Informations minimales pour les rapports sur le Test de Comète (MIRCA): recommandations pour décrire les procédures et les résultats du test de comète

Les lignes directrices MIRCA ont été élaborées par les membres de hCOMET COST Action dans le but d’améliorer l’analyse et la communication des résultats du test de comète (http://www.hcomet.eu/). Les auteurs sont des experts en analyse de comètes avec au moins huit ans d’expérience avec ces tests (15 des auteurs ont > 20 ans d’expérience pertinente). Nous avons utilisé un questionnaire sur Internet pour recueillir les opinions des auteurs sur l’importance des détails de la déclaration (Tableau 1; Données supplémentaires). Chaque information a été classée par les auteurs comme ” essentielle”, ” souhaitable” ou ” non importante”, et un seuil de congruence ≥75 % a été utilisé pour les classifications. Si le nombre de réponses “informations essentielles” n’atteignait pas le seuil de 75 % d’accord, les réponses “informations essentielles” et “informations souhaitables” étaient combinées, et l’information était classée comme “informations souhaitables” si ≥75 % des auteurs étaient d’accord pour dire qu’elle était soit “essentielle”, soit “souhaitable”. Dans le tableau 1, nous incluons des notes explicatives pour chaque recommandation.

Recommandations spécifiques de MIRCA pour chaque étape du test de comète

Étape 1A: Isolement de cellules et préparation de suspensions unicellulaires

Comme le test comet utilise des suspensions de cellules uniques, les échantillons qui ne sont pas obtenus en cellules uniques doivent être traités mécaniquement ou enzymatiquement pour perturber la fixation des cellules à une matrice extracellulaire ou les unes aux autres. L’homogénéisation des tissus par perturbation mécanique peut elle-même causer des dommages à l’ADN, tandis que la digestion enzymatique des tissus peut entraîner l’élimination des lésions de l’ADN dues à l’activité des enzymes de réparation de l’ADN endogènes, ou augmenter les niveaux de dommages à l’ADN en libérant des nucléases des cellules. La composition du tampon d’homogénéisation est une information “souhaitable”, notamment en ce qui concerne les composants nécessaires à la préservation de l’intégrité de l’ADN (par exemple, l’acide éthylènediaminetétraacétique) 24,25. Une description de la procédure d’isolement des suspensions unicellulaires, y compris l’homogénéisation du tissu, est considérée comme une information “souhaitable” à rapporter dans les articles.

Les échantillons de sang sont souvent utilisés dans les études de biosurveillance humaine. Parce que le sang représente une population hétérogène de cellules, des informations détaillées sur la population cellulaire sont “essentielles” dans les publications. Le texte doit décrire avec précision si les échantillons sont du sang total (y compris les globules rouges), des leucocytes, des cellules sanguines mononucléées ou un sous-ensemble de cellules (par exemple, les lymphocytes). Il peut également être utile d’inclure des informations sur la procédure de ponction veineuse, le type d’anticoagulant et la méthode ultérieure d’isolement cellulaire (c.-à-d. les étapes de centrifugation et de lavage) pour ceux qui répètent l’expérience. Les informations sur les conditions de stockage des cellules ou des tissus s’ils sont cryoconservés, ainsi que la méthode de congélation (par exemple, congélation rapide sur glace carbonique ou dans de l’azote liquide, ou une procédure de congélation lente) et la procédure de décongélation, sont considérées comme des informations “essentielles” à rapporter, car il a été démontré que ces processus affectent le niveau basal de migration de l’ADN.26.

Étape 1B: Préparation de cellules de substrat pour le test de réparation de l’ADN in vitro

Tout type de cellule eucaryote peut être utilisé comme cellule de substrat pour le test de réparation de l’ADN in vitro, et le type de cellule et la densité sont des informations “souhaitables” à rapporter. Il est ” essentiel ” de signaler la méthode et le type de composé génotoxique utilisés pour induire des lésions d’ADN dans les cellules du substrat et les conditions de stockage cellulaire subséquentes, alors que le niveau total de lésions d’ADN pouvant être détectées dans les cellules du substrat (par ex., le nombre de sites sensibles à l’ADN glycosylase de la formamidopyrimidine dans les cellules traitées avec Ro19-8022 plus la lumière) est considéré comme une information “souhaitable” uniquement.

Étape 1C: Contrôles de dosage

Dans cet article, les contrôles de dosage se réfèrent aux échantillons inclus dans chaque expérience de test de comète; ceux-ci sont parfois appelés étalons de référence, contrôles internes ou contrôles techniques16,27. Les témoins de dosage sont généralement des aliquotes cryoconservées à partir d’un seul lot de cellules qui ont été exposées à un agent de rupture de brin d’ADN (p.ex., rayonnement ionisant, peroxyde d’hydrogène ou méthanesulfonate de méthyle) ou un traitement qui provoque un type spécifique de lésion de l’ADN (par exemple, le photosensibilisateur Ro19-8022 plus la lumière, ou un traitement au bromate de potassium, pour induire l’oxydation de l’ADN). Il existe différents contrôles de dosage pour le dosage standard des comètes alcalines et le dosage des comètes modifiées enzymatiques. Le composé utilisé pour l’essai modifié enzymatique ne doit pas générer de cassures de brins d’ADN, car celles-ci diminuent la gamme dynamique des sites sensibles aux enzymes. Dans les études de biosurveillance, ainsi que dans les études transversales, interventionnelles et cliniques, des cellules non exposées peuvent être utilisées comme témoins de dosage. Il est “essentiel” de signaler les niveaux de dommages dans les contrôles de dosage et la variation de dosage (écart-type) dans le test de comète standard et modifié enzymatique.

L’essai de réparation de l’ADN in vitro utilise des contrôles expérimentaux internes, qui sont également utilisés dans le calcul de l’activité de réparation, plutôt que des contrôles d’essai en soi. Il s’agit d’informations “essentielles” pour signaler le niveau d’incisions de réparation de l’ADN dans les nucléoïdes provenant (i) de cellules de substrat non exposées incubées avec du tampon de réaction, afin de déterminer le niveau basal de dommages à l’ADN dans l’ADN du substrat (c’est-à-dire le “témoin de fond”); (ii) de cellules exposées incubées avec le tampon de réaction, afin de révéler le niveau de toute rupture de brin d’ADN non spécifique ou de sites abasiques résultant du traitement avec l’agent dommageable (c’est-à-dire le “témoin de traitement”).; (iii) des cellules de substrat non exposées incubées avec de l’extrait protéique de l’échantillon, pour vérifier l’activité d’incision ou de clivage non spécifique (c.-à-d. le “contrôle de la spécificité”); et (iv) des cellules de substrat exposées incubées avec une enzyme spécifique à la lésion, similaire aux contrôles de test pour le test comet modifié enzymatique (c.-à-d. le “contrôle de la réaction d’incubation”).

Étape 1D: Contrôles négatifs et positifs

Dans cet article, les contrôles négatifs et positifs se réfèrent aux groupes expérimentaux, tels que décrits dans la ligne directrice de l’OCDE (TG 489) pour le test de comète in vivo dans les tissus animaux18. Ainsi, les contrôles négatifs et positifs concernent l’ensemble de l’expérience. Un témoin positif fait référence à un composé génotoxique à action directe ou indirecte qui produit des ruptures de brins d’ADN ou des sites sensibles aux enzymes détectés avec le test comet. Pour le test comet modifié enzymatique, il n’existe aucune liste de témoins positifs correspondant aux composés que l’OCDE répertorie comme témoins positifs pour le test comet alcalin (pour induire des ruptures de brins d’ADN) dans des tissus animaux spécifiques. De plus, il n’existe pas de contrôle positif pour les études de biosurveillance humaine, car les personnes en bonne santé ne peuvent pas être délibérément exposées à un agent génotoxique. Les contrôles positifs sont déjà considérés comme obligatoires dans les expériences de culture cellulaire en toxicologie génétique et seront de facto des informations “essentielles” dans les articles utilisant le test comet. Dans les études animales, cependant, à des fins pratiques, les données comet sur les contrôles d’essai (c.-à-d., les échantillons mentionnés dans la section ci-dessus intitulée “Étape 1C, Contrôles de dosage”) sont suffisants, alors que les résultats des contrôles négatifs et positifs réels sont considérés comme des informations “souhaitables” uniquement.

Étape 2: Incorporation des cellules dans l’agarose

Le test comet a été initialement développé en utilisant trois couches d’agarose sur des lames de verre, la couche intermédiaire contenant les cellules. Cependant, la couche supérieure d’agarose n’est pas nécessaire et certaines procédures n’utilisent pas de couche inférieure (par exemple, les tests de film de Gelbond). Il est ” souhaitable ” de signaler le type de diapositives et la taille (c.-à-d., surface) des gels, à mesure que la proportion des cellules près du bord du gel augmente à mesure que la taille du gel diminue et que l’ADN des nucléoïdes au bord du gel peut migrer différemment de celui des nucléoïdes vers le centre du gel22. La concentration finale d’agarose (avec les cellules qui y sont intégrées) est “essentielle” à rapporter, car la migration de l’ADN dépend de la densité du gel.

Étape 3: Lyse des cellules

Il existe plusieurs procédures de lyse des cellules dans le test comet. Les informations sur la composition de la solution de lyse sont “essentielles”. Une étape supplémentaire d’incubation enzymatique (par exemple, avec la protéinase K) peut être nécessaire pour certains types de cellules, et les détails de l’incubation doivent également être signalés comme des informations “essentielles”. Certains rapports suggèrent que la durée de la lyse peut affecter la stabilité de certains types de lésions de l’ADN 28,29,30, de sorte que la durée de la lyse et la température de la solution de lyse sont des informations “souhaitables” à rapporter.

Étape 4A: Traitement enzymatique de réparation dans le test comet modifié enzymatique

Comme la solution de lyse peut inhiber l’activité de l’enzyme de réparation, il est “souhaitable” d’établir si une étape de lavage a été effectuée entre l’étape de lyse et le traitement enzymatique (c’est-à-dire la composition du tampon de lavage, le nombre de lavages et la durée). Il est “essentiel” de relayer des informations sur la source des enzymes de réparation, car il a été démontré que les enzymes de différents fabricants différaient à la fois par leur activité et par leur spécificité vis-à-vis des lésions nucléobasques16. Dans la plupart des études sur les comètes, des expériences sur les courbes de titrage sont effectuées pour identifier les conditions optimales pour le traitement enzymatique 31; cependant, les résultats des courbes de titrage enzymatique sont rarement rapportés et sont classés ici comme des informations “souhaitables” (une référence à une étude précédente pourrait être faite à la place), bien que nous considérions qu’il est “essentiel” de rapporter la durée et la température du traitement. La concentration en enzyme appliquée sur le gel est une information ” essentielle” ; il est préférable de rapporter la concentration en unités enzymatiques (U/ml), bien que la concentration en protéines (mg/ml) soit également utile. Le type d’unité d’incubation (p. ex., incubateur, fossé coulissant ou système à 12 gels) et le mode d’incubation sont des informations ” souhaitables ” à déclarer. Il convient de préciser si l’incubation a été réalisée (i) dans un bain enzymatique ou avec une goutte et une lamelle sur la lame, (ii) dans une version standard à 2 gel, 12 gel ou système à puits multiples ou (iii) dans une boîte humidifiée dans un incubateur, sur une plaque chauffante ou dans un fossé de lame chauffé.

Étape 4B: Préparation et incubation de l’extrait pour le test de réparation de l’ADN in vitro

Il est “souhaitable” de déclarer le nombre de cellules ou la masse de tissu utilisée pour préparer les extraits protéiques, alors qu’il est “essentiel” de déclarer la concentration finale en protéines des extraits cellulaires ou tissulaires ajoutés à l’ADN du substrat. La composition du tampon d’extraction (informations “souhaitables”) est moins cruciale que la composition du tampon d’incubation (informations “essentielles”), car ces dernières peuvent affecter le niveau de fond de migration de l’ADN. Conformément aux informations relatives au dosage des comètes modifiées enzymatiques, il est “souhaitable” de rapporter les résultats des expériences de titrage ou de faire référence aux études antérieures du même laboratoire, où celles-ci ont été réalisées. Le volume d’extrait ajouté aux cellules de substrat enrobées de gel est une information “souhaitable “. Il est “essentiel” de signaler la durée et la température de la période d’incubation car celles-ci affectent le nombre d’incisions de réparation. En ce qui concerne le test comet modifié enzymatique, le mode d’incubation est une information “souhaitable” à rapporter pour le test de réparation in vitro. Les informations sur l’identité de l’enzyme utilisée comme contrôle de la réaction d’incubation (indiquant la quantité de lésions de l’ADN dans les cellules du substrat) et la composition du tampon utilisé pour le niveau de fond des incisions de réparation de l’ADN dans les cellules du substrat non exposées sont “essentielles”, car elles sont essentielles pour démontrer la fiabilité de l’activité d’incision de réparation de l’ADN.

Étape 5: Traitement alcalin

La solution à pH alcalin élevé perturbe la liaison hydrogène qui maintient les brins d’ADN ensemble et convertit également certaines lésions nucléobasiques en ruptures de brins d’ADN. Ainsi, la durée du traitement alcalin peut affecter le niveau de migration de l’ADN dans l’électrophorèse subséquente32,33,34. Les informations spécifiques concernant la composition de la solution alcaline, le pH, la température et la durée du traitement sont donc des informations ” essentielles ” à rapporter.

Étape 6: Électrophorèse

Les facteurs les plus importants de la migration de l’ADN sont la durée de l’électrophorèse et le potentiel électrique (chute de tension à travers la plate-forme du réservoir d’électrophorèse)35. Il est “essentiel” que la composition du tampon d’électrophorèse, la force de l’électrophorèse (gradient de tension (V / cm) sur la plate-forme du réservoir d’électrophorèse) et la durée de l’électrophorèse soient rapportées. Une température élevée pendant l’électrophorèse peut affecter la migration de l’ADN 36; ainsi, les informations sur la température de la solution d’électrophorèse sont “essentielles” et peuvent être accompagnées de descriptions des mesures prises pour maintenir la température constante (par exemple, refroidissement de la plate-forme ou circulation du tampon).

Étape 7: Neutralisation

Cette étape consiste à éliminer l’excès de solution alcaline des lames pour assurer une coloration efficace. Il est “souhaitable ” de décrire la composition de la solution de neutralisation.

Étape 8: Coloration et visualisation

Les colorants de liaison à l’ADN ont des affinités de liaison différentes à l’ADN et peuvent donc affecter le calcul des descripteurs de test de comète primaire dans le logiciel d’analyse d’image différentement36,37, 38. Le type de colorant est une information “essentielle”, tandis que la concentration est une information “souhaitable”, tout comme le temps entre la coloration et la visualisation. L’intensité de la lumière des différents types de lampes de microscope diffère. De plus, elle varie en fonction de l’âge de la lampe et de l’heure à laquelle elle a été allumée lors de la notation des comètes. Cependant, il n’existe pas de procédure standard pour mesurer l’intensité de la lumière et corriger le niveau de migration de l’ADN en conséquence. De plus, une même comète peut sembler avoir différents niveaux de migration d’ADN à différents grossissements au microscope. Ainsi, il est “souhaitable” de rapporter le grossissement du microscope utilisé pour la notation. Il est ” souhaitable ” de montrer des images représentatives des comètes (p. ex., contrôle avec peu ou pas de migration, migration modérée et étendue de l’ADN) parallèlement aux niveaux signalés de migration de l’ADN.

Étape 9A : Notation et analyse des données

Cette étape nécessite la communication d’informations ” essentielles ” pour le descripteur de test de comète primaire (p. ex.. % d’ADN dans la queue, la longueur de la queue, le moment de la queue ou le score visuel), le nombre de comètes analysées par échantillon et la façon dont le niveau global de migration de l’ADN est exprimé (par exemple, la médiane ou la moyenne des scores des comètes). Il n’est “pas important” de rapporter le résultat individuel de chaque comète dans chaque gel; ils sont combinés pour calculer le niveau de dégâts global. Comme il n’est pas exclu que différents logiciels d’analyse d’images puissent avoir différentes façons de calculer le prédicteur primaire du test de comète, il est “essentiel” de signaler le logiciel utilisé (nom du logiciel, fabricant, version). Tous les descripteurs primaires partagent la limitation qu’il est nécessaire d’avoir une expertise dans le dosage des comètes pour comprendre ce qu’ils signifient, alors que si une courbe d’étalonnage est créée (à l’aide de rayonnements ionisants, qui induisent des ruptures à une fréquence connue), les résultats peuvent être convertis en fréquence relative des lésions par rapport aux nucléotides ou paires de nucléobases non altérées; ces données sont sans équivoque et transmettent des informations que tous les chercheurs peuvent comprendre39. La procédure visant à obtenir une courbe d’étalonnage, à l’aide de rayonnements ionisants, et à convertir les niveaux de migration de l’ADN à la fréquence des lésions par rapport aux nucléotides ou aux paires de nucléobases non altérées a été rapportée antérieurement40. Ainsi, il est ” souhaitable” de rapporter les résultats en tant que niveaux de lésions pour 109 nucléotides non modifiés ou 106 paires de nucléobases.

Étape 9B: Calcul des sites sensibles aux enzymes ou du nombre net d’incisions dans l’ADN du substrat pour le test de réparation de l’ADN in vitro

L’incubation avec des enzymes de réparation de l’ADN augmente le niveau de migration de l’ADN, car le niveau basal des ruptures de brin d’ADN et les lésions spécifiques à l’enzyme contribuent au nombre total de ruptures de brin d’ADN. Comme la migration de l’ADN attribuée au niveau basal des lésions de l’ADN et des lésions spécifiques à l’ENZYME peut provenir de différents mécanismes de génotoxicité, il est insuffisant de ne rapporter que le niveau total des lésions de l’ADN après traitement enzymatique. Au lieu de cela, il est “essentiel” de signaler la génotoxicité en tant que sites sensibles aux enzymes, où le niveau basal de migration de l’ADN a été soustrait de la migration de l’ADN dans les lames traitées enzymatiques.

Comme l’essai de réparation de l’ADN in vitro utilise les mêmes cellules de substrat avec tous les échantillons d’extraits de cellules ou de tissus, il n’est pas nécessaire d’avoir des contrôles de fond et de traitement simultanés pour chaque échantillon dans la même expérience (c.-à-d. un essai). Il peut y avoir plus d’un substrat (p. ex., lors de l’analyse de l’activité de réparation de l’excision des bases et des nucléotides), et donc des contrôles séparés pour chaque type de test de réparation de l’ADN sont nécessaires. Il est “essentiel” de signaler les incisions nettes par l’extrait de réparation dans l’ADN du substrat.

Étape 9C : Analyse statistique des résultats

Les analyses statistiques sont “essentielles”. Le type d’analyse statistique dépend de la conception de l’étude et suit les hypothèses générales des tests statistiques en toxicologie génétique et en biosurveillance 41,42.