La stabilisation de l’hétérochromatine par l’HORLOGE favorise le rajeunissement des cellules souches et la régénération du cartilage

Anticorps

Pour le western blot: anti-HORLOGE (#5157, 1:1 000), anti-HP1a (#2616S, 1:1 000) et anti-HP1y (#2619, 1: 3 000) de la Technologie de signalisation cellulaire; anti-KAP1 (Ab22553, 1: 2 000), anti-Lamine B1 (Ab16048, 1: 1 000) et anti-LBR (Ab32535, 1: 1 000) d’Abcam; anti-β-actine (sc-69879, 1:3 000) de Santa Cruz Biotechnology.

For immunostaining: anti-Ki67 (ZM0166, 1:500) from ZSGB-BIO; anti-γH2AX (05-636, 1:400) from Millipore; anti-53BP1 (A300-273A, 1:500) from Bethyl Laboratories; anti-FOXA2 (8186S, 1:100) from Cell Signaling Technology; anti-SMA (A5228, 1:100), and anti-TuJ1 (T2200, 1:100) from Sigma-Aldrich; anti-H3K9me3 (Ab8898, 1:500) and anti-NANOG (Ab21624, 1:200) from Abcam; anti-Lamin A/C (sc-376248, 1:500), anti-OCT3/4 (sc-5279, 1:200) and anti-SOX2 (sc-17320, 1:100) from Santa Cruz Biotechnology; anti-Aggrecan (AF1220, 1:100), anti-Osteocalcin (MAB1419, 1:100), and anti-FABP4 (AF3150, 1:100) des systèmes R&D.

Pour la cytométrie en flux: anti-CD73 (550257, 1:200), anti-CD90 (555595, 1:200), anti-CD44 (550989, 1:200), anti-HLA-ABC (560168, 1:100), anti-CD34 (555822, 1:200), anti-CD43 ( 560198, 1:200), anti-CD45 (555482, 1:200), anti-CD14 (555398, 1:200) et anti-CD19 (555415, 1:200) de BD Biosciences; anti-CD105 (17-1057-41, 1:200) et anti-PDPN (17-9381-42, 1: 200) d’eBioscience (San Diego, CA, USA); anti-CD29 (303004, 1:200), et anti-CD13 (301705, 1:200), anti-CD166 (343903, 1:200) et anti-CD164 (324805, 1:200) de Biolegend (San Diego, CA, USA).

Culture cellulaire

CLOCK+/+ hESCs (hESCs, lignée H9, WiCell Research Institute) et CLOCK−/−hESCs ont été maintenus sur des couches nourricières constituées de fibroblastes embryonnaires de souris inactivés par la mitomycine C (MEF) dans un milieu de culture hESC. Le milieu de culture hESC contenait du DMEM/F12 (Thermo Fisher Scientific), 20% de Sérum de remplacement KnockOut (Thermo Fisher Scientific), 0.1 mm d’acides aminés non essentiels (NEAAs, Thermo Fisher Scientific), 2 mm de GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific), 55 µM de β-mercaptoéthanol (Thermo Fisher Scientific), 1% de pénicilline / streptomycine (Thermo Fisher Scientific) et 10 ng / mL de bFGF (Joint Protein Central, Incheon, Corée). Alternativement, les CSEH ont été cultivées sur des plaques revêtues de Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) dans un milieu mTeSR (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada).

Les HMSC dérivés du hESC et les HMSC primaires ont été maintenus dans un milieu MSC contenant du MEMa (Thermo Fisher Scientific) additionné de 10% de sérum fœtal bovin (FBS) (Cat # 10099-141, Lot #1616964, Thermo Fisher Scientific), des NEAAs de 0,1 mM (Thermo Fisher Scientific), 1% de pénicilline/streptomycine (Thermo Fisher Scientific) et 1 ng/mL de bFGF (Joint Protein Central, Incheon, Corée ).

Édition génique médiée par CRISPR/Cas9 dans les CSEH

L’édition génique médiée par CRISPR/Cas9 a été réalisée par des méthodes décrites précédemment avec quelques modifications.33,34,65 En bref, un ARN guide ciblant l’exon 5 de CLOCK (CLOCK-gRNA) a été cloné dans un vecteur de clonage d’ARNr (#41824, Addgene) (Informations supplémentaires, Tableau S1). Après traitement par un inhibiteur de ROCHE Y-27632 (S1049, Selleck) pendant 24 h, des CSEH (5 ×106) ont été remis en suspension dans 100 µL d’Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) contenant le cocktail plasmidique, constitué du plasmide donneur contenant les bras d’homologie, CLOCK-gRNA et hCas9 (#41815, Addgene), et électroporés dans un système nucléofecteur 4D (Lonza). Les cellules ont ensuite été ensemencées sur des cellules nourricières MEF. G418 (100 µg / mL, 11811023, Thermo Fisher Scientific) a été ajouté pour initier une sélection positive 2 à 4 jours après l’électroporation. Après 2 semaines de sélection, des clones résistants au G418 ont été sélectionnés et transférés dans une plaque à 96 puits pour une caractérisation et une expansion plus poussées. La PCR génomique et le western blot ont été utilisés pour l’identification par édition génomique. De plus, nous avons retiré la cassette de résistance à la néomycine dans les CLOCK-/-HESC par électroporation avec le vecteur pCAG-FLpo-2A-puro. Trois jours après la transfection, 1 µg / mL de puromycine (Thermo Fisher Scientific) a été utilisé pour enrichir les cellules résistantes à la puromycine pendant 48 h. Après 8 à 12 jours de sélection, les colonies émergentes ont été cueillies et élargies pour une étude ultérieure.

Génération et caractérisation de hMSC

Les HMSC ont été différenciées des HESC selon un protocole publié précédemment.25,86,87 En bref, les CSEH ont été dissociés en corps embryoïdes (EBs) et traités avec un milieu de différenciation (MEMa (Invitrogen) additionné de 10% de FBS (Cat #10099-141, Lot #1616964, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mm de NEAAs (ThermoFisher Scientific), 10 ng/ mL de bFGF, 5 ng / mL de TGFß et 1% de pénicilline/ streptomycine (Gibco)) sur plaques revêtues de Matrigel pendant 10 jours jusqu’à la confluence de 95%. Ensuite, les cellules de type MSC confluentes ont été digérées et plaquées sur des plaques revêtues de Matrigel traitées avec du milieu de culture MSC contenant du MEMa (Invitrogen) additionné de 10% de FBS, 0,1 mm de NEAAs, 1 ng / mL de bFGF et 1% de pénicilline / streptomycine (Gibco). Ensuite, les cellules de type MSC confluentes ont été passées sur des plaques enrobées de gélatine. Les HMSC ont été purifiés avec différents anticorps correspondant à des marqueurs spécifiques aux hMSC (CD73, CD90 et CD105) par FACS. Les cellules triples positives CD73, CD90 et CD105 ont en outre été caractérisées par des marqueurs antigéniques de surface, y compris des marqueurs positifs, tels que CD44, CD166, CD29, HLA-ABC et CD13, et des marqueurs négatifs, tels que CD34, CD43, CD45, CD164, CD14, CD19 et PDPN. La fonctionnalité des CSMH a été vérifiée en outre par différenciation vers les chondrocytes, les adipocytes et les ostéoblastes. Les ostéoblastes, les chondrocytes et les adipocytes dérivés des CSMM ont été caractérisés par une coloration de von Kossa (GMS 80045.3, GenMed Scientific Inc., États-Unis) et coloration à l’ostéocalcine (indiquant l’ostéogenèse), coloration au bleu de toluidine (T3260, Sigma) et à l’aggrécan (indiquant la chondrogénèse) et coloration au Rouge à l’huile O (O1391, Sigma) (indiquant l’adipogenèse) en suivant les instructions du fabricant.

Isolement et culture de CSM primaires

Les CSM primaires ont été isolés de la gencive de différents individus.23,33,34,65 Les tissus séparés de la gencive ont été coupés en petits morceaux (1 mm2) à l’aide de ciseaux dans l’enzyme TrypLE™ Express (1 ×) plus Dispase IV et incubés à 37 °C pendant 30 min. Les suspensions tissulaires digérées ont été neutralisées par du milieu de culture MSC et centrifugées à 200 × g pendant 5 min à température ambiante. Les pastilles résultantes ont été remises en suspension dans un milieu de culture MSC contenant du MEMa (Invitrogen) additionné de 10% de FBS (Gibco), de 1 ng / mL de bFGF et de 1% de pénicilline/streptomycine (Gibco) et plaquées sur des plaques enrobées de gélatine pour la croissance des HMSC primaires.

Essai de rapport de la luciférase

Le plasmide PER2-dLuc était un cadeau aimable de E.E. Zhang.88 cellules hébergeant PER2-dLuc ont été cultivées à confluence dans des plaques de culture à 24 puits et synchronisées avec de la forskoline de 20 µM (S2449, Selleck) pendant 2 h. Le milieu a ensuite été remplacé par un milieu de culture MSC contenant de la luciférine de 0,25 mM (LUCK-1G, GoldBio). Les cellules ont été surveillées dans un luminomètre LumiCycle à 37 ° C pendant 5 à 7 jours; les données générées ont été analysées avec le logiciel d’analyse LumiCycle (Actimetrics). Les données du premier cycle de 24 heures ont été exclues de notre analyse statistique.

Synchronisation in vitro des hMSC et analyse circadienne

Les HMSC ont été plaqués sur des plaques enrobées de gélatine avec du milieu MSC jusqu’à confluence à 95%. Pour la synchronisation, les cellules ont ensuite été traitées avec de la forskoline 20 µM pendant 2 h et ré-stockées en milieu MSC après lavage deux fois avec du PBS. Les cellules ont été collectées à partir de la post-synchronisation de 24 h à des intervalles de 3 h pendant 9 points de temps, suivies d’une extraction d’ARN et d’une détection de RT-qPCR. Le test non paramétrique JTK_CYCLE a été utilisé pour vérifier les oscillations circadiennes comme décrit précédemment.89 fils de parcours temporel de HMSC avec des valeurs p et q < 0,05 ont été considérés comme rythmiques.

Western blot

Les cellules ont été lysées dans un tampon SDS contenant 4% de SDS et du Tris-HCl de 100 mm. La concentration en protéines a été quantifiée à l’aide d’un kit de quantification BCA (Thermo Fisher Scientific), et ~ 20 µg de protéines par échantillon ont été soumis à une page SDS et électrotransférés sur des membranes PVDF (Millipore). Ensuite, les membranes ont été bloquées avec du lait à 5% et incubées avec des anticorps primaires, puis avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP). Des bandes immunoréactives ont été visualisées dans un système ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad). Les analyses statistiques ont été quantifiées par le logiciel Image J (NIH). Chaque groupe a eu trois expériences indépendantes. Les significations statistiques ont été évaluées par un test t de Student à deux queues non appariées.

Microscopie électronique à transmission

Les HMSC à passage tardif (P9) CLOCK+/+ et CLOCK-/− ont été récoltés enzymatiquement avec TrypLE (Thermo Fisher Scientific) et centrifugés à 500 × g pendant 5 min à température ambiante. Les pastilles résultantes ont été fixées avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS (pH 7,4) sur glace pendant la nuit. Les cellules ont ensuite été déshydratées dans une série graduée d’éthanols, perméabilisées et noyées dans de la résine Lowicryle HM20. Des sections (200 nm) ont été obtenues et imagées avec un microscope électronique à transmission Spirit (société FEI) fonctionnant à 100 kV.

Coloration par immunofluorescence

Les cellules ensemencées sur des lamelles (Thermo Fisher Scientific) ont été lavées deux fois avec du PBS. Ensuite, les cellules ont été fixées avec 4% de PFA pendant 30 min, perméabilisées avec 0,4% de Triton X-100 dans du PBS pendant 30 min et bloquées avec 10% de sérum d’âne dans du PBS (Jackson Immuno Research) pendant 1 h à température ambiante. Après blocage, les cellules ont été incubées avec des anticorps primaires à 4 °C pendant la nuit. Par la suite, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS, incubées avec des anticorps secondaires à température ambiante pendant 1 h et lavées trois fois avec du PBS. Les noyaux ont été colorés avec Hoechst 33342 (H3570, Thermo Fisher Scientific). L’imagerie a été réalisée avec un système confocal Leica SP5. L’analyse statistique du nombre, de l’intensité et de l’aire des signaux de fluorescence a été quantifiée par le logiciel Image J (NIH). Les cellules ont été collectées à partir de trois répliques biologiques. Les significations statistiques ont été évaluées par un test t de Student à deux queues non appariées. La reconstruction 3D de la coloration H3K9me3 comme le montre la Fig. 2f a été réalisé en sectionnant en série la pile z par intervalles de 50 nm en mode conventionnel pour un maximum de 50 images avec un système confocal Leica SP5 et traité ensuite pour la reconstruction 3D par le logiciel Imaris (version 7.4.2) comme décrit précédemment.90

Dosage de coloration SA-β-gal

La coloration SA-β-gal a été réalisée comme décrit dans les études précédentes.33,34 En bref, les cellules ont été fixées avec du tampon de fixation (2% de formaldéhyde et 0.2% de glutaraldéhyde) pendant 5 min à température ambiante. Ensuite, les cellules fixes ont été colorées avec une solution de coloration fraîche à 37 ° C pendant la nuit. Des champs de vision ont été choisis au hasard dans chaque puits et le pourcentage de cellules SA-β-gal positives a été déterminé à l’aide du logiciel ImageJ. Chaque groupe avait trois répliques biologiques. Les significations statistiques ont été évaluées par un test t de Student à deux queues non appariées.

Essai d’expansion clonale

Un essai d’expansion clonale a été effectué comme indiqué précédemment.34,65 En bref, 6000 cellules par puits ont été ensemencées en plaques de 6 puits et cultivées pendant 9 à 12 jours. Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS, fixées avec 4% de PFA et colorées avec 0,2% de violet cristallin pendant 1 h à température ambiante. Les champs de vision ont été scannés par un scanner et mesurés par le logiciel ImageJ (NIH). Chaque groupe avait trois répliques biologiques. Les significations statistiques ont été évaluées par un test t de Student à deux queues non appariées.

Co-IP

Des cellules HEK293T transfectées avec des plasmides exprimant Flag-Luc ou Flag-CLOCK et des hMSCs ont été lysées dans un tampon de lyse CHAPS (NaCl 120 mM, 0.CHAPS à 3%, EDTA de 1 mM, HEPES de 40 mM (pH 7,5) et cocktail inhibiteur complet de protéase (Roche)) à 4 °C pendant 4 h et ont ensuite été centrifugés à 14 500 ×g à 4 °C pendant 40 min. Pour le Co-IP avec des protéines exogènes, les surnageants ont été mélangés avec des billes couplées à des anticorps anti-Flag (A2220, Sigma) et mis en rotation une nuit à 4 °C. Pour le Co-IP avec des protéines endogènes, les surnageants ont été mélangés avec les anticorps indiqués une nuit à 4 °C avec rotation puis ont été incubés avec des billes d’Agarose Protéine A/G-PLUS (sc-2003, Santa Cruz) pendant encore 4 h à 4 °C avec rotation. Les billes ont été lavées six fois avec du tampon CHAPS puis éluées avec des peptides Flag ou par ébullition dans un tampon de chargement 1× SDS pendant 10 min pour le western blot.

Analyse LC-MS/MS et identification des protéines

Les protéines éluées obtenues par immunoprécipitation ont été soumises à 10% de PAGE SDS et colorées au bleu brillant de Coomassie (WB-0101, Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co. Ltd). Les bandes de gel contenant les échantillons de protéines ont été excisées, découpées en petits bouchons, déshydratées (100% acétonitrile), réduites (10 mM de DTT dans 25 mm de NH4HCO3 pendant 45 min à 56 °C) et alkylées (40 mM d’iodoacétamide dans 25 mm de NH4HCO3 pendant 45 min à température ambiante dans l’obscurité). Ensuite, les bouchons de gel ont été séchés et digérés avec de la trypsine modifiée de grade séquençage (40 ng par bande) dans du NH4HCO3 de 25 mm pendant une nuit à 37 ° C. Enfin, de l’acide formique à une concentration finale de 1% a été utilisé pour terminer la réaction enzymatique. La solution résultante a ensuite été transférée dans un flacon échantillon pour analyse LC-MS/MS.

Les expériences nanoLC-MS/MS ont été réalisées sur un spectromètre de masse Q Exactif (Thermo Scientific) en mode dépendant des données, ce qui a permis l’acquisition de données MS à une résolution élevée de 70 000 (m/z 200) sur une plage m/z de 300 à 1 600. Les données brutes de Q Exactive Analysis ont été analysées avec Proteome Discovery (version 1.4) à l’aide du moteur de recherche Sequest HT pour l’identification des protéines et du Percolateur pour l’analyse du taux de fausses découvertes (FDR). Les données ont été recherchées par rapport à la base de données UniProt sur les protéines humaines (mise à jour le 06-2013). L’analyse du FDR a été réalisée avec un percolateur et le FDR < 1% a été fixé comme seuil d’identification des protéines. La confiance en peptides a été réglée sur élevée pour le filtrage des peptides.

RT-qPCR et ARN-Seq

L’ARN total a été extrait de cellules humaines cultivées ou d’articulations de souris à l’aide de TRIzol (Thermo Fisher Scientific), et l’ADN génomique a été retiré à l’aide d’un kit sans ADN (Thermo Fisher Scientific). L’ADNc a été généré avec le système de transcription Inverse du script Go (Promega). La RT-qPCR a été réalisée à l’aide de qPCR Mix (Toyobo) dans un système temps réel CFX384 (Bio-Rad). Chaque groupe avait quatre répliques de puits. Les significations statistiques ont été évaluées par un test t de Student à deux queues non appariées. Toutes les expériences RT-qPCR ont été réalisées avec au moins trois répliques expérimentales et répétées indépendamment pendant au moins deux fois. Pour l’ARN-seq de l’articulation de souris, des échantillons d’ARN de l’articulation du genou provenant du même groupe de traitement de souris âgées injectées avec des lentivirus exprimant Luc (n = 12 souris) ou CLOCK (n = 12 souris) ont été mélangés de manière égale en masse, et l’ARN-seq a été réalisé avec deux répliques techniques. Pour l’ARN-seq hMSC, deux répliques biologiques ont été examinées. Une bibliothèque de séquençage a été construite à l’aide d’un kit de préparation de bibliothèque NEBNext Ultra RNA pour Illumina en suivant le protocole du fabricant. Les bibliothèques générées ont été séquencées sur des plates-formes Illumina HiSeq X-Ten avec un séquençage par paires avec des longueurs de lecture de 150 pb. Le contrôle de la qualité et le séquençage ont été effectués par la technologie NoVo Gene Bioinformatics. Les amorces utilisées pour le qPCR sont indiquées dans le tableau S2 des renseignements supplémentaires.

Traitement des données RNA-seq

Le pipeline de traitement des données RNA-seq a déjà été signalé.34 lectures d’extrémité appariées brutes ont été rognées dans le logiciel Trim Galore (version 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Des lectures propres ont été cartographiées sur le génome hg19 humain UCSC ou le génome mm10 de la souris à l’aide de hisat2 (version 2.0.4).91 Les fichiers sam ont été convertis en fichiers bam par SAMtools avec le paramètre “-S-b-q 10”.92 Ensuite, le nombre de lectures a été calculé par HTSeq (version 0.11.0), et seules les lectures mappées de haute qualité (qualité de mappage > 20) ont été conservées.93 La valeur des Fragments Par Kilobase par Million (FPKM) pour chaque gène a été calculée à l’aide de StringTie (version 1.2.3).94 gènes exprimés différentiellement (DEG) ont été calculés en utilisant le package DESeq2 (version 1.22.2) avec la coupure “valeur q (valeur p ajustée, padj) < 0,05 et | log2 (changement de pli) | > 1 pour les HMSC ou |log2 (changement de pli) | > 0,5 pour les articulations de souris”. Une analyse d’enrichissement en ontologie génétique (GO) a été réalisée avec le ToppGène.95 L’analyse de l’enrichissement des ensembles de gènes a été réalisée par GSEA (version 2.2.4). L’ensemble des gènes SASP a été obtenu à partir d’une étude précédente.42

DamID-seq

pLgw V5-EcoDam et pLgw EcoDam-V5-EMD étaient des cadeaux du Prof. Bas van Steensel (Institut néerlandais du cancer (NKI)). DamID-seq a été effectué comme décrit, 58 avec des modifications. En bref, les lentivirus Dam et Dam-EMD générés à partir de cellules HEK293T ont été concentrés par ultracentrifugation à 19 400× g pendant 2,5 h. Les pastilles de virus ont été remises en suspension dans du PBS. Les HMSC CLOCK+/+ et CLOCK−/− ont été ensemencés dans des boîtes à six puits à 2 × 105 cellules par puits. Chaque groupe avait trois répliques biologiques. Le lendemain, le milieu de culture a été remplacé par 2 mL de milieu de culture frais contenant soit du lentivirus Dam, soit du lentivirus Dam-EMD. À 72 h après la transduction, les cellules ont été récoltées et l’ADN génomique a été isolé à l’aide d’un kit tissulaire DNeasy Blood& (69504, Qiagen). La digestion par DpnI (R0176S, New England Biolabs), la ligature de l’adaptateur, la digestion par DpnII (R0543S, New England Biolabs), l’amplification par PCR et la purification ont été effectuées comme décrit précédemment.58 Pour le rognage de l’adaptateur, l’ADN amplifié a été soniqué et digéré avec AlwI (R0513S, New England Biolabs). La bibliothèque d’ADN a été construite à l’aide d’un kit de préparation de bibliothèque d’ADN NEBNext Ultra pour Illumina (E7370S, New England Biolabs). Les bibliothèques ont été regroupées et soumises à un séquençage par paires avec des longueurs de lecture de 150 pb sur les séquenceurs Illumina NovaSeq.

Traitement des données DamID-seq

Les lectures brutes des données Dam et Dam-EMD pour les HMSC CLOCK+/+ et CLOCK−/−ont été rognées dans le logiciel Trim Galore (version 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Les lectures rognées ont été cartographiées sur le génome humain hg19 de l’UCSC à l’aide de Bowtie 2 (version 2.2.9).96 doublons de PCR ont été supprimés avec les MarkDuplicates.programme jar dans Picard tools. Ensuite, les lectures ont été triées avec SAMtools (version 1.6). Pour minimiser l’effet du biais et de la profondeur du séquençage, les lectures traitées à partir de trois répliques pour chaque échantillon ont été fusionnées. Ensuite, le même nombre (110 millions) de lectures de haute qualité pour chaque type de cellule ont été sélectionnées au hasard pour une analyse en aval. Pour visualiser les signaux DamID, nous avons calculé le rapport log2 des Lectures Par Kilobase par Million de lectures cartographiées (RPKM) des signaux Dam-EMD et Dam (log2 (Dam-EMD/Dam)) dans CLOCK+/+ et CLOCK−/−HMSC pour chaque bac de 10 pb à l’aide du programme bamCompare dans le logiciel deepTools (version 2.5.4-2-5ee467f).

Pour l’identification des régions LAD dans les HMSC CLOCK+/+ et CLOCK−/−, nous avons d’abord calculé les signaux DamID (rapport log2 du RPKM des signaux Dam-EMD et Dam (log2 (Dam-EMD/Dam)) dans les HMSC CLOCK+/+ et CLOCK−/− pour chaque bac de 2 ko en utilisant le programme bamCompare dans le logiciel deepTools (version 2.5.4-2-5ee467f). Ensuite, nous avons implémenté le package R pour les modèles de Markov cachés avec des émissions de t (HMMt) (version 0.1), pour identifier les LADS (https://github.com/dinovski/asDamID/blob/master/scripts/hmmt_functions.R).

Pour comparer les signaux DamID dans les régions de LAD entre les HMSC d’HORLOGE +/+ et les HMSC D’HORLOGE, nous avons fusionné les régions de LAD identifiées dans les HMSC d’HORLOGE +/+ et les HMSC d’HORLOGE en des régions d’union et avons calculé le signal DamID relatif (signal DamID dans les HMSC d’HORLOGE/- moins le signal DamID dans les HMSC d’HORLOGE +/+) pour chaque région de LAD d’union. Ensuite, les signaux DamID relatifs pour les régions de LAD ont été tracés à l’aide du ridéogramme du paquet R (version 0.2.2), comme indiqué dans les informations supplémentaires, Fig. S4d.97

ChIP-qPCR et ChIP-seq

En bref, 1 ×106 CLOCK+/+ et CLOCK−/-HMSC ont été réticulés dans du formaldéhyde à 1% (vol/ vol) dans du PBS pendant 8 min à température ambiante, et la réaction a été terminée par incubation avec de la glycine de 125 mM pendant 5 min à température ambiante. Les échantillons ont ensuite été lysés sur de la glace pendant encore 10 min. Après sonication dans un appareil à ultrasons focalisés Covaris S220 (Covaris) et centrifugation pendant 10 min à 12 000 ×g à 4 °C, des surnageants ont été incubés pendant une nuit à 4 °C avec des Dynabeads de protéine A (Thermo Fisher Scientific, 10004D) conjugués à un anticorps anti-HORLOGE, un anticorps anti-H3K9me3 ou des IgG de lapin. Par la suite, l’élution et la réticulation inverse ont été effectuées à 68 °C pendant 2 h dans un thermomixeur. Ensuite, l’ADN a été isolé par extraction d’alcool phénol-chloroforme-isoamylique et précipitation d’éthanol. L’ADN purifié a été soumis à un qPCR pour l’évaluation de l’occupation de l’HORLOGE ou du H3K9me3 à des séquences répétitives. Les fragments enrichis ont été construits dans des bibliothèques sans l’incorporation de contrôles spike-in via des kits KAPA Hyper Prep avec amplification de bibliothèque PCR / série Illumina (KK8504, New England Biolabs) en suivant les instructions du fabricant. Toutes les expériences ont été réalisées au moins deux fois avec des résultats similaires. Les significations statistiques ont été évaluées par un test t de Student à deux queues non appariées.

Traitement des données ChIP-seq

Pour le traitement des données ChIP-seq H3K9me3, les lectures brutes ont été rognées avec le logiciel Trim Galore (version 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Les lectures rognées ont été cartographiées sur le génome humain hg19 de l’UCSC à l’aide de Bowtie 2 (version 2.2.9).96 lectures dupliquées ont été supprimées avec les MarkDuplicates.programme jar dans Picard tools. Ensuite, les lectures ont été triées avec SAMtools (version 1.6). Pour minimiser l’effet du biais et de la profondeur du séquençage, les lectures traitées à partir de trois répliques pour chaque échantillon ont été fusionnées. Ensuite, le même nombre (130 millions) de lectures de haute qualité pour chaque type de cellule ont été sélectionnées au hasard pour une analyse en aval. Pour visualiser les signaux ChIP-seq, nous avons calculé les comptes de lecture normalisés en déterminant les valeurs RPKM pour chaque bac de 10 pb. Pour les appels de crête H3K9me3, SICER (version V1.1) a été utilisé avec le paramètre “-w 200-g 3”.98 Seuls les pics appelés H3K9me3 avec un FDR de coupure de 1% ou plus ont été retenus.

Pour l’identification des “montagnes H3K9me3”, le signal H3K9me3 en nombre par million (CPM) dans chaque pic H3K9me3 a été calculé. Nous avons ensuite classé les pics H3K9me3 dans l’ordre du signal H3K9me3 croissant et tracé l’occupation de la puce H3K9me3-seq en HMSC HORLOGE +/+ et HORLOGE−/−, comme indiqué dans les informations supplémentaires, Fig. S4f. Ces parcelles ont montré un point clair où le signal d’occupation H3K9me3 a commencé à augmenter rapidement. Ensuite, les points d’inflexion de ces courbes ont été déterminés. Nous avons également défini les pics H3K9me3 au-dessus des points d’inflexion comme des “montagnes H3K9me3” et les pics H3K9me3 en dessous de ces points comme des pics H3K9me3 typiques.

ATAC-seq

L’ATAC-seq a été réalisée comme décrit précédemment.99 En bref, un total de 50 000 cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et remises en suspension dans 50 µL de tampon de lyse (Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), NaCl 10 mM, MgCl2 3 mm, substitut Nonidet P40 0,1% (v/v)). La suspension de noyaux a ensuite été centrifugée à 500 ×g pendant 10 min à 4 °C, puis additionnée de 50 µL de mélange réactionnel de transposition (10 µL de tampon 5 × TTBL, 4 µL de mélange TTE et 36 µL de H2O sans nucléase) à partir d’un kit de préparation de Bibliothèque d’ADN TruePrep V2 pour Illumina (Vazyme Biotech). Les échantillons ont ensuite été incubés à 37 °C pendant 30 min. Les bibliothèques ont ensuite été amplifiées et purifiées à l’aide du TruePrep DNA Library Prep Kit V2 pour Illumina (Vazyme Biotech). La qualité de la bibliothèque a été évaluée à l’aide d’un analyseur de fragments. Enfin, les bibliothèques ont été séquencées sur des plates-formes Illumina HiSeq X-Ten avec un séquençage par paires avec des longueurs de lecture de 150 pb.

Traitement des données ATAC-seq

Pour le traitement des données ATAC-seq, les lectures brutes ont été rognées avec le logiciel Trim Galore (version 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Les lectures rognées ont été cartographiées sur le génome humain hg19 de l’UCSC à l’aide de Bowtie 2 (version 2.2.9) avec le paramètre “-X 2000-N 1-L 25 -no–mixed-no-discordant-t”.96 lectures en double ont été supprimées avec les MarkDuplicates.programme jar dans Picard tools. Ensuite, les lectures ont été triées avec le logiciel SAMtools (version 1.6). Ensuite, les lectures traitées à partir de trois répliques pour chaque échantillon ont été fusionnées. Pour visualiser les signaux ATAC, nous avons étendu chaque lecture de 250 pb et normalisé le nombre de lectures par la valeur RPKM pour chaque bac de 10 pb. Pour les appels de crête ATAC, MACS2 (version 2.1.1.20160309) a été utilisé avec le paramètre “–nomodel–shift 0–extsize 250–call-summits”.100 Seuls les pics ATAC appelés avec des valeurs q < 0,01 ont été conservés. Les pics ATAC identifiés dans CLOCK+/+ mais pas dans CLOCK-/-HMSC ont été définis comme des pics ATAC “fermés”; Les pics ATAC identifiés dans CLOCK-/- mais pas dans CLOCK +/+ HMSC ont été définis comme des pics ATAC “ouverts”. Estimation de la distribution génomique des pics ATAC utilisés annotatePeaks.pl programme dans le logiciel homer.101

Évaluation de la reproductibilité des données de séquençage

Pour évaluer la reproductibilité des données ChIP-seq H3K9me3 et ATAC-seq, la distance euclidienne entre les répliques a été calculée comme suit: les lectures ont été comptées et normalisées par le RPKM à une taille de bac de 2 ko. Ensuite, la distance euclidienne a été calculée en R (version 3.5.1) pour évaluer la reproductibilité. Des distances euclidiennes plus faibles signifient des corrélations plus élevées. Pour évaluer la reproductibilité des données DamID-seq, une analyse en composantes principales (PCA) a été réalisée dans R (version 3.5.1). Pour évaluer la reproductibilité des données ARN-seq, des diagrammes de dispersion ont été dessinés sur la base du nombre de lectures normalisées du logarithme régularisé (rlog) avec DESeq2, et le coefficient de corrélation de Pearson entre les répliques a été calculé.

Expériences sur des animaux

Pour l’analyse de la formation de tératomes, souris NOD/SCID (âgées de 6 à 8 semaines, achetées auprès de Beijing Vital River Laboratory Animal Technologies Co. Ltd) ont été injectés avec 3 × 106 CLOCK+/+ ou CLOCK-/-hESCs dans une solution Matrigel: mTeSR(1:4). Les tératomes ont été récoltés 8 à 12 semaines après l’injection pour une analyse plus approfondie.

Pour les tests de transplantation de hMSC, 1 × 106 CLOCK+/+ ou CLOCK−/−HMSC transduits avec des lentivirus exprimant Luc ont été injectés dans le muscle TA de souris nues (âgées de 6 à 8 semaines). Des souris ont ensuite été traitées avec de la D-luciférine (LUCK-1G, GoldBio) et imagées avec un système d’imagerie à spectre IVIS (Xenogen, Caliper, Waltham, MA, USA). Les images de bioluminescence ont été acquises en mode “auto”. Chaque groupe avait six répliques biologiques. Les significations statistiques ont été évaluées par un test t de Student à deux queues non appariées.

Pour la détection du niveau d’horloge associé au vieillissement, des souris d’âges différents (souris jeunes, 1 mois, n = 5; souris âgées, 15 mois, n = 10) ont été euthanasiées et les articulations ont été prélevées pour une analyse RT-qPCR. Les significations statistiques ont été évaluées par un test t de Student à deux queues non appariées.

Pour évaluer si l’administration lentivirale de CLOCK pouvait atténuer les syndromes liés au vieillissement, des lentivirus exprimant Luc (n = 14 souris) ou CLOCK (n = 13 souris) ont été injectés dans les cavités articulaires de souris âgées de 18 mois (achetées à SPF (Beijing) Biotechnology) et réapprovisionnés après 8 semaines d’injection. L’expérience sur tapis roulant a été réalisée 15 semaines après la première injection de lentivirus exprimant Luc ou CLOCK. Dans le détail, des souris ont été entraînées sur un tapis roulant (SA101, SANS) à une inclinaison de 5° pendant 3 jours pendant 20 min chaque jour, avec une vitesse accélérée de 0 à 20 m/ min. Le jour du test, les souris ont couru sur le tapis roulant avec une vitesse initiale de 0 m / min, puis la vitesse a été augmentée de 2 m / min à 20 m / min. La durée totale a été fixée à 20 min. La fréquence du stimulus de choc électrique léger a été enregistrée et analysée (Luc, n = 14 souris; HORLOGE, n = 13 souris). La micro-tomodensitométrie a été réalisée 16 semaines après la première injection (Luc, n = 14 souris; CLOCK, n = 13 souris). Les souris ont ensuite été euthanasiées et les articulations ont été prélevées pour une évaluation histologique (Luc, n = 14 souris; CLOCK, n = 13 souris) et une quantification de l’ARNm (Luc, n = 12 souris; CLOCK, n = 12 souris). Les significations statistiques ont été évaluées par un test t de Student à deux queues non appariées.

Histologie et immunohistochimie

Pour l’analyse histologique, les articulations de souris récoltées ont été fixées avec du PFA à 4% pendant 2 jours et incorporées dans de la paraffine après décalcification pendant 14 à 21 jours. Les sections (5 µm) ont été colorées avec du FCF vert rapide (0,02%) et de la safranine O (0.1%) selon les instructions du fabricant.

La coloration immunohistochimique a été réalisée en utilisant la méthode de coloration par DAB telle que décrite précédemment, avec quelques modifications.33,34,102 Tout d’abord, les lames ont été deparaffinisées et réhydratées à l’aide de xylène et de différentes concentrations d’alcool. La récupération de l’antigène a été réalisée par digestion à la trypsine (ZLI-9010, ZSGB-BIO) pendant 20 min à température ambiante. Le peroxyde d’hydrogène (3%) a été utilisé pour bloquer l’activité de la peroxydase endogène en incubant pendant 10 min à température ambiante. Les lames ont ensuite été bloquées avec du sérum d’âne à 10% pendant 1 h à température ambiante et incubées avec un anticorps anti-P16 (Ab54210, Abcam, 1:200) à 4 °C pendant une nuit et avec un anticorps secondaire (PV-6002, ZSGB-BIO) pendant 1 h à température ambiante avant coloration par tamponnement (ZLI-9017, ZSGB-BIO).

Déclarations éthiques

Les expériences impliquées dans cette étude ont suivi les Principes du Format de Demande d’Approbation Éthique pour la Recherche impliquant des Animaux et ont été approuvées à l’avance par le Comité Institutionnel de soins et d’Utilisation des Animaux de l’Institut de Zoologie (Académie Chinoise des Sciences). L’anesthésie des souris a été réalisée avec de l’isoflurane et l’euthanasie a été réalisée avec du CO2 suivie d’une luxation cervicale.

Analyse statistique

Des analyses statistiques ont été effectuées à l’aide du logiciel Graph-Pad Prism. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SEM ou SD. Des comparaisons ont été effectuées avec le test t de Student à deux queues non appariées. La valeur P (p) < 0,05 a été définie comme statistiquement significative.