La protéine de jonction Gap Connexin-43 est un régulateur transcriptionnel direct de la N-cadhérine in vivo

Manipulation d’embryons

Adultes X. les laevis ont été maintenus à 17 ° C et utilisés conformément aux réglementations de l’Unité de service biologique de l’University College de Londres, conformément aux directives du Home Office britannique établies dans la Loi sur les animaux 1986 tel que décrit45. Les embryons de X. laevis ont été obtenus et mis en scène comme précédemment décrit46,47. Pour cibler spécifiquement la crête neurale, des embryons ont été injectés dans les blastomères ventraux de l’animal au stade de huit cellules d’un côté pour toutes les expériences, sauf lorsque des lysats embryonnaires ont été utilisés. Dans ce cas, des embryons ont été injectés dans les deux côtés animaux d’embryons au stade bi-cellulaire. Des microinjections embryonnaires ont été effectuées selon48. Si nécessaire, la fluorescéine-dextrane (FDx; Invitrogen, D1821, 20 ng) ou la rhodamine-dextrane (RDx; Invitrogen, D1824, 20 ng) ont été utilisées comme traceurs. Oligomorpholinos contre X. laevis Cx43 (Cx43MO1; 8-24 ng, 5′- TTCCTAAGGCACTCCAGTCACCCAT-3′, Cx43MO2; 8-24 ng, 5′-AAAAATGGTTTTCTTGTGGGTCGA-3′) et BTF3 (BTF3MO, 40 ng, 5′-AACGGACCGGGTTTTAAAGGCTTCT-3′) ont été synthétisés et fournis par Gene Tools LLC. Des concentrations équimolaires de morpholino témoin standard (CTLMO : 3′-ATATTTAACATTGACTCCATTCTCC-5′) ont été utilisées. Les quantités de morpholinos correspondent aux quantités injectées dans un côté d’embryons de stade à huit cellules, tandis que l’autre côté a été utilisé comme contrôle interne. Lorsque des embryons ont été utilisés pour la collecte de lysats embryonnaires, ils ont été injectés au stade bicellulaire dans les deux blastomères animaux et le double des doses mentionnées a été utilisé. Pour tester l’efficacité de Cx43MOs sur l’ARNm endogène cx43, nous avons effectué une analyse western blot. Les deux Cx43MOs ont réduit efficacement les niveaux de protéines des endogènes Cx43FL et Cx43iso (Fig. 3 bis, b). Afin de valider l’efficacité du BTF3MO, nous avons testé par immunomarquage de cellules de la crête neurale l’expression de la protéine BTF3, qui a montré une diminution des niveaux de BTF3 dans les cellules BTF3MO par rapport au CTLMO (Fig. supplémentaire. 3 bis).

L’hybridation in situ a été réalisée comme précédemment décrit49,50. Brièvement, des embryons ont été fixés dans MEMPFA, suivis d’une hybridation nocturne avec des sondes marquées à la digoxigénine, incubées avec un anticorps AP et l’activité AP a été développée en utilisant des substrats NBT/BCP. Des sondes à ARN marquées à la digoxigénine ont été préparées pour foxD348 snail251, twist52, n-cadhérine 53, C353, btf3 (Xenbase : XL075i22) et sox1054, sox954. C3 (1 µg / ml), snail2 (0,8 µg / ml), foxD3 (2 µg / ml), sox10 (1 µg / ml), sox9 (1 µg / ml) et twist (0,7 µg / ml) ont été utilisés pour évaluer l’induction de la crête neurale, la torsion (0.7 µg / ml) pour la migration de la crête neurale, la n-cadhérine (1 µg / mL) pour évaluer les niveaux d’expression et le schéma d’expression de btf3 (0,7 µg/mL). Une immunomarquage en monture entière a été réalisée comme précédemment décrit55 en utilisant l’anticorps Cx43 (1:1000, Sigma, C6219). Brièvement, les embryons ont été fixés dans la MEPMFA et incubés pendant une nuit avec l’anticorps à la dilution décrite.

Des explants de calotte animale ont été disséqués à partir de blastules de xénope (stade 8) à l’aide d’une technique normale48,56 et préparés pour une hybridation in situ comme décrit ci-dessus. Pour les dosages de cap chez l’animal, 500 pg d’ARNm ont été injectés dans le côté animal des deux blastomères d’embryons à deux stades cellulaires. L’analyse de l’ISH a été réalisée sur 20 à 25 embryons par condition pour chaque expérience indépendante.

Manipulation et imagerie de la crête neurale

Des greffes de la crête neurale ont été effectuées comme indiqué précédemment 57. Brièvement, la crête neurale prélevée sur des embryons marqués par fluorescence au stade 18 a été disséquée avec des couteaux à sourcils et greffée dans des embryons hôtes non étiquetés. Pour des expériences in vitro, des explants de la crête neurale crânienne ont été disséqués au stade 18 à l’aide d’une technique normale58,59 et plaqués sur des boîtes enrobées de fibronectine (Sigma, F1141) comme décrit précédemment53. Pour les dosages à cellules uniques, les cellules de la crête neurale ont été brièvement dissociées dans le milieu Danilchick libre de Ca2+/Mg2+ 53. Pour chaque condition, dix embryons transplantés avec du NC marqué par fluorescence ont été analysés par expérience.

L’immunocoloration a été réalisée sur des explants de crête neurale comme précédemment décrit54 en utilisant l’anti-N-cadhérine (1:50, IgG de rat, clone MNCD2, DSHB), l’anti-E-cadhérine (1:250, mouse IgG, clone 5D3, DSHB), anti-BTF3 (1:100, Abcam, ab107213), anti-rabbit IgG Alexa488 (1:500, Invitrogen, A11034) and anti-rat IgG Alexa488 (1:500, LifeTechnologies). When required, 4′,6- diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1 μg/mL, Sigma, D9542) and/or phalloidin tetramethylrhodamin-b-isothiocyanate (PhR; 1 μg/mL, Sigma, P1951) were used.

Imaging of fixed embryos was performed using a MZFLIII Leica fluorescence stereomicroscope equipped with a DFC420 Leica camera controlled by Leica IM50 software. L’imagerie de la migration in vitro de la crête neurale a été réalisée à l’aide d’une cinématographie en accéléré telle que décrite précédemment 53,60. Brièvement, les cellules de la crête neurale ont été cultivées dans des boîtes de pétri en plastique ou en verre recouvertes de fibronectine, et la microcopie en accéléré a été commencée après une heure de culture in vitro. Pour la motilité et la migration des cellules, des microscopes composés (soit un microscope Nikon Eclipse 80i avec un appareil photo numérique Hamamatsu, soit un microscope DMRXA2 Leica avec un appareil photo numérique Hamamatsu contrôlé par un simple programme PCI) équipés d’étages motorisés et d’un objectif sec 10 × / 0,30NA ont été utilisés. Les cultures NC ont été préparées comme décrit ci-dessus. Des images ont été acquises toutes les 5 min pendant une période de 12 h. Pour l’imagerie de la morphologie cellulaire, un microscope TCS SP8 avec des objectifs à immersion dans l’eau de 63 × / 0,90NA et contrôlé par le logiciel LAS–AF a été utilisé. Les cellules fixes ont été imagées à l’aide d’un objectif à immersion dans l’huile de 63 ×/1,4 NA et d’un microscope confocal Leica TCS SPE contrôlé par le logiciel LAS–AF.

Pour la localisation de la construction ou les niveaux de FI endogènes, 10 à 15 CCN ont été analysés pour chaque condition par expérience.

Analyse de la migration cellulaire et de la morphologie cellulaire

Le test de chimiotaxie a été effectué selon une procédure normale61 à l’aide de billes acryliques d’héparine (Sigma, H5263) enrobées de 1 µg/mL de facteur 1 dérivé des cellules stromales humaines purifiées (Sigma, SRP3276). La motilité cellulaire et la chimiotaxie ont été analysées à l’aide des outils d’analyse ImageJ (https://imagej.nih.gov), comme décrit précédemment 53,60. En bref, chaque cellule individuelle a été suivie manuellement à l’aide du plugin de suivi manuel d’ImageJ, les données ont été collectées et analysées à l’aide du plugin de chimiotaxie d’ImageJ. La morphologie cellulaire a été évaluée en déployant l’indice de circularité (cercle complet = 1) et estimée par les outils d’analyse ImageJ. La dispersion cellulaire a été analysée à l’aide de l’algorithme de triangulation de Delaunay (Plugins ImageJ) et a été tracée comme aire de triangle d’explant moyen, comme décrit précédemment 54. La zone protrusive des cellules a été analysée dans les cellules de la crête neurale au bord d’un explant mesurant la zone de croissance qui dérive de deux périodes consécutives avec un intervalle de temps de 4 min; ces deux trames consécutives ont été soustraites pour générer la nouvelle area12. Pour l’analyse de la chimiotaxie cellulaire et de la dispersion cellulaire, 10 à 15 explants ont été analysés par condition pour chaque expérience indépendante. Pour la motilité cellulaire, la morphologie cellulaire et les protubérances cellulaires de 15 à 25 CCN ont été analysées par condition et par expérience.

Biologie moléculaire, plasmides et réactifs

Pour la synthèse de l’ADNc, l’ARN total a été isolé de 10 à 15 embryons au stade 23-24 ou de 10 à 15 capsules animales au stade 8 de X. laevis par condition pour chaque expérience indépendante et trois répliques techniques ont été utilisées au sein de chaque expérimentation25. Quantitative PCR (qPCR) was performed on an Applied Biosystems ABI 7900HT machine using the Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, 4385612) and the following primers: ef-1 forward 5′- ACCCTCCTCTTGGTCGTTT-3′, ef-1 reverse 5′-TTTGGTTTTCGCTGCTTTCT-3′15, ncad forward 5′-CAGGGACCAGTTGAAGCACT-3′, ncad reverse 5′-TGCCGTGGCCTTAAAGTTAT-3′62. n-cad mRNA expression was plotted as relative expression normalized against the housekeeping gene ef-1.

Plasmids: Cx43 constructs were synthesized using the X. laevis Cx43 sequence from cDNA clone (UniGene ID XL.1109) comme modèle. Cx43 pleine longueur (Cx43FL, aa 1-379), la construction tronquée terminale carboxy Cx43 (Cx43Trunc, aa 1-212) et la construction Cx43-20k (Cx43Tail, aa 213-379) ont été clonées en 5’BamHI/3’XhoI de vecteurs PCS2+ ou PCS2-EGFP. Le vecteur pCS2-EGFP a été gentiment fourni par le Dr Masa Tada. La construction inductible du Cx43Tail a été préparée en fusionnant le Cx43-20kTail (aa 219-379) au domaine de liaison aux ligands du GR humain (aa 512-777). Cx43-20k a été cloné en 5’EcoRI/3’aci et GR en 5’aci/3’XhoI de pCS2+ et pCS2-EGFP. Les constructions BTF3 ont été synthétisées à l’aide du X. séquence de laevis à partir d’un clone d’ADNc (ID UniGene XL.3536). BTF3FL (aa 1-162) a été cloné en 5’EcoRI/3’XhoI de pCS2+ ou pCS2-EGFP. La construction de délétion BTF3 dépourvue de la région NLS RRKKK (BTF3-dNLS, aa 1-158) a été clonée dans 5”Amhi/3’ClaI de pCS2+. Pour les expériences BiFC (Fig. 4b, c), Cx43Tail et Cx43Trunc ont été clonés en 5’BamHI/3’BamHI de pCS2-VC155. BTF3FL a été cloné en 5’BamHI/3’BamHI de pCS2-VN9m. Les vecteurs BiFC ont été gentiment fournis par le professeur James C. Smith. Toutes les séquences de construction sont vérifiées par séquençage automatisé de l’ADN (Source Biosciences, Royaume-Uni). When required, plasmids were linearized and mRNA transcribed as described before25, using sp6MessageMachine (Ambion). The mRNA constructs injected were: membrane GFP (mGFP, 300 pg), membraneRFP (mRFP, 300 pg) nuclearRFP (nRFP, 300 pg), lifeactin-GFP (400 pg), N-cadherin-GFP (500 pg), Cx43FL (500 pg), Cx43Trunc (500 pg), Cx43-20k (500 pg), BTF3FL (500 pg), BTF3-dNLS (500 pg), Cx43-20k-VC (500 pg), Cx43Trunc-VC (500 pg), and BTF3-VN9m (500 pg). The following plasmids were injected as DNA: pcDNA3.2-Cx43-HA (800 pg/embryo,22); pcDNA3.2-Cx43-ML-HA (800 pg/embryo;22); ΔΜ213 Cx43 (800 pg/embryon, 63).

Toutes les analyses sur les constructions fluorescentes ont été évaluées en se normalisant à la fluorescence de fond et, au besoin, à la fluorescence totale de la surface cellulaire.

Les réactifs suivants ont été utilisés: de l’acide flufénamique (50 µM pour l’incubation de l’explant NC − 100 Μm pour le traitement de l’embryon, Sigma, F9005), de l’acide méclofénamique (50 µM pour l’incubation de l’explant NC − 100 Μm pour le traitement de l’embryon, Sigma, M4531), de l’actinomycine D (20 µM, Sigma, A1410), du CHX (10 µM, Sigma, C7698) et de la dexaméthasone dissoute dans l’éthanol (10 µM) ont été ajoutés à la culture milieu aux stades 14-15 et maintenu jusqu’aux stades embryonnaires migrateurs de la crête neurale (stade 23). Pour contrôler la fuite éventuelle de chimères inductibles, un lot frère d’embryons a été cultivé sans dexaméthasone et traité pour une hybridation in situ. Pour le test de couplage (activité du canal de jonction de l’espace de test), 10 à 15 CCN ont été analysés par condition et par expérience.

Immunoprécipitation, fractionnement et western blot

Pour chaque condition, 10 à 15 embryons ont été utilisés pour la préparation de lysats embryonnaires par expérience. Des embryons entiers ont été préparés pour western blot après homogénéisation dans du tampon de lyse (Tris 20 mM, NaCl 100 mm, Triton-X 0,01%, pH 8,0) avec des inhibiteurs de protéase ajoutés (Roche, 11836153001) et des inhibiteurs de phosphatase (Roche, 04906837001) 54,64. Pour les western blots, les anticorps suivants ont été utilisés: Connexin 43 (Sigma, C6219, 1:1000), N-cadherin (DSHB, clone MNCD2, 1:800), E- cadherin (DSHB, clone 5D3, 1:1000), p42/44 MAPK (Cell Signaling, 9102S, 1:2000), α-tubulin (DSHB, clone 12G10, 1:1000), phospho-histone H3 (Millipore, 06579, 1:2000), GFP (Invitrogen, A11122, 1: 2000), HA-tag (Sigma H6908, 1:2000), rabbit IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA934, 1:3000), mouse IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA931, 1:3000) and rat IgG HRP-linked (Sigma, A9037, 1:2000). Immunoprecipitation was performed using GFP-Trap® kit (Chromotek); brièvement, les cellules ont été mises en suspension dans du tampon de lyse et centrifugées à 20 000×g pendant 5 min à 4 ° C, le surnageant a été récupéré et le volume ajusté avec du tampon de dilution. Des billes ont été équilibrées dans du tampon de dilution et mélangées au lysat cellulaire remis en suspension. Le mélange a été purifié magnétiquement et préparé pour le western blot. L’isolement de la fraction nucléaire des embryons de X. laevis a été réalisé à l’aide de protocoles de centrifugation différentielle avec modifications64,65. Brièvement, lysats d’embryons de stade 18 X. laevis à l’aide d’une aiguille de 22 G et d’un tampon d’homogénéisation de 20 µL (HB: 250 mm de saccharose, 20 mm d’Hepes, 10 mm de KCl, 1 mm d’EDTA, 1 mm d’EGTA, 1 mm de DTT, inhibiteurs de la phosphatase et de la protéase) par embryon. Tous les échantillons ont été centrifugés à 250×g pendant 5 min pour éliminer les débris embryonnaires. Après avoir recueilli le surnageant, il a été distribué dans trois tubes différents et filé à trois vitesses différentes (400×g, 600×g) pendant 5 min pour isoler les noyaux cellulaires. Les surnageants postnucléaires ont été conservés pour un traitement ultérieur. Les pastilles nucléaires sont à nouveau lavées dans du tampon HG et centrifugées à la vitesse appropriée (400×g, 600×g). Les pastilles nucléaires ont ensuite été remises en suspension dans 40 µL de glycérol à 10% / 0,1% de SDS / 1% de Triton-X dans HB. Une quantité appropriée de tampon d’échantillon a été ajoutée à chaque échantillon et des échantillons ont été traités pour l’électrophorèse sur gel d’acrylamide et l’analyse par western blot. Afin d’éviter les erreurs de chargement, la même membrane a été tamponnée contre la commande de chargement après décapage comme décrit précédemment 54, 64.

Les données de Western blot ont été analysées à l’aide des outils d’analyse ImageJ. Les intensités d’image ont été normalisées et le rapport de la protéine d’intérêt au contrôle de charge (i.e., Mapk ou α-tubuline) a été calculée, les rapports moyens ont été tracés. Les blots non découpés sont inclus en tant que figures supplémentaires (Figures supplémentaires. 5–7).

Cultures cellulaires

Les cellules HeLa (Collections de microorganismes et de culture Cellulaire de l’Institut Leibniz, DSMZ, Allemagne) ont été cultivées dans du DMEM additionné de sérum de veau foetal à 10% (Life Technologies, CA, USA) à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée à 10% de CO2 et transfectées comme indiqué à l’aide de Rotifect (Carl Roth, Allemagne) selon les instructions du fabricant.

Les fibroblastes embryonnaires de Xenopus (XTC, un don aimable d’Ana Losada) ont été cultivés dans du DMEM/ H2O à 67% additionné de sérum de veau foetal à 10% à 25 °C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO2 et transfectés comme indiqué à l’aide de Viafect (Promega, USA). Les plasmides pour la transfection étaient indiqués et 10 à 20 cellules Hela ou XTC ont été analysées pour chaque condition par expérience.

Pour les expériences d’ARNsi, une combinaison de trois ARNsi ciblés contre BTF3 a été transfectée comme décrit ci-dessus. Un siRNA standard (siRNA brouillé de Sigma) a été utilisé comme contrôle. Le numéro de catalogue de ces siRNA commerciaux par rapport à BTF3 est le suivant: SASI_Hs01_00124567; SASI_Hs02_00308337; SASI_Hs01_00124566. Les cellules ont été collectées 48 h après la transfection et traitées pour des expériences de qPCR, de western blot ou d’immunohistochimie. Comme décrit dans les sections respectives.

Toutes les lignées cellulaires ont été testées pour la contamination par les mycoplasmes.

Immunohistochimie et coloration à la phalloïdine

Pour la détection des protéines, des cellules de mammifères ou des explants de crête neurale ont été fixés dans du formaldéhyde à 4% dans du PBS-T à 0,2% (PBS + 0,2% Triton X-100) pendant 10 min et bloqués par du NGS à 10% pendant 1 h. Les anticorps primaires ont été incubés à 4 °C dans 10% de NGS. Les anticorps suivants ont été utilisés : 1/100 anti-BTF3 (Abcam, ab107213), 2,5 µg/ml d’anti-N-cadhérine (Banque d’Hybridomes des études de développement MNCD2), et 1:100 anti-Cx43 (Sigma, C6219) dans 10% de NGS et incubés LE à 4 °C. Les explants ont été lavés 3 fois avec du PBS + 0,2% Tween-20 et incubés LE à 4 °C avec un anticorps secondaire, dilué à 1:350 dans 10% de NGS. Le DAPI a été dilué à 1:1000 et mélangé avec les anticorps secondaires.

Spectrométrie de masse

Pour la co-immunoprécipitation de la queue CX43 marquée par un DRAPEAU pour l’analyse spectrométrique de masse, des cellules ont été lysées et des lysats ont été incubés pendant une nuit avec des billes anti-HA et équilibrées à haute affinité à 4 °C, les immunoprécipités ont ensuite été lavés et élutés27. Par la suite d’élution acide avec 0,1 M de glycine pH 2,5, le pH des éluats a été ajusté à pH 8,0 avec 0,5 M de Tris. Pour la digestion des protéines, des échantillons ont été incubés pendant une nuit avec 2 µg de trypsine (Trypsine Gold, Promega, USA) suivie d’une addition de 0.1 µg de Lys-C (Roche, Allemagne) et incubation pendant 6 h supplémentaires. Les peptides ont été dessalés sur des pointes de phase inversée en C-18 (Groupe Nest, USA), séchés sous vide et stockés à -20 °C jusqu’à analyse. Des mélanges de peptides séchés ont été récupérés dans 3 µl d’acide formique à 30% et dilués avec de l’eau jusqu’à 23 µl. Cinq µl du digest ont été injectés sur un système Nano-LC (Eksigent425 2D Nano-LC; Sciex, USA) et des peptides ont été séparés par chromatographie en phase inversée sur colonnes C-18 préparées en interne (Reprosil-Pur C18-AQ, 1,9 µm, Dr. Maisch, Allemagne, Colonnes PicoFrit, 75 µm i.d., New Obejctive, USA) dans un gradient linéaire de 100% d’éluant A (0,1% d’acide formique) à 55% d’éluant B (60% d’acténitrile, 0,1% d’acide formique) en 120 min. Le système LC a été mis en place sous forme de colonne ventilée et l’échantillon a été chargé et dessalé à un débit de 400 nl / min et la séparation a été effectuée à un débit de 200 nl / min. Le système nano-LC a été coupé au spectromètre de masse (Q-Exactive HF, ThermoScientific, Allemagne) qui fonctionnait en mode dépendant des données. L’interprétation des données a été réalisée avec Mascot V2.2 (Matrixscience, Royaume-Uni) et Progenesis LC–MS V4.1 (Dynamique Non linéaire, Royaume-Uni). L’interprétation des données a été réalisée avec MaxQuant V1.6.1.0 et Perseus V1.6.1.3 (MPI de Biochimie, Allemagne).Essai de couplage

Essai de couplage

La communication intracellulaire de la jonction Gap a été testée à l’aide d’un essai de couplage de colorant. Ici, le colorant fluorescent Calcein-AM (Sigma, 17783) a été utilisé. Une population de crête neurale disséquée à partir d’embryons non injectés a été incubée avec le colorant Calcein-AM pendant environ 10 min ou jusqu’à ce que le colorant soit chargé dans toutes les cellules. Une autre population de crête neurale provenant d’embryons injectés avec un marqueur nucléaire (injections d’ARNm nRFP, voir ci-dessus) a été disséquée séparément. Après dissociation des deux populations en absence de calcium et de magnésium, elles ont été mélangées et incubées pendant 1 h à 14 °C dans un tube à essai. Après une centrifugation légère, les explants de la crête neurale ont été coupés en morceaux de taille similaire et cultivés comme décrit ci-dessus, puis filmés. Pour tester l’activité des canaux des jonctions lacunaires, des bloqueurs de jonctions lacunaires; l’acide méclofénamique (Sigma, M4531) et l’acide flufénamique (Sigma, F9005) ont été utilisés. La communication cellulaire a été évaluée en estimant le rapport entre le nombre de cellules qui présentent à la fois des traceurs, le marqueur nucléaire et la Calcéine et le nombre total de cellules qui ont le marqueur nucléaire.

Analyse statistique

L’estimation de la taille de l’échantillon a été effectuée en suivant des travaux précédemment publiés et aucune méthode statistique spécifique n’a été utilisée. Les expériences n’ont pas été randomisées et en raison de la nature des expériences, les auteurs n’ont pas été aveuglés par l’allocation lors des deux expériences et de l’analyse des résultats. Seuls les embryons viables et les explants ont été analysés. Les embryons mal injectés n’ont pas été inclus dans les expériences d’hybridation in situ. L’injection correcte a été déterminée par l’injection de traceurs linéaires. Nos paramètres expérimentaux ont été mesurés au hasard une fois que des embryons viables et correctement injectés ont été sélectionnés.

La comparaison des pourcentages a été effectuée à l’aide de tableaux de contingence66. La normalité des ensembles de données a été testée à l’aide du test de Kolmogorov–Smirnov, du test d’Agostino et Pearson et du test de Shapiro-Wilk à l’aide de Prism6 (GraphPad). Les ensembles de données suivant la distribution normale ont été comparés avec le test t de Student (variances inégales à deux queues) ou ANOVA avec un post-test de comparaisons multiples de Dunnett utilisant Excel ou Prism6 (GraphPad). Les ensembles de données qui ne suivaient pas une distribution normale ont été comparés à l’aide du test de Mann Whitney ou d’une ANOVA non paramétrique (Kruskal Wallis avec les comparaisons multiples de Dunn après le test) à l’aide d’Excel ou de Prism6. Les comparaisons croisées n’ont été effectuées que si la valeur p globale de l’ANOVA était inférieure à 0,05. Dans toutes les légendes de figures, N = nombre d’expériences indépendantes; n = taille totale de l’échantillon.

X. identification partielle du promoteur de la n-cadhérine de laevis

Pour identifier le promoteur de base de Xenopus n-cad, nous avons utilisé la stratégie suivante. La région promotrice de base des gènes n-cadhérine de poussin et de mammifère a été décrite au niveau des régions 5′-UTR, dans la position -3000 à -1 pb par rapport au site d’initiation de la translation 41,67. En utilisant la ressource du projet Génome X. laevis (https://xenopus.lab.nig.ac.jp/), nous avons identifié une région de 2800 pb dans le 5′-UTR du gène n-cadhérine X. laevis (Fig. supplémentaire. 4). Puisque nos données indiquent que Cx43Tail, BTF-3 et Pol II forment un complexe, nous utilisons l’élément tool68 pour rechercher des boîtes TATA potentiellement actives dans la région que nous avons isolée. Notre analyse in silico révèle une région riche en boîtes TATA entre les positions -166 à -618 pb, par rapport au site de départ de la translation (fig. 4). Enfin, nous concevons des amorces qui se chevauchent pour amplifier des fragments de 200 pb dans cette région. Les séquences d’amorces sont répertoriées dans la section Puce et leurs régions de liaison sont mises en évidence sur la Fig. 4.

immunoprécipitation à la chromatine (puce)

Pour l’immunoprécipitation à la chromatine (PucE), nous avons suivi une procédure standard pour les embryons de X. laevis 69,70. Pour chaque expérience indépendante, nous avons utilisé deux répliques techniques et 250 à 300 embryons de xénope par condition. Brièvement, les embryons de stades neurulaires X. laevis ont été fixés pendant 15 min et 3 µg d’anticorps Pol II (Diagenode, C15100055) ou d’anticorps de qualité puce GFP (Abcam, ab290) ont été utilisés. Pour l’extraction de l’ADN, nous avons suivi un protocole normal69,70. En utilisant la ressource d’analyse des éléments, nous avons recherché des boîtes TATA putatives dans le X. laevis n-cad promoter region (Supplementary Fig. 4). Primers flanking these TATA boxes were designed to analyze ChiP samples by PCR. PCR was performed using the following protocol 95 °C for 30 s, 56 °C for 40 s, and 72 °C for 30 s for 32 cycles. Primers used for ChiP-PCR were:

P5F: 5′-CTTCCAAGAGATGAAGCTCATAT-3′,

P5R: 5′- AACACTCTATATGGCAGATAAC-3′,

P6F: 5′-CCTTTAAATGCATACACTTACC-3′,

P6R: 5′-ACAGAAAAAGCATTTGCTTCCT-3′,

P7F: 5′-CAATCAGATCCTTATATGTCCC-3′,

P7R: 5′ – GCCAAGTTTTCCTTTGTTGT-3′,

P8F: 5′ – GGAAGCAAATGCTTTTTCTGTC-3′,

P8R: 5′-AGTCTGCTTTAGGAGACAACG-3′

et leurs sites de liaison relatifs sont représentés sur la Fig. 4b. Les expériences sur les puces ont été quantifiées comme suit: le rapport normalisé de l’intensité de la bande pour chaque condition a été moyenné et l’augmentation du pli respecte le contrôle IgG a été calculée et tracée comme enrichissement du pli. L’intensité de la bande a été enregistrée en utilisant le plugin d’analyse des gels ImageJ. Les gels non coupés sont représentés sur la Fig. 7c, d.