Génomique comparative de Clostridium bolteae et Clostridium clostridioforme révèle des propriétés génomiques spécifiques à l’espèce et de nombreux déterminants de résistance aux antibiotiques putatifs

Les caractéristiques générales des génomes révèlent des variations intra et interspécifiques

Un total de 1 à 21 les contigs ont été générés par l’assemblage de lectures d’Illumina (couverture de 134 à 185 fois) pour les six souches de C. bolteae (tableau 1). Un total de 10 à 48 contigs ont été générés (couverture de 82 à 264 fois) pour les six souches de C. clostridioforme. La taille totale du génome variait entre les espèces et les souches. La taille de C. bolteae variait de 6159 kb pour la souche 90A7 à 6480 kb pour la souche 90B3 avec 5833 et 6059 séquences codantes de l’ADN (CDSS), respectivement, et quatre gènes de l’ARNr 16S. La taille du génome de C. clostridioforme était plus petite, de 5467 kb pour la souche 90A3 à 5970 kb pour la souche 90A6 avec 5231 à 5916 CDSs, respectivement, et quatre gènes d’ARNr 16S. L’arbre phylogénétique basé sur les séquences d’ARNr 16S a montré que les C. bolteae et C. clostridioforme étudiés étaient étroitement liés aux C. hathewayi, C. aldenense, C. citroniae, C. saccharolyticum et C. symbiosum, membres de l’amas de Clostridium XIVa de Firmicutes, comme indiqué précédemment (données non présentées).

Les génomes de C. bolteae et de C. clostridioforme sont de grands génomes, où la redondance génétique est prédominante (données non présentées). Les gènes redondants étaient impliqués dans diverses voies métaboliques, notamment le métabolisme du carbone, le transport, le métabolisme du fer et la biosynthèse des acides aminés. Les différences dans le nombre de CDSS entre les génomes reflétaient davantage la variation de la redondance génétique que le gain ou la perte de fonctions particulières. De plus, les génomes ont intégré des éléments mobiles c’est-à-dire des transposons, des Séquences d’insertion, des plasmides ou des phages (intégrase, protéine de capside,…) indicatifs de transferts de gènes latéraux. Certains d’entre eux portaient des gènes de résistance aux antimicrobiens (voir ci-dessous).

Pour examiner le pangénome des deux espèces, nous avons comparé les 97 210 CDSs obtenus à partir des 12 génomes nouvellement séquencés avec ceux de cinq autres génomes (C. bolteae BAA613, C. bolteae WAL-14578, C. clostridioforme CM201.1, C. clostridioforme 2149FAA.1, et C. clostridioforme WAL-7855). Tous les CDSS ont été regroupés à l’aide de l’algorithme BlastClust à haute rigueur, au-dessus d’une coupure d’identité de séquence de 90% et d’un chevauchement de longueur de 90%. Un total de 10 530 grappes ont été trouvées. Seulement 2294 grappes (21,78 %) étaient partagées par les deux espèces.

En utilisant uniquement des génomes nouvellement séquencés, nous avons estimé le génome central (espèce) et les gènes (spécifiques à la souche) des six C. bolteae et des six C. clostridioforme (tableau 1). Un total de 3714 gènes ont formé le génome central de C. bolteae. Le nombre de gènes spécifiques à la souche chez cette espèce variait de 73 à 846. Chez C. clostridioforme, 3660 gènes ont défini le génome central. Un total de 2409 grappes ont été partagées par les deux espèces; 1305 gènes étaient spécifiques de C. bolteae et 1251 de C. clostridioforme.

C. les bolteae 90A7 et 90B8 possédaient le plus grand nombre de gènes uniques pour cette espèce (735 et 846, respectivement). C. clostridioforme 90A8, avec 1006 gènes uniques (17%) avait le plus grand nombre de gènes spécifiques à la souche dans cette étude. Ces souches intégraient un nombre élevé d’éléments mobiles. Certains CDSS uniques ont été annotés en tant que transporteurs ou régulateurs. Peu d’entre eux étaient impliqués dans des mécanismes de défense (gènes de résistance aux antimicrobiens..) ou des voies métaboliques. La plupart d’entre eux, souvent entourés de CDSS provenant de phages ou de transposons, avaient des fonctions inconnues (données non représentées).

Différences fonctionnelles entre les espèces dans les génomes du noyau

Le défi de notre étude était de fournir des informations fiables à partir de génomes provisoires. Par conséquent, nous avons concentré notre analyse sur les génomes du noyau. La classification des CDSs selon le système des Grappes de Groupes Orthologues (COGs) a permis de donner un aperçu des fonctions affichées par les deux espèces. Les génomes de base de C. bolteae et C. les clostridioformes ont été enrichis (plus de 7% du nombre total de COG appariés) dans les catégories de COG K, E, G et R par rapport à la transcription (309 et 290 CDSs), au transport et au métabolisme des acides aminés (335 et 276 CDSs), au transport et au métabolisme des glucides (431 et 425 CDSs) et à la prédiction générale des fonctions (366 et 331 CDSS) (Tableau 2).

Tandis que C. bolteae et C. les clostridioformes sont apparentés phénotypiquement, le modèle de fonctions obtenu par changement d’annotation de COG diffère entre les deux espèces (tableau 2). 30 CDSS supplémentaires des catégories Transport et métabolisme des nucléotides (F), 97 CDSs des catégories Transport et métabolisme des acides aminés (E) et 79 CDSs codant pour les mécanismes de transduction du signal (T) étaient spécifiques de C. bolteae. 40 CDSs codant pour la biogenèse de la paroi cellulaire/membrane /enveloppe (M), 50 CDSs pour la réplication, la recombinaison et la réparation (L) et 18 CDSs pour les catégories de transport et de métabolisme des lipides (I) étaient spécifiques pour C. clostridioforme. Les différences entre les voies métaboliques de C. clostridioforme et de C. bolteae semblent être suffisamment importantes pour soutenir la délimitation de l’espèce.

Parmi les voies glucidiques, C. bolteae et C. clostridioforme abritaient différents systèmes d’assimilation du lactose, qui diffèrent par leurs états de phosphorylation, leurs métabolites intermédiaires et leur bioénergétique (fichier supplémentaire 1: Tableau S1). Des gènes codant pour une β-galactosidase, qui hydrolyse le lactose donnant du glucose et du galactose, ont été trouvés chez les deux espèces. Une autre voie catabolique du lactose, le système phosphotransférase dépendant du lactose/cellobiose (lac/cell-PTS) a été trouvée dans presque tous les génomes de C. bolteae. L’opéron lac/cell-PTS, précédemment décrit dans C. acetobutylicum, est constitué de gènes de la 6-phospho-β-galactosidase, de la phosphoglycérate mutase et de l’agent antiterminateur transcriptionnel de l’opéron lichenan et de deux copies de gènes des composants de la famille du lactose/cellobiose IIC, IIB et IIA. Par un tel système, le lactose est phosphorylé au niveau du carbone en C-6 et le lactose 6-phosphate internalisé est dégradé en galactose 6-phosphate et en glucose par la 6-phospho-β-galactosidase. De plus, le gène de la 6-phospho-β-galactosidase et les gènes des composants de la famille lactose/cellobiose manquaient chez C. bolteae 90A7. Il est probable que ce système, inductible par le cellobiose ou le lactose et régulé par plusieurs répresseurs (décrits chez d’autres bactéries à Gram positif) explique le phénotype lactose négatif chez C. bolteae. En utilisant notre système d’annotation, nous avons détecté un répresseur d’opérons de galactose (GalR) parmi les régulateurs de la famille des lacI, chez C. clostridioforme (tous, sauf 90A8), mais pas chez C. bolteae. Des expériences en laboratoire sont nécessaires pour déterminer comment les facteurs de transcription des deux espèces influencent les préférences dans l’utilisation de certains glucides par rapport aux autres.

D’autres caractéristiques distinctives entre les deux espèces étaient les CDSS codant pour la biosynthèse, le transport et le catabolisme des métabolites secondaires qui n’ont été trouvés que chez C. bolteae (tableau 2).

Fait intéressant, le nombre de gènes de la catégorie de motilité et de sécrétion cellulaire (N) (34 et 18 CDSs) était différent entre les deux espèces. Parmi eux, nous avons trouvé des CDSs codant pour la motilité des flagelles reconnus comme des facteurs de virulence essentiels pour la plupart des agents pathogènes mobiles. Au total, vingt-quatre gènes (46 grappes + 3 orphelins) représentaient l’opéron flagellaire dans les génomes de C. bolteae. Parmi eux, les gènes de la flagelline (fliC) et de la coiffe flagellaire (fliD), l’une des multiples adhésifs de surface cellulaire de la bactérie, ont révélé une spécificité de cluster et une microévolution. Les gènes codant pour fliD ont été représentés par un groupe et deux gènes supplémentaires chez C. bolteae 90A7 et 90B8. Les séquences FliC de C. bolteae 90A9, 90B3 et 90B8 formaient un groupe, celles de 90A5 et 90B7 groupées dans un autre groupe, et les séquences de C. bolteae 90A7 sont restées orphelines (gènes uniques) après le regroupement (Fig. 1). Ils étaient étroitement liés aux séquences de flagellines de C. citroniae et de C. hathewayi, d’autres Clostridium spp. du groupe XIVa, isolé occasionnellement d’infections humaines. En outre, C. les bolteae 90A9 et 90B3 partageaient un deuxième opéron de seulement 19 gènes dans syntheny, y compris un gène de flagelline (flaA) étroitement apparenté à ceux de C. clostridioforme (identité de 63 %). Sur la base des résidus conservés L87, Q88, R89 et Q96 critiques pour la signalisation TLR5 et la polymérisation des flagellines, ces protéines ont été prédites pour avoir des propriétés pro-inflammatoires. Chez C. clostridioforme, vingt gènes (57 autres amas) organisés en un seul opéron codaient l’appareil flagellaire. Séquences FlaA de C. clostridioforme appartenait à un groupe phylogénétique étroitement lié aux séquences de flagellines d’Eubacterium cellulosovens isolées du rumen. Dans l’ensemble, les gènes des flagellines et l’organisation des loci liés aux flagelles étaient différents d’une espèce à l’autre (fichier supplémentaire 2: Tableau S2 et fichier supplémentaire 3: Tableau S3), ce qui suggère que la motilité, la chimiotaxie et l’apparition d’interactions potentielles avec la muqueuse du côlon sont spécifiques à l’espèce.

Arbre phylogénétique basé sur la distance des gènes de flagelline. Les valeurs aux nœuds correspondaient aux pourcentages d’amorçage obtenus à partir d’arbres phylogénétiques basés sur des alignements de séquences multiples par ClustalW, Tcoffee ou Promals, respectivement. Les noms de gènes et les numéros d’orphelin ou de cluster ont été indiqués

Différences entre espèces dans les voies de synthèse du butyrate

La comparaison des séquences du génome entier a révélé que les voies de synthèse du butyrate, qui jouent un rôle clé dans la santé du côlon chez l’homme, étaient présentes chez C. bolteae et C. clostridioforme.

Les deux espèces étaient productrices de butyrate de manières différentes et complémentaires (Fig. 2, Fichier supplémentaire 4 : Tableau S4). Tous les C. clostridioformes, à l’exception de 90A8, portaient un locus codant pour la voie Acétyl-CoA (de l’Acétyl-CoA au butyryl-COA), y compris les gènes de la bêta-hydroxylbutyrylCoA déshydrogénase (hbd), de la thiolase (thl), de la crotonase (cro), de la butyryl-COA déshydrogénase (bcd) et de deux protéines de transfert d’électrons (ETF alpha, ETF bêta) (fichier supplémentaire 4 : Tableau S4). Seulement, C. bolteae 90A8 et C. clostridioforme 2149FAA.1 contenait un autre bcd putatif (74.9% d’identité) dans leurs génomes (données non présentées). La composition et la disposition des locus étaient similaires à celles de Faecalibacterium prausnitzii, un important producteur de butyrate du gros intestin humain. La voie acétyl-CoA n’a pas été trouvée chez C. bolteae. Les deux espèces partageaient des gènes pour les deux hydroxy-glutaryl-COA déshydrogénase (HgCoAd) et la glutaconyl-Coa décarboxylase (Gcd) de la voie du Glutarate qui peut conduire au crotonyl CoA et au butyryl-CoA via les gènes bcd.

Différentes voies de synthèse du butyrate potentiellement présentes dans les génomes de C. clostridioforme et de C. bolteae. En traits pleins : chez C. bolteae et C. clostridioforme; En traits pointillés gras : uniquement chez C. clostridioforme; En traits pointillés fins : uniquement chez C. bolteae 90A5 et 90B7 (pour plus de détails, voir Fichier supplémentaire 4 : Tableau S4). Les gènes (noms de protéines) sont affichés. Ato, Acétyl-Coa acétyltransférase; Bcd, butyryl-Coa déshydrogénase; Buk, butyrate kinase; But, Butyrate-acétoacétate CoA-transférase; Cro, crotonase ; Etf, protéine de transfert d’électrons; Gcd, glutaconyl-Coa décarboxylase; Hbd, Acétoacétyl-Coa réductase; 4Hbt, 4-hydroxybutyrate Coa transférase; HgCoAd, 3-hydroxybutyryl-Coa déshydrogénase; Ptb, phosphate butyryltranférase; Thl, thiolase

La conversion finale du butyryl-CoA en butyrate peut être effectuée par la butyrate kinase (buk) et la phosphotransbutyrylase (ptb) présentes chez les deux espèces (Fichier supplémentaire 4 : Tableau S4). Le groupe de séquences buk de C. clostridioforme s’est ramifié au voisinage de la séquence buk de C. citroniae sur l’arbre phylogénétique (Fichier supplémentaire 5: Figure S1). Les séquences Buk de C. bolteae ont formé des groupes et des séquences monophylétiques distincts répartis entre les arbres phylogénétiques, suggérant un polymorphisme et/ou des variations fonctionnelles de l’enzyme chez cette espèce. D’autres gènes des transférases de la voie de la lysine (sous-unités ato-alpha et bêta; mais-acétate Coa transférase), détectés près du locus butyrate dans six génomes de C. clostridioforme, peuvent être impliqués comme enzymes finales. Les gènes de la voie du 4-aminobutyrate (4hbt) peuvent être une autre alternative pour l’étape terminale en C. bolteae 90A5, 90B7, WAL14578 et BAA613.

La butyryl-CoA : acétate Coa-transférase (but) de la voie acétyl-CoA, dernière étape de la production de butyrate prédominante chez Clostridium XIVa, n’a été trouvée ni dans les génomes du tronc commun ni dans les génomes du C. bolteae étudié. Dans l’intestin humain, des études antérieures sur des isolats du côlon d’individus en bonne santé l’ont montré, mais la voie prédomine. D’autres études sont nécessaires pour évaluer l’impact de la production de butyrate par la voie du Glutarate sur la santé des cellules coliques, en particulier dans l’autisme où C. les bolteae sont surabondantes.

Identification des déterminants de la résistance aux antibiotiques

Les gènes de résistance aux médicaments qui n’avaient pas été reconnus par annotation automatisée ont été identifiés par des recherches sur les séquences d’homologie sur ARDB. Les gènes de résistance ont été prédits sur une valeur allant jusqu’à 40% d’identité (50% de substitutions positives) sur 70% de longueur au-dessus de la valeur de coupure habituellement recommandée (voir la liste dans le tableau 3). Ensuite, le contenu génétique et l’organisation génétique des loci de résistance microbienne des six C. bolteae et des six C. clostridioforme ont été comparés aux données précédentes obtenues à partir de C. clostridioforme CM201.1 dans notre laboratoire.

Étant donné que les prédictions basées sur les séquences peuvent potentiellement identifier des déterminants qui ne conduisent pas à une résistance aux antimicrobiens, des tests de sensibilité ont été effectués pour obtenir des informations sur la réponse prévue des bactéries aux antibiotiques. Les souches incluses dans cette étude ont montré des profils de résistance, y compris l’ampicilline, les macrolides, la lincomycine et les quinolones, maintenant courantes chez les anaérobies (tableau 4). Les données génomiques (CDSS et annotations) et les tests de sensibilité phénotypiques ont été pris en compte pour identifier les déterminants de la résistance aux antibiotiques (tableaux 3 et 4). Des essais préliminaires de clonage de certains gènes ont également été réalisés afin de vérifier leur capacité à conférer une résistance aux antibiotiques (voir ci-dessous).

Gènes de résistance aux antibiotiques utilisés pour le traitement des infections anaérobies

Au total, 76 grappes et 21 gènes spécifiques à une souche potentiellement impliqués dans la résistance aux antimicrobiens ont été identifiés (tableau 3). Il est inclus de 42 à 50 CDSs chez C. bolteae et de 48 à 58 CDSs chez C. clostridioforme. De 27 à 42 CDSS par génomes étaient liés aux mécanismes de résistance aux bêta-lactames, aux glycopeptides, aux macrolides, aux lincosamides et au métronidazole.

Sept grappes impliquées dans la résistance aux bêta-lactames sont partagées ou font partie du génome central des deux espèces (Fig. 3). Trois types de bêta-lactamases, dont la bêta-lactamase de classe A, la bêta-lactamase de classe C, la bêta-lactamase de classe D et plusieurs métallo-enzymes ont été reconnus dans les douze génomes. Toutes les souches étudiées, sélectionnées pour leur résistance à l’ampicilline, partageaient le gène blaCLO1, précédemment trouvé chez C. clostridioforme CM201.1 (inédit), mais la structure de l’élément conjugué intégratif (ICE) observée chez CM201.1 n’a pas été retrouvée dans les nouveaux génomes séquencés. Le gène blaCLO1 confère une résistance aux aminopénicillines et aux carboxypénicillines chez E. coli, et son activité est inhibée par le clavulanate et le sulbactam. Neuf changements d’acides aminés ont été observés dans les bêta-lactamases de C. bolteae 90A9, 90B3 et 90A8. Cette bêta-lactamase étroitement apparentée était flanquée de séquences d’insertion (IS66) et d’un gène putatif pour la bêta-lactamase de classe D (COG 2602) également décrit dans Clostridium sp M62/1 de la microflore intestinale humaine (projet HMP). Les gènes des bêta-lactamases de classe C, précédemment trouvés dans les chromosomes des bactéries entériques (COG2680), étaient également présents dans C. bolteae et C. clostridioforme.

Distribution des gènes de résistance aux antibiotiques partagés entre et au sein du noyau de C. bolteae et C. clostridioforme. Les gènes chevauchant au moins 90% de longueur et 90% de similitude ont été considérés comme des homologues. Les gènes de résistance ont été prédits sur une valeur allant jusqu’à 40% d’identité (50% de substitutions positives) sur 70% de longueur par recherche de séquences d’homologie sur ARDB. Pour tous les C. clostridioforme et certains C. bolteae 23S ARNr méthyltransférase de type Cfr

Un nombre élevé de gènes prédits (32 CDSS) étaient impliqués dans la résistance aux glycopeptides (fichier supplémentaire 6: Figure S2). C. clostridioforme 90A8 était la souche unique avec tous les gènes requis pour la résistance aux glycopeptides en accord avec le phénotype (CMI > 256 mg/l). La résistance à la vancomycine dans cette souche a été attribuée à un opéron de type VanB porté par un élément de type Tn1549. Malheureusement, une délétion de dix nucléotides dans le gène de la relaxase du Tn1549 conduit à l’incapacité du 90A8 à transférer la résistance à la vancomycine in vitro. Les autres génomes de C. clostridioforme comprenaient une partie de l’opéron de résistance à la vancomycine de type VanD, mais le gène vanD de la ligase D-Ala-Lac a été perturbé par un codon stop conduisant à une protéine tronquée (fichier supplémentaire 6 : Figure S2). De plus, vanH et vanY, qui codent respectivement une D-lactate déshydrogénase et une DD carboxypeptidase, manquaient. De même, les génomes de C. les bolteae abritaient quatre CDSs, homologues de vanRG vanUG vanG vanYG, qui formaient un opéron incomplet et non fonctionnel en raison de l’absence d’un gène de la racémase sérine. Le nombre élevé de CDSs codant pour la résistance aux glycopeptides (y compris vanD ou vanG connus pour être chromosomiques et non transférables) trouvés dans les génomes de C. bolteae et de C. clostridioforme, suggère qu’ils font partie d’opérons entiers ancestraux, qui ont évolué en l’absence de pression sélective antibiotique. La présence d’opéron de van incomplet est intrigante, mais des observations similaires chez d’autres anaérobies vivant dans des microbiomes tels que Clostridium difficile 630 ou Ruminococcus spp., ont été signalés.

Des homologues du gène de l’adénylyltransférase conférant une résistance aux lincosamides étaient présents dans le génome central des deux espèces (Fig. 3). Les gènes LnuA de C. clostridioforme et de C. bolteae avaient une identité de 70 à 72 % avec les orthologues trouvés chez C. hathewayi et C. citroniae, respectivement. C. clostridioforme 90B1 et 90A6 abritaient un gène lnu supplémentaire (identité à 68% avec LnuA90A5), sans traces d’éléments mobiles. La résistance à la lincomycine est fréquente chez C. bolteae et C. clostridioforme, souvent associée à une résistance à la clindamycine. Les protéines LnuA des deux espèces présentaient 51 à 54% d’identité avec LnuA du Staphylocoque suggérant une fonctionnalité commune, mais le rôle des gènes lnu est difficile à établir en raison de la présence d’autres mécanismes putatifs. De même, toutes les souches étaient résistantes à l’érythromycine, alors que deux gènes homologues au gène de la ribosome méthylase de l’érythromycine, ermB, n’ont été prédits que dans les génomes de C. clostridioforme 90A4 et 90A8. La surexpression de pompes d’efflux multidrogues et de systèmes d’efflux spécifiques aux macrolides et à divers macrolides-Lincosamide-Streptogramine B, tels que MacB, MefA, VgaA, MsrA/MsrB et CcmA (Tableau 3, fichier supplémentaire 7: Figure S3), trouvés dans les génomes étudiés, peut entraîner une résistance aux macrolides et aux lincosamides. De plus, deux amas de CDSs codant pour les acétyltransférases xénobiotiques liées au VatB (identité de 48 %) ont été trouvés dans les génomes centraux de chacune des espèces (Fig. 3). La VatB inactive la virginiamycine, mais ici, la résistance n’a pas été détectée par des tests de sensibilité antimicrobienne (tableau 4).

Un groupe d’homologues CDSs des gènes de résistance au métronidazole (nim) a été détecté dans les génomes centraux des deux espèces, et le métronidazole était très actif sur les espèces étudiées. Chez Bacteroides fragilis, il a été démontré qu’une expression accrue des gènes nim en aval des éléments IS conduit à une résistance au métronidazole. En l’absence d’IS directement en amont des gènes nim, le mécanisme permettant de conférer une résistance au métronidazole à C. bolteae et C. clostridioforme reste à établir.

Observation inattendue de nouveaux gènes de résistance

En ce qui concerne d’autres résistances aux médicaments, les données génomiques ont révélé des gènes liés aux mécanismes de résistance au chloramphénicol et à la rifampicine (tableau 3). Dans la plupart des génomes de chaque espèce, nous avons trouvé des CDSs codant pour une chloramphénicol acétyltransférase du groupe A qui peut inactiver le chloramphénicol. Cependant, seuls C. bolteae 90B3 et 90B8 étaient résistants au chloramphénicol. Le génome de la souche 90B8 contenait une deuxième copie du gène cat porté par un transposon de type Tn4451 (identité à 96 et 90 % avec le Tn4451 et le Tn4453, respectivement). Le génome 90B3 contenait un homologue CDS au gène cfr codant pour une méthyl-transférase de l’ARNr 23S largement répandue dans les bactéries à Gram positif. Comme prévu, la souche 90B3 était également résistante au florfénicol, à la tiamuline et au linézolide (CMI = 16 mg/l). D’autres CDS d’ARNr 23S (de type Cfr) ont été détectés dans un environnement riche en éléments transposables (Tn 6103-6110-CTn4) dans les génomes de C. clostridioforme et de C. bolteae 90A5 et 90B7, mais la méthylation de l’ARNr ne semble pas affecter la sensibilité au chloramphénicol (Fig. 3).

L’analyse des données génomiques a permis de reconnaître des homologues CDSs aux gènes de la rifampine-ADP-ribosyltransférase (arr) chez C. bolteae mais pas chez C. clostridioforme. Aucun élément mobile ou trace d’éléments mobiles n’a été trouvé autour des gènes arr suggérant qu’ils étaient indigènes à cette espèce. Ces nouvelles séquences Arr se sont ramifiées au voisinage des protéines Arr de C. saccharoperbutylacetonicum et de certaines cyanobactéries de l’arbre phylogénétique (fichier supplémentaire 8 : Figure S4). Elles étaient distinctes des protéines Arr-2 des Enterobacteriaceae et des protéines Arr de Mycobacterium et Streptomyces spp.. Toutes les souches, à l’exception de la 90A7, étaient sensibles à la rifampicine. En l’absence de mutations dans la rpoB (connue pour être responsable de la résistance à la rifampicine), la résistance de C. bolteae 90A7 (CMI: 32 mg /l) était probablement due à une sélection positive de mutations dans aar Cbol90A7. La susceptibilité à la rifampine d’autres C. bolteae était probablement due à l’absence de promoteurs en amont de l’arr (tel que prédit par l’analyse in silico) ou à des substitutions de nucléotides dans l’arr entraînant un remplacement des acides aminés et une inactivation fonctionnelle (données non présentées).

En ce qui concerne la résistance de toutes les souches à la moxifloxacine et à la ciprofloxacine, toutes les souches de C. bolteae ont montré plusieurs substitutions dans la “région déterminante de la résistance aux quinolones” (QRDR) du gyrB. Nous n’avons pas trouvé de substitutions dans cette région pour le gyrA, ni décrit dans la protéine de la souche épidémique résistante aux quinolones, C. difficile 027. Par conséquent, le GyrB était probablement la cible préférée dans l’acquisition de la résistance aux quinolones chez ces deux espèces. De plus, plusieurs CDSs codant pour le transporteur membranaire interne AcrB étaient présents dans toutes les souches. Ces transporteurs font partie d’une pompe d’efflux multidrogue à division résistance-nodulation, connue pour augmenter l’efflux des quinolones chez certaines bactéries à Gram négatif. D’autres études sont nécessaires pour déterminer leur influence dans la perte de sensibilité de Clostridium spp. aux fluoroquinolones.

Dans l’ensemble, des profils de résistance similaires aux antibiotiques chez C. bolteae et C. clostridioforme peuvent résulter de divers mécanismes.

Gènes de résistance aux antibiotiques moins actifs ou inactifs contre Clostridium spp

Les génomes de C. bolteae et C.clostridioforme portait une ou deux copies du gène de l’undécaprényl pyrophosphate phosphatase bacA, et 2 à 5 copies des gènes de la pompe d’efflux, bcrA, impliqués dans la résistance à la bacitracine, en accord avec leur faible susceptibilité. Nous avons également trouvé un groupe de CDSs homologue au gène de la dihydrofolate réductase, dfrA20 (41% d’identité / 97% de longueur) de Pasteurella multocida dans le génome central des deux espèces qui pourrait expliquer la faible activité du triméthoprime sur nos Clostridium spp. . De plus, C. clostridioforme 90A6 abritait un CDS identique au dfrA d’Enterococcus faecium. Ce gène détecté dans un environnement riche en éléments mobiles est cohérent avec un nouvel exemple de transfert horizontal entre Enterococcus spp. et Clostridiales.

Fait intéressant, les génomes de C. bolteae ou de C. clostridioforme contenaient divers gènes de résistance aux antibiotiques naturellement inactifs chez ces espèces. Cinq CDSS étaient des homologues de gènes phosphorylés, acétylés ou adénylés aminoglycosides. Quatre de ces gènes de résistance putatifs ont été détectés dans un environnement d’éléments mobiles. Trois gènes, aadE, sat4 et aph(3′)-III, conférant respectivement une résistance à la streptothricine, à la streptomycine et à la kanamycine, ont été trouvés faisant partie d’un transposon délimité par deux copies IS1182 chez C. clostridioforme 90A3 (deux copies), 90A6 et 90B1. L’aph(3′)-III détecté était identique à l’aph(3′)-III, faisant partie du plasmide multirésistant PF856 d’E. faecium, également lié à un domaine interne (identité à 99%) d’un élément SSCmec de Staphylococcus aureus HT20040085. De même, le gène de l’aminoglycoside 6-adénylyltransférase ant(6′)-Ia conférant une résistance à la streptomycine était partagé par C. clostridioforme 90A1, 90A3 (2 exemplaires), 90A4, 90A6 (2 exemplaires) et C. bolteae 90A7. Le gène de l’adénylyltransférase aad(9′)-b qui médie la résistance à la streptomycine/spectinomycine a été trouvé chez C. bolteae 90B3. Deux copies de l’acétyl transférase aac(6′)-Im étaient également présentes dans le génome de C. clostridioforme 90B1. Des homologues de l’AAC(6′)-Im qui confère une résistance à la tobramycine et à l’amikacine ont également été trouvés chez E. coli (identité à 96%), Coprococcus sp, C. difficile et Enterococcus faecium (données non présentées). De plus, trois CDSS codant pour une aminoglycoside kinase (APH), connue pour être largement distribuée dans les bactéries à Gram positif, ont également été observés parmi toutes les souches.

De nombreux gènes de résistance à la tétracycline ont également été détectés chez C. bolteae et C. clostridioforme. Ils comprennent à la fois des gènes d’efflux tels que tet40 et des déterminants de la protection des ribosomes tels que tetO, tetW et tet32, précédemment signalés comme circulant dans la microflore intestinale parmi des bactéries apparentées à distance.