constituaient une raison dominante de l’inflammation chez les patients respectifs. La raison des distances entre les amas de NAD dans l’arbre de liaison était la variation considérable du nombre de protéines humaines identifiées allant de 200 à 1 500 ID par échantillon.

Analyse par regroupement hiérarchique des profils protéomiques des granulés urinaires pour 110 échantillons. Le clustering hiérarchique a été réalisé sur des ensembles de données quantitatives sur les protéines humaines en utilisant la méthode TPA dans le logiciel MaxQuant. Les ensembles de données ont été soumis à l’analyse de corrélation de Pearson avec optimisation de l’ordre des feuilles d’échantillon et regroupement complet des liaisons à l’aide de l’outil logiciel MeV. Nous avons éliminé la carte de chaleur de l’abondance des protéines de l’arbre hiérarchique affiché des échantillons UP. Le bas du panneau sur le côté gauche se connecte au haut du panneau sur le côté droit en ce qui concerne les liens d’arbres. Les exemples de noms de grappes, indiqués à l’extrême droite du graphique avec leurs acronymes, sont discutés en détail dans le texte. Des barres colorées indiquent le type, la taille et la position de chaque groupe d’échantillons dans l’arborescence.

L’abondance des protéines neutrophiles dérivées des données protéomiques est bien corrélée avec les activités d’EL et le nombre de leucocytes

Une motivation clé de cette étude était de déterminer comment les données protéomiques dérivées des sédiments urinaires par rapport aux tests conventionnels pour quantifier les niveaux d’inflammation dans les échantillons d’urine. Nous avons déterminé les quantités de 35 protéines connues pour être fortement exprimées dans les neutrophiles activés (fichier supplémentaire 2: Tableau A2) par rapport à l’abondance totale de protéines pour chaque échantillon UP, comme le montrent les segments en barres bleues du graphique illustré à la figure 2. Sans surprise, 85% des cas appartenant aux amas de NAD1 susmentionnés se trouvaient dans la section du graphique avec une teneur en protéines neutrophiles supérieure à 30% (sur le côté gauche). Les 35 protéines comprenaient cinq groupes fonctionnels: les protéines de la famille S100 se liant au calcium S100-A8, S100-A9 et S100-A12 qui contribuent à 40-50% de la teneur totale en protéines cytosoliques des neutrophiles; protéines libérées au cours de l’inflammation à partir de granules neutrophiles, y compris la myéloperoxydase (MPO), la cathepsine G (CTSG), la défensine-1 (DEFA1), l’élastase (ELANE), le lysosome (LYZ), la lactotransferrine (LTF) et la cathélicidine (AMPC); protéines impliquées dans la formation, le trafic et la fusion de granules avec des phagolysosomes, y compris la grancalcine (GCA), la plastine-2 (LCP1), l’annexine A3 ( ANXA3), et la tétraspanine (antigène CD63); protéines influençant la migration des neutrophiles dans le milieu d’une matrice extracellulaire réorganisante, telles que l’intégrine aM/β2, la gélatinase (MMP9) et la collagénase des neutrophiles (MMP8); et la NADPH oxydase, une enzyme à plusieurs sous-unités dont le cytochrome b-245 (CYBA, Figure 3) située dans la membrane des phagolysosomes des cellules phagocytaires et responsable de l’éclatement oxydatif qui tue directement les agents pathogènes. Beaucoup de ces protéines, en particulier la défensine-1, étaient très abondantes dans des échantillons présentant des signes d’infections urinaires (par exemple, SA_112 et PM_20, Figure 3). Les agents pathogènes bactériens dans les deux cas étaient S. aureus (SA) et P. mirabilis (PM) et, de façon non inattendue, étaient situés du côté gauche de la parcelle de la figure 2 et adjacents l’un à l’autre dans un groupe de NAD1 (Figure 1). Nous reconnaissons que ces données reflètent des quantités approximatives de neutrophiles compte tenu du fait que des protéines telles que la défensine-1, la LTF, la S100-A8 et la S100-A9 sont également libérées dans les voies urinaires par les cellules urothéliales. Cependant, l’analyse de clustering hiérarchique optimisée pour l’ordre des feuilles de protéines (HCLPO) a montré que ces protéines se regroupaient les unes avec les autres, soutenant la notion d’un rôle dominant des neutrophiles dans leur production (fichier supplémentaire 4: Figure A1). La peroxydase éosinophile (EPX) et la protéine cationique éosinophile (ECP), qui sont également des effecteurs de la réponse aux agents pathogènes, étaient d’un ordre de grandeur moins abondantes que les protéines dérivées des neutrophiles, ne soutenant donc pas un rôle majeur des éosinophiles dans la réponse inflammatoire. Le facteur inhibiteur de migration spécifique aux macrophages (MIF) était présent en quantités encore plus faibles, suggérant la quasi-absence de macrophages en tant que participants aux réponses immunitaires aiguës à la suite d’une invasion d’agents pathogènes dans les voies urinaires.

Profils protéiques montrant les contributions quantitatives des neutrophiles, du système du complément et des érythrocytes au protéome total des échantillons de pastilles urinaires. Le graphique montre les abondances protéiques additionnées, par rapport au protéome total, pour trois catégories de protéines biologiques. L’axe des abscisses répertorie les identifiants des échantillons UP associés à 110 sujets humains. Les trois catégories représentent les protéines produites par les neutrophiles activés (en BLEU), les protéines fortement exprimées dans les érythrocytes et libérées lors d’une lésion vasculaire (en VERT) et les protéines associées à l’activité du système du complément et à la coagulation (en ROUGE). La méthode utilisée pour la quantification de toutes les protéines est la méthode iBAQ dans l’outil logiciel MaxQuant. L’ordre des échantillons est basé sur l’abondance des protéines neutrophiles, décroissant de gauche à droite. Pour permettre des comparaisons directes pour l’évaluation de l’inflammation, le score du test LE a été inclus dans le graphique au-dessus de chaque barre représentant un échantillon. Sous l’axe des abscisses, une barre supplémentaire représente les échantillons associés à l’ID d’un agent pathogène provoquant une infection URINAIRE (segments de couleur ORANGE), des bactéries commensales (segments de couleur VERTE) ou l’absence d’ID bactériennes (pas de couleur).

Abondance de protéines neutrophiles sélectionnées dans des échantillons UP. Treize protéines énumérées dans la légende à l’extrême droite sont des protéines de granules neutrophiles. Trois autres protéines sont le fibrinogène-β (FGB; impliqué dans la coagulation), la sous-unité α de l’hémoglobine (HBA1; l’uromoduline (UMOD; abondante dans l’urine des donneurs sains). Les échantillons SA_112 et PM_20 représentaient des infections urinaires causées par S. aureus (SA) et P. mirabilis (PM), respectivement. Le profil de LG_23 (Lactobacillus) indiquait l’absence d’inflammation et représentait une colonisation urétrale, éventuellement aussi une contamination vaginale mineure de l’échantillon d’urine. KP_10 (K. pneumoniae) semblait représenter une infection vaginale car des saignements vaginaux ont été diagnostiqués cliniquement chez la patiente. Les profils protéiques de EC_13 (UPEC) et KP_55 suggèrent la quasi-absence d’inflammation, et donc la colonisation urétrale la plus probable. Les protéines ont été quantifiées à l’aide de la méthode iBAQ, dans chaque cas divisées par les valeurs iBAQ additionnées pour l’ensemble du protéome UP.

Score NAD

La représentation des quantités de protéines neutrophiles dans le graphique de la figure 2 est dérivée des scores NAD (activation et dégranulation des neutrophiles) également fournis dans (fichier supplémentaire 3: Tableau A3). La figure 2 comprend des scores LE allant de négatif (N) à trace (T), 1, 2 et 3 pour chaque échantillon. Dans l’ensemble, une forte corrélation entre l’abondance des protéines neutrophiles et les scores LE est observée. Le score LE mesure l’activité des estérases leucocytaires, représentant probablement principalement l’élastase (ELANE) et la myéloblastine (PRTN3), deux protéases neutrophiles quantifiées pour huit échantillons à la figure 3. Tous les profils sur le côté gauche du graphique (figure 2) et cinquante-trois des 60 échantillons contenant plus de 30% de protéines neutrophiles (iBAQ) présentaient des scores LE de 2 ou 3. Vingt-neuf des 40 échantillons ayant une teneur en protéines neutrophiles inférieure à 23 % (iBAQ) présentaient des scores LE allant de négatifs à 1. Dans seulement quatre des onze cas où le score LE était ≥ 2, mais où la teneur en protéines neutrophiles était relativement faible, le nombre de leucocytes microscopiques était supérieur à 11 cellules par champ de haute puissance (HPF), un seuil utilisé pour définir la pyurie. Dans l’ensemble, il y avait un peu moins d’accord dans la comparaison des dénombrements de leucocytes fixant le seuil à 11 cellules / HPF avec une teneur en protéines neutrophiles supérieure à 30 % (iBAQ): 14 des 60 cas présentaient des dénombrements ≤ 10 (fichier supplémentaire 3: Tableau A3). En résumé, l’évaluation de la teneur en neutrophiles dans les sédiments urinaires par protéomique semble au moins aussi précise que le test LE pour diagnostiquer l’inflammation des voies urinaires. Il mesure la somme des abondances de 35 protéines enrichies en neutrophiles et peut être moins sensible aux résultats faussement positifs par rapport au test LE.

L’abondance de la teneur en protéines érythrocytaires sert d’indicateur diagnostique de lésion vasculaire

Les lésions vasculaires dans les voies urinaires, généralement associées à une inflammation, sont évaluées à l’aide de tests de jauge pour l’hémoglobine et le comptage microscopique des globules rouges dans l’analyse d’urine conventionnelle. Compte tenu de l’enrichissement élevé de protéines distinctes dans les érythrocytes, nous avons pu développer une approche protéomique équivalente aux tests conventionnels d’hématurie. Les abondances sommées de 32 protéines de globules rouges, y compris les sous-unités d’hémoglobine, la protéine de transport des anions de la bande 3, la protéine membranaire intégrale de la bande 7 et l’anhydrase carbonique-1, par rapport à la teneur totale en protéines de chaque échantillon UP ont été déterminées, illustrées par les segments en barres vertes du graphique illustré à la figure 2. Ces quantités de protéines sont répertoriées en tant que scores ERY dans (Fichier supplémentaire 3: Tableau A3) pour chaque échantillon. Il n’y avait aucune preuve d’une bonne corrélation des scores NAD ou des résultats du test LE avec les scores ERY, ce qui suggère que, même dans les cas de détection d’un agent pathogène (illustré par la coloration de la barre horizontale en bas de la parcelle sur la figure 2), l’infiltration de neutrophiles des voies urinaires n’entraîne pas toujours une hématurie significative et des lésions tissulaires. En fixant les seuils d’hématurie à 2+ pour le test de jauge et à 4,5% pour le score ERY, 81% de tous les cas étaient d’accord. Pour les 21 cas où les scores étaient en désaccord, le nombre de globules rouges microscopiques a été évalué. En utilisant un nombre supérieur à 10 cellules par champ de haute puissance (HPF) comme preuve d’hématurie, nous avons constaté que dans les deux tiers des cas, l’analyse microscopique était en accord avec les données protéomiques. Nous concluons que les scores protéomiques de l’ERY fournissent une bonne estimation quantitative de l’hématurie dans l’urine.

Échantillons d’urine enrichis en protéines impliquées dans les activités du complément et la coagulation

Nous avons observé que l’analyse HCLPO appliquée à tous les profils protéomiques urinaires regroupait 21 protéines ayant des rôles fonctionnels dans les voies de coagulation et/ou le système du complément (fichier supplémentaire 4: Figure A1). La justification de la mesure conjointe de l’abondance des protéines liées à ces voies inflammatoires était également basée sur des rapports d’interactions fonctionnelles étendues. Nous avons identifié 42 protéines associées aux activités du système du complément et à la coagulation (CAC) dont les abondances additionnées sont incluses comme score CAC pour chaque échantillon UP dans (fichier supplémentaire 3: Tableau A3). Le système du complément contribue à la réponse en phase aiguë et à l’immunité innée, et les composants distincts sont pro ou anti-inflammatoires. Un composant central est le composant de complément C3. La C3 mûrit en opsonine C3b et en anaphylatoxine C3a et est sécrétée dans le plasma sanguin et les voies urinaires après production dans les cellules tubulaires rénales. Le C3 joue un rôle dans l’infection des voies urinaires supérieures et l’absorption et la quiescence de l’UPEC dans les cellules uroépithéliales éventuellement associées au problème clinique des infections urinaires récurrentes. Même si les quantités de protéines liées aux activités du complément et à la coagulation n’étaient pas aussi élevées en protéines neutrophiles, l’analyse HCLSO a généré deux groupes d’échantillons, adjacents dans l’arbre et avec un nombre total de 12 échantillons, caractérisés par une abondance relativement élevée de ces protéines (les groupes CAC de la figure 1). Les grappes de CAC ont révélé un faible nombre de cas avec un ID pour un agent pathogène (3 sur 12). Les scores de CAC ont été tracés dans la figure 2 représentée par les segments de barre rouge de chaque échantillon (colonne). Des quantités globales élevées de protéines CAC n’étaient pas bien corrélées avec des quantités élevées de protéines neutrophiles, ce qui suggère que les activités inflammatoires médiées par le système du complément (par exemple, C3 et C4) et la coagulation (par exemple, le fibrinogène) peuvent être régulées séparément lors d’une invasion d’agents pathogènes ou d’autres stress auxquels les voies urinaires ont été exposées chez les patients. Des quantités élevées de protéines CAC et ERY ont été plus fréquemment observées en tandem. De nombreuses protéines de coagulation et de complément sont en effet abondantes dans le plasma sanguin. Ce liquide corporel s’écoule dans la lumière des voies urinaires lors d’une lésion vasculaire. Les tests d’analyse d’urine équivalents à la mesure des scores CAC sont rarement utilisés dans les laboratoires cliniques.

Précipitation des sels d’acide urique et des profils protéomiques des sédiments urinaires associés

L’inspection visuelle des 12 échantillons UP dans les grappes de CAC a révélé que neuf échantillons d’urine étaient très troubles et dix pastilles d’urine relativement grosses avec une coloration rose à brun clair. Ces caractéristiques ont été liées à des niveaux élevés de saturation en acide urique et à la précipitation de sels d’acide urique, en particulier à un pH inférieur à 6, dans l’urine. La précipitation de l’acide urique peut être un état précurseur de la formation de calculs urinaires. Il est raisonnable de supposer que l’aspect trouble des échantillons a contribué à identifier par erreur les précipités comme des bactéries au cours de la microscopie. Un seul dossier clinique était disponible signalant l’apparition de calculs rénaux (GV_64). Bien que le profil protéomique de ce patient ne fasse pas partie du cluster CAC, les caractéristiques visuelles de l’échantillon indiquaient également une turbidité et une couleur de granule d’urine rose à brun clair. Nous supposons que des protéines relativement abondantes dans la fraction soluble de l’urine se lient aux précipités de sel et contribuent donc à des profils d’abondance de protéines distincts dans les échantillons UP respectifs. En effet, les protéines généralement solubles dans l’urine et normalement de faible abondance dans les pastilles urinaires ont été augmentées en abondance dans certains échantillons de grappes de CAC par rapport à un témoin sans preuve d’infection urinaire et de précipités salins (LG_21). Des exemples de telles protéines sont la chaîne γ des IgG, l’AMBP (bikunine) et la chaîne γ du fibrinogène, comme le montre la figure 4. L’abondance des protéines défensine-1 et des sous-unités HBA1 et HBD de l’hémoglobine a été la plus fortement augmentée par rapport aux données pour LG_21. Bien que la plupart des protéines présentées dans la figure 4 soient connues pour être augmentées dans l’urine et le plasma en raison d’une lésion locale et contribuent à la réponse en phase aiguë, ces données ont montré une grande variabilité quantitative. La signification pathologique, en particulier les lésions des voies urinaires, ne peut être déduite de ces données. Des profils protéomiques ont été récemment rapportés pour la matrice de calculs urinaires. Parmi les protéines les plus fréquemment observées dans la matrice de pierre figuraient les chaînes lourdes d’IgG, les sous-unités de fibrinogène, le S100-A8, le lysozyme C et le LTF, protéines également représentées dans le graphique de la figure 4. Des investigations supplémentaires sont nécessaires pour évaluer la valeur de l’analyse protéomique afin d’identifier des biomarqueurs à partir d’échantillons d’urine contenant des précipités de sel d’urine, par exemple pour évaluer le risque de formation de calculs rénaux.

Abondance de protéines sélectionnées dans des échantillons avec des preuves de précipitation de sel dans l’urine. Les échantillons UP commençant par nm_ (pas de microbes) n’ont pas montré de traces de colonisation bactérienne, mais les sédiments urinaires avaient un aspect visuel suggérant des précipités de sel d’acide urique et étaient présents dans deux amas de CAC. LG_21 (Lactobacille) représentait l’absence d’inflammation. Le patient associé à l’échantillon GV_64 (G. vaginalis) a reçu un diagnostic de calculs rénaux. En plus des protéines décrites dans la légende de la figure 3, d’autres sont le composant du complément C3 (C3), la céruloplasmine (CP), l’inhibiteur de l’activateur du plasminogène-3 (PAI-3), l’AMBP (bikunin), la sous-unité δ de l’hémoglobine (HBD) et la chaîne γ de l’immunoglobuline (Ig gamma). Toutes ces protéines sont impliquées dans la réponse en phase aiguë, qui est généralement initiée par une lésion tissulaire et une invasion d’agents pathogènes. Les profils d’échantillons montrent une grande variabilité des quantités de protéines, bien que les protéines de phase aiguë distinctes aient été augmentées par rapport au témoin LG_21 dans certains échantillons.

La colonisation urétrale par des bactéries commensales ne déclenchant pas les réponses immunitaires de l’hôte

Des technologies de séquençage de l’ADN hautement parallèles ont révélé que l’urine n’est pas complètement stérile et que la notion de microbiome urinaire a évolué en tant que sujet de recherche intéressant. Il est probable que les parties externes de l’urètre, en particulier chez les femmes, soient colonisées par des bactéries provenant de sources périnéales et vaginales. Il est également évident que la collecte sous-optimale d’urine de capture propre de patientes peut entraîner la contamination de l’urine par des protéines et des bactéries commensales de la cavité vaginale. Les données présentées ici peuvent être expliquées par, mais ne distinguent pas les deux scénarios susmentionnés. Environ 25% des profils de protéomes urinaires obtenus dans cette étude ont été enrichis en protéines sécrétées dans l’urine dans un milieu physiologiquement normal (p. ex. uromoduline et cytokératines) ou produites en abondance par des cellules épithéliales rejetées par les surfaces muqueuses tapissant les voies urinaires et vaginales. L’analyse HCLSO a identifié quatre groupes (figure 1), un grand groupe avec 15 échantillons UP, provenant de patientes à deux exceptions près seulement. Les profils ont révélé une abondance élevée de protéines cytosquelettiques (p. ex. α-actines et annexines), de protéines desmosomiques (p. ex. desmoplakine et périplakine) et de protéines de l’enveloppe cellulaire cornifiée (p. ex. cytokératines, cornuline et protéine 3 riche en petites prolines). Les protéines appartenant aux deux premières catégories sont présentes dans la plupart des types cellulaires, y compris les cellules urothéliales, tandis que l’épithélium squameux stratifié situé dans le méat urétral et le tractus vaginal produit abondamment des protéines de toutes ces catégories. L’examen microscopique des sédiments urinaires a confirmé l’augmentation du contenu des cellules épithéliales squameuses avec des scores ≥ 2+ pour la plupart des échantillons présents dans les quatre amas (fichier supplémentaire 3: tableau A3), appelés amas d’uromoduline et de cellules épithéliales squameuses avec bactéries vaginales (USEV) à partir d’ici. L’uromoduline, une protéine contribuant à l’équilibre eau / électrolyte dans les voies urinaires, était également abondante dans les échantillons du cluster USEV. Des bactéries vaginales (Lactobacillus et G. vaginalis) ont été identifiées dans 22 des 30 échantillons, et des bactéries étaient absentes dans 5 de ces échantillons. Les données protéomiques ont confirmé un très faible niveau d’inflammation pour les clusters USEV dans 74% des cas selon les scores NAD, comme le montrent les positions des échantillons dans le graphique de la figure 2. Un profil représentatif du cluster USEV est le LG-23, avec un score NAD de 20% et une faible abondance de protéines associées à l’inflammation, à l’exception de la défensine-1 et de la S100A8 (Figure 3). Par rapport aux profils de SA_112 et PM_20, toutes les protéines contribuant à l’inflammation étaient moins abondantes dans LG_23. G. vaginalis peut être un agent pathogène opportuniste dans les voies urinaires et vaginales. Le regroupement des profils de protéines hôtes dans les clusters USEV, sélectionnés pour les ID de Lactobacillus, G. vaginalis, ou des deux espèces, a indiqué l’absence d’une forte réponse immunitaire envers ces espèces bactériennes. Nous concluons que l’analyse protéomique a une valeur diagnostique en fournissant des preuves de l’absence d’infection dans le tractus urogénital des femmes.

Colonisation urétrale par des agents pathogènes opportunistes

Les clusters USEV comprenaient trois cas où des agents pathogènes communs des voies urinaires ont été identifiés, UPEC et K. pneumoniae. Les deux cas (EC_13 et KP_55) présentaient de faibles scores NAD et ERY, ce qui était en accord avec l’absence d’inflammation déclenchée par les neutrophiles et de lésion vasculaire. Les abondances relatives des protéines présentées à la figure 3 pour ces deux cas et leur similitude avec le schéma observé pour LG_23 ont soutenu l’idée que les réponses immunitaires caractéristiques des infections urinaires n’ont pas été déclenchées lors de la colonisation par les bactéries. La question de savoir si les cas représentent une bactériurie asymptomatique (ASB) ne peut pas être évaluée en raison du manque de connaissances sur les réponses immunitaires au niveau moléculaire de l’ASB. En résumé, ces données soutiennent l’idée que les profils protéomiques peuvent identifier des cas de colonisation urétrale par des uropathogènes sans activation du système immunitaire inné.

Contamination vaginale avec des signes d’infections urogénitales

L’analyse HCLSO a généré un groupe d’échantillons UP que nous avons appelé le groupe de contamination vaginale (VCO), illustré à la figure 1. Les profils de grappes de VCO présentaient une abondance élevée de protéines de l’enveloppe des cellules cytosquelettiques, desmosomiques et cornées, mais des quantités d’uromoduline faibles ou modérées, suggérant que la teneur en protéines vaginales était augmentée dans ces échantillons. Le score VCO, un rapport quantitatif de cinq protéines exprimées dans le tissu épithélial cervicovaginal avec une spécificité relativement élevée selon la base de données TiGER par rapport à l’uromoduline a été calculé. Ces protéines étaient la corniféline, la cornuline, la serpine B3, la galectine-7 et la protéoglycane mucine-5B. Les molécules pro-inflammatoires spécifiques aux neutrophiles telles que la protéine S100-A12 et le lysozyme (LYZ) et les protéines indiquant ou répondant à une lésion vasculaire (HBA1 et fibrinogène-β, respectivement) étaient plus abondantes dans le cluster VCO que dans le cluster USEv, comme le montre KP_10 par rapport à LG_23 sur la figure 3. Le cluster VCO contenait 14 échantillons, tous sauf un provenant de patientes, dont la moitié étaient associés à un ID pour un uropathogène. Dans cinq échantillons, G. vaginalis ou Lactobacillus a été identifié. Les preuves cliniques suggéraient des saignements vaginaux pour la patiente se rapportant à l’échantillon KP_10, étayant le diagnostic d’une infection urogénitale ou vaginale par K. pneumoniae. Les scores VCO sont inclus dans le fichier supplémentaire 3 : Tableau A3. Un test de somme de rang de Wilcoxon comparant les scores VCO des clusters VCO et USEV a donné une valeur p de 0,017, suggérant que le score est utile pour discerner aucune contamination vaginale majeure ou mineure dans les échantillons d’urine. Aucune évaluation claire ne peut être faite quant à l’utilité du score VCO pour distinguer une infection urinaire d’une infection vaginale.

L’analyse protéomique des sédiments urinaires identifie des microbes avec des niveaux de sensibilité et de spécificité comparables à ceux de la culture d’urine

Nous avons identifié des bactéries provenant de 76 échantillons UP et des Candida albicans provenant d’un échantillon UP (63% de tous les cas analysés). Des cultures d’urine ont été réalisées dans seulement 55 cas, dont 44 % ont identifié au moins un agent pathogène, 24 % des organismes commensaux et 17 % n’ont montré aucune croissance microbienne (fichier supplémentaire 3: Tableau A3). Dans le contexte de l’identification des agents pathogènes, les données protéomiques et les résultats de l’UC n’étaient pas toujours en accord (tableau 1). Plusieurs raisons semblent contribuer aux désaccords. Les défis de l’interprétation des données métaprotéomiques basées sur les protéines microbiennes identifiées suivent. Premièrement, les ID de protéines pour les uropathogènes moins courants peuvent être manqués en raison de l’absence de leurs séquences protéiques dans la base de données recherchée. Les espèces bactériennes représentées dans la base de données ont été identifiées par analyse protéomique (K. pneumoniae et E. faecalis) dans deux cas, mais les données UC suggèrent la présence des espèces proches phylogénétiquement Enterobacter aerogenes et E. faecium, respectivement. Deuxièmement, les organismes microbiens présents en faible abondance dans l’urine sont plus difficiles à identifier en présence de microbes très abondants, en particulier si les espèces microbiennes partagent une identité de séquence étendue parmi les protéines orthologues. Les profils EC_85 et KP_11 dans (Fichier supplémentaire 5 : Jeu de données A1) illustrent ce problème, et concernent en particulier la famille des Enterobacteriaceae qui sont à l’origine de la majorité de toutes les infections urinaires. Annotations génomiques inexactes, p.ex. les gènes manquants, pour une espèce (présents dans l’échantillon UP) entraînent l’identification de protéines orthologues correctement annotées dans le génome d’une espèce apparentée (mais absentes dans l’échantillon UP). De petits peptides tryptiques sont identifiés dans une analyse protéomique de fusil de chasse, ce qui rend les affectations de protéines incorrectes par l’algorithme de recherche plus probables en cas d’identité hautement séquentielle. Troisièmement, l’ID des bactéries présentes dans de faibles comptes dans l’urine, moins de ~ 10 000 cellules / mL, combinée à un fond protéomique élevé de l’hôte peut être omise parce que les protéines hôtes et microbiennes ne sont pas analysées séparément par LC-MS / MS. Les faibles comptes d’UFC pour les organismes bactériens selon les données de l’UC ont montré un taux de correspondance plus faible avec les ID protéomiques que les comptes élevés d’UFC (fichier supplémentaire 3: Tableau A3). En revanche, les identifications protéomiques des microbes présentent l’avantage d’être indépendantes de la culture et de fournir des informations sur la virulence, la résistance aux antibiotiques, le stress rencontré et l’état de croissance des agents pathogènes identifiés. Deux exemples révélant de telles données complètes sont fournis dans (Fichier supplémentaire 5: Jeu de données A1). Dans un ensemble de données (EC_85), les protéines d’UPEC, de G. vaginalis et de Lactobacillus ont été profilées. Dans l’autre ensemble de données (KP_11), la cause de l’infection urinaire était K. pneumoniae. Le tableau 1 donne un aperçu de la comparaison du test des nitrites, de l’identification des entérobactéries dans l’urine en fonction de leur capacité à réduire les nitrates et des résultats de l’UC avec les données protéomiques. 90% des tests positifs au nitrite concernaient en effet des cas de bactériurie avec UPEC ou K. pneumoniae comme agent causal, et étaient invariablement identifiés avec les méthodes protéomique et UC également. Contrairement à l’analyse protéomique, les tests de nitrites semblent ne pas être suffisamment sensibles pour identifier les entérobactéries dans dix cas. Les tests de nitrites n’ont pas été positifs dans 21 cas où l’ID des analyses protéomiques était G. vaginalis. En ce qui concerne les différences d’identification des agents pathogènes par les méthodes protéomiques par rapport aux méthodes UC, les streptocoques β-hémolytiques ont été identifiés par des expériences UC dans trois cas, tandis que les données protéomiques suggéraient la présence de G. vaginalis. Comme le montre le tableau 1, le nombre d’ID correspondantes pour l’UPEC et, dans une moindre mesure, pour K. pneumoniae, était élevé. En résumé, la méthode protéomique a démontré une sensibilité plus élevée que le test au nitrite et des niveaux de sensibilité et de spécificité comparables à ceux de l’UC. Un fond protéomique élevé de l’hôte dans un échantillon d’urine diminue la sensibilité à l’identification microbienne.