Hybridation des colonies
L’hybridation des colonies commence par la culture de colonies bactériennes peu peuplées sur une plaque de gélose nutritive. Ces colonies sont répliquées symétriquement sur un filtre à nitrocellulose par contact direct, après quoi les cellules de la membrane filtrante sont lysées et leur ADN est dénaturé, ce qui lui permet de se lier au filtre. Ces amas d’ADN sont ensuite hybridés à une sonde d’ARN ou d’ADN marquée radioactivement souhaitée (choisie spécifiquement au préalable) et criblés par autoradiographie. Les amas d’ADN qui présentent un gène souhaité sont ensuite mis en correspondance avec les colonies bactériennes (vivantes) correspondantes, qui peuvent être isolées pour une croissance et une expérimentation ultérieures.
Définition de l’hybridation des colonies: – L’hybridation des colonies est la “technique d’analyse par Blot” où les cellules bactériennes sont transférées du milieu nutritif solide au matériau absorbant. L’hybridation de colonies peut définir comme méthode d’isolement des séquences ou gènes d’ADN spécifiques des cellules bactériennes contenant de l’ADN hybride, au moyen d’un filtre à membrane de nitrocellulose. Le milieu de transfert subit ensuite plusieurs traitements chimiques et physiques.
Milieu de transfert de l’Hybridation des colonies : – Le papier filtre nitrocellulosique est le milieu de transfert de l’hybridation des colonies qui forme des répliques de la plaque maîtresse. La nitrocellulose agit comme une membrane qui contient les copies exactes du gène à celle de la plaque maîtresse. Le papier filtre à la nitrocellulose agit comme un “tampon buvard”.
L’hybridation des colonies implique les étapes suivantes :
Préparation de la plaque maîtresse:- Tout d’abord, inoculer la suspension de cellules bactériennes sur le milieu gélosé solide pour préparer la plaque maîtresse. Après l’inoculation, le nombre de colonies bactériennes se développera avec différents plasmides appelés “Plaque maîtresse ou plaque de référence”.
Formation de répliques sur un filtre à nitrocellulose: – Transférer ensuite les cellules bactériennes de la plaque maîtresse sur la membrane ou le filtre au moyen du “filtre à nitrocellulose”. Appuyez sur le papier filtre nitrocellulosique sur la surface de la plaque maîtresse. Cette compression de la membrane filtrante va former des répliques ou des copies des cellules bactériennes comme celle de la plaque maîtresse.
Traitement du milieu filtrant avec SDS: – Après cela, traiter le papier filtre nitrocellulosique avec le détergent comme le SDS (dodécylsulfate de sodium) pour lyser les cellules bactériennes.
Traitement du milieu filtrant avec un alcali: – Traiter le milieu filtrant avec l’alcali comme de l’hydroxyde de sodium afin de séparer l’ADN en brins simples.
Fixation de l’ADN sur le milieu filtrant:- Pour fixer l’ADN sur le papier filtre à la nitrocellulose, faites cuire le papier filtre à 80 degrés Celsius ou exposez-le à la lumière UV.
Ajout d’une sonde radioactive : – Hybrider le papier filtre nitrocellulosique contenant des empreintes de l’ADN plasmidique par addition d’une sonde à ARN radioactif. Cette sonde d’ARN radioactif va coder le gène de séquence souhaité à partir des cellules bactériennes.
Lavage et autoradiographie : – Laver le papier filtre pour éliminer les particules de sonde non liées. Après cela, exposez le papier filtre à la nitrocellulose au film radiographique par la méthode appelée “autoradiographie”. La colonie qui apparaîtra après autoradiographie sera appelée “Autoradiogramme” qui porte les gènes d’intérêt.
Identification du gène souhaité : – Puis comparer l’autoradiogramme développé avec la plaque maîtresse pour identifier les colonies contenant un gène d’intérêt.
Les cellules qui contiennent le gène souhaité peuvent se développer dans le milieu liquide et peuvent ensuite procéder à l’isolement de l’ADN plasmidique recombinant.
Conclusion:- On peut donc conclure que la méthode d’hybridation des colonies est la ” technique de criblage” qui fait l’utilisation de la sonde radioactive. La sonde marquée radioactivement crible ou isole ensuite le gène particulier du nombre de colonies bactériennes.
