L’Appauvrissement des Macrophages par des Liposomes Contenant du Clodronate Réduit la Formation Néointimale Après une Blessure par Ballonnet chez le Rat et le Lapin

Les cellules inflammatoires jouent un rôle majeur dans la réparation vasculaire, recrutées immédiatement après une blessure.1,2 L’infiltration de macrophages dans le tissu d’athérectomie et l’état d’activation des monocytes sanguins sont en corrélation avec un taux accru de resténose.3,4 Les effets des macrophages dans la resténose sont probablement causés par leur capacité à exprimer de nombreux facteurs de croissance, cytokines et enzymes qui contribuent au développement de la resténose.5 Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que l’inactivation systémique des monocytes et des macrophages peut entraîner une atténuation de la formation néointimale et que les macrophages jouent un rôle central dans la pathogenèse de la resténose.

La déplétion des macrophages peut être obtenue par l’injection systémique de liposomes contenant du clodronate.6 Le clodronate appartient à la famille des bisphosphonates (BPs), des agents de recherche osseuse qui sont de puissants inhibiteurs des ostéoclastes. Comme les autres BPs, le clodronate a une faible perméabilité de la membrane cellulaire.7 Les liposomes sont facilement absorbés par les cellules du système réticulo-endothélial, en particulier les macrophages. L’administration de clodronate par les liposomes inactive et tue les macrophages après une phagocytose efficace8, mais n’est pas toxique pour les cellules non phagocytaires.6

Méthodes

Liposomes

Le clodronate (Sifavitor) et la rhodamine RE (Lipides polaires Avanti) ont été encapsulés dans des liposomes composés de 50 µmol/L de distéaroyl-phosphatidylglycérol (DSPG) (Avanti), de 100 µmol/L de cholestérol (Sigma Chemicals) et de 150 µmol/L de 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DSPC) (Avanti) par technique d’évaporation en phase inverse, comme décrit ailleurs.9 La taille moyenne des liposomes était de 190 ±18 nm, 24,5 mmol/L et 20 mmol /L, respectivement le clodronate et les lipides.

La validation de l’activité biologique de la LC a été déterminée sur des cellules BRUTES de type macrophage de 264. Le clodronate LC mais non libre a réduit de manière significative le nombre et la prolifération de cellules viables de manière dose-dépendante et n’a pas affecté la viabilité et la prolifération des cellules musculaires lisses (SMC) ou des cellules endothéliales (EC) à des concentrations allant jusqu’à 500 µmol /L (données non présentées), conformément aux données publiées.8,10

Modèle Lapin

Lapins blancs de Nouvelle-Zélande (Laboratoires Harlan, Jérusalem, Israël) pesant 2,5 à 3.5 kg ont été utilisés conformément aux directives pour les soins aux animaux de l’Université hébraïque de Jérusalem et des Instituts nationaux de la Santé (États-Unis). Les animaux ont reçu un régime athérogène de 2% de cholestérol et 6% d’huile d’arachide, à partir de 30 jours avant l’angioplastie. Une hypercholestérolémie a été constatée (cholestérol plasmatique > 1200 mg / dL). Les animaux ont été anesthésiés par la xylazine (7 mg/ kg) et la kétamine (40 mg/ kg). L’héparine (200 U/kg), l’atropine (0,05 mg) et le nicotinate de norfloxacine (70 mg) ont été administrés. Une lésion par ballonnet a été réalisée sur l’artère carotide commune gauche avec un cathéter à ballonnet d’angioplastie de 3 mm (Cordis, gonflage de 2 × 1 minute à 8 atm). Les animaux ont été assignés au hasard à du clodronate liposomique intraveineux ou libre (15 mg/ kg), à des liposomes vides ou à un tampon. Un enquêteur aveuglé par le type de groupe expérimental a effectué les expériences. Après euthanasie avec pentothal, les artères ont été fixées par perfusion in situ avec 150 mL de solution de formaldéhyde à 4% (pH 7.4), traité pour analyse morphométrique, et coloré avec une coloration à l’élastine de Verhoeff, à l’hématoxyline de Mayer et à l’éosine, et au pentachrome Movat modifié.

Modèle de rat

Des rats Sabra mâles (Harlan Laboratories), pesant de 350 à 420 g, ont été utilisés. Le modèle de lésion de la carotide chez le rat a été réalisé comme décrit précédemment.11,12 clodronate liposomal (15 mg / kg) a été injecté aux jours -1 et +6. Les organes ont été prélevés le jour 14 et traités comme décrit ci-dessus.

Analyse morphométrique

Huit à 10 sections de chaque diapositive ont été analysées au moyen d’une analyse morphométrique informatisée (image NIH) par un chercheur aveugle au type du groupe expérimental. La section avec le plus grand rétrécissement luminal par neointima a été analysée comme décrit précédemment.11 La lumière résiduelle, la zone délimitée par la lame élastique interne (lumière d’origine) et la zone circonscrite par la lame élastique externe (surface artérielle totale) ont été mesurées directement. Le degré d’épaississement néointimal a été exprimé comme le rapport entre l’aire de la néointima et la lumière d’origine (% de sténose) et comme le rapport entre l’aire néointimale et l’aire du milieu (N / M). Le degré de remodelage, de constriction (négative) et d’expansion (positive) et le rapport de remodelage (RR) ont été estimés en comparant le rapport de la surface artérielle totale du segment lésé par ballonnet avec celui d’un segment de référence adjacent, non injuré.

Cytométrie en flux

Du sang anticoagulé (200 µL) a été incubé pendant 30 minutes (4°C, dans l’obscurité) avec de l’anti-CD14 conjugué RPE-humain de souris (DAKO). Une solution de lyse FACS (dilution 1:20) a été ajoutée pendant 15 minutes. Les cellules résiduelles ont été lavées (×1500 tr/min, 5 minutes, 4°C) en milieu FACS (PBS, 1% BSA, 0,02% azoture de sodium) et mises en suspension dans 1 mL de milieu FACS pour cytométrie en flux. Les monocytes ont été identifiés en fonction de leur taille relative, de leur diffusion latérale et de leur fluorescence.

Distribution des Liposomes

Des lapins ont été injectés avec des liposomes marqués à la rhodamine (0,4 mg/ kg) et du tampon LC ou au jour -1 et euthanasiés aux jours +1 et +6. Les monocytes sanguins ont été séparés à l’aide d’un gradient de Ficoll (Sigma) et d’une centrifugation (×1500 tr/min, 5 minutes). Les tissus récoltés ont été rincés au sérum physiologique ; des coupes ont été montées sur lames et observées par microscopie confocale (Zeiss LSM 410).

Immunohistochimie

Des échantillons explantés ont été excisés après une brève perfusion saline et immédiatement congelés dans un composé OCT pour cryosectioning (Ted Pella, Inc). Les lames ont été deparaffinées, incubées avec 1% d’H2O2 dans du méthanol (10 minutes) pour bloquer la peroxydase endogène, puis avec 10% de sérum de cheval PBS pendant (20 minutes). Des anticorps primaires pour le lapin RAM-11 (DAKO) ou le PCNA (PC10, DAKO) ont été appliqués pendant 1 heure à 37°C. Les coupes ont ensuite été lavées avec du PBS suivi d’un anticorps secondaire biotinylé (IgG anti-souris de cheval, Laboratoire Vector) et d’un complexe avidine-biotine-peroxydase (kit ABC Elite, Laboratoire Vector) pendant 30 minutes chacune. Le développement de la couleur a été obtenu par exposition de 5 minutes au tétrahydrochlorure de 3,3′-diaminobenzidine (substrat de peroxydase DAB, Sigma Chemical Co) en présence de substrat de peroxydase (Sigma). Les lames étaient légèrement contre-colorées avec l’hématoxyline no 3 de la branchie (Sigma). La coloration positive a été évaluée au microscope (Olympus, BX40) à 2×/0,25 10×/0.grossissement 25 et images vidéo numérisées. La prévalence des macrophages a été évaluée comme le pourcentage moyen de surface occupée par des cellules colorées positivement dans 5 à 6 champs de forte puissance.

Production et transcription d’IL-1β

Des groupes distincts d’animaux ont été utilisés pour ces études. Les artères et les foies ont été homogénéisés dans du tampon collagénase et l’IL-1β extraite a été mesurée à l’aide de kits ELISA commerciaux (systèmes R& D).

Pour l’analyse de la transcription inverse – réaction en chaîne par polymérase (RT-PCR), l’ARN des artères carotides a été extrait à l’aide d’un kit d’isolement d’ARN (Life Technologies). La qualité, la taille et la quantité d’ARN ont été examinées et les valeurs des bandes ont été normalisées en fonction de l’expression de l’ARNm de la β-actine.13

Activité de la métalloprotéinase-2 matricielle

L’activité de la collagénase du surnageant d’homogénéité des artères dans le tampon collagénase a été analysée. Les échantillons ont été séparés sur imprégnées de gélatine (1 mg/mL: Difco) Gels de polyacrylamide SPS à 8% en conditions non réductrices, agités 30 minutes dans du Triton X-100 à 2,5% (BDH), incubés dans du tampon collagénase (16 heures, 37 ° C) et colorés avec du Coomassie G 250 à 0,5% (BioRad) dans du méthanol / acide acétique / H2O (30:10:60). L’intensité de la bande a été déterminée par densitométrie informatisée (Dynamique moléculaire de type 300A).

Statistiques

Les données sont exprimées en moyenne±SD. Des comparaisons des résultats histologiques entre le groupe témoin et le groupe de traitement ont été faites par le test t de Student non apparié. Des comparaisons de monocytes sanguins et de cytokines au fil du temps ont été effectuées avec une analyse ANOVA à 2 voies. Les différences ont été qualifiées de statistiquement significatives à P < 0,05.

Résultats

Prévention de l’hyperplasie postangioplastie

Une prolifération massive de SMC et la formation de matrice extracellulaire ont été observées chez les animaux témoins après une blessure par ballonnet (Figure 1, a et b). Aucune différence significative n’a été trouvée entre le traitement par des liposomes vides, une solution saline ou du clodronate libre en solution (résultats regroupés en témoins). Le rapport N / M était de 1,4 ± 0,44 (Figure 1e) et la sténose luminale était de 75 ± 8%. La LC (15 mg / kg, jours -1 et + 6) a réduit le rapport N / M à 0,66 ± 0,2 (Figure 1, c, d et e) et la sténose luminale à 41 ± 8%. Un léger remodelage expansif s’est produit dans les deux témoins (RR = 1. 22±0,24) et les animaux traités par LC (RR = 1,29±0,25). La région médiale, la morphologie osseuse et la composition minérale n’ont pas été affectées par le traitement par LC (données non présentées). Aucune infection manifeste et aucun effet secondaire systémique détectable n’ont été observés.

Pour déterminer l’effet de la déplétion des macrophages dans un modèle animal non hypercholestérolémique (pas de cellules mousseuses), le modèle de lésion carotidienne du rat a été utilisé.11 La néointima marquée a été supprimée par un traitement par LC, sans changement significatif de la zone artérielle médiale et totale (tableau).

Mécanisme d’action

La réduction des monocytes sanguins et des Macrophages tissulaires

Le taux initial de monocytes était de 2,8 ±0,5% des globules blancs (WBC). Avant la chirurgie, 24 heures après l’injection de LC, les monocytes ont été fortement réduits à < 0,2% du total des WBC (Figure 2, a et b), tandis que le nombre de WBC est resté inchangé. Trois jours après la chirurgie, les monocytes sanguins ont été légèrement augmentés à 3,5 ± 0,4% chez les animaux témoins et à 0,7 ± 0,7% chez les animaux traités par LC, revenant aux niveaux de référence après 6 jours (figure 2c).

Les macrophages du foie et de la rate ont été réduits par LC (coloration RAM 11) 6 jours après la lésion (figure 3). La zone colorée positivement dans le foie a été significativement réduite de 21,5 ±4% à 14,7 ±2,9% et dans la rate de 33,3 ±1,5% à 11,4 ±3% chez les lapins témoins et traités par LC, respectivement. De même, une diminution de la coloration artérielle de la RAM-11 pour les macrophages a été observée chez les lapins traités par LC 3 et 6 jours après la lésion (figure 4).

Une réduction des monocytes et des macrophages a également été détectée par injection de liposomes fluorescents (FL). Une réduction marquée du signal fluorescent a été observée dans les monocytes sanguins (ainsi qu’un nombre réduit) et dans le foie et la rate des animaux traités par LC (figure 5). Des FL ont été détectés dans des artères blessées, mais pas dans des artères intactes. Le FL coadministré avec le LC a considérablement réduit le signal fluorescent dans la paroi artérielle lésée (figure 5).

Le PCNA, l’IL-1β et la métalloprotéinase matricielle-2

La zone colorée positivement pour le PCNA 6 jours après la lésion a été significativement réduite de 5,6 ±2,6% chez les animaux témoins à 1,7 ±1,3% chez les lapins traités par LC (Figure 6, a et b). Neointima a été à peine observé à ce début de période où la prolifération des SMC est maximale.

L’analyse des taux d’IL-1β dans le tissu artériel après une lésion a révélé un profil en forme de cloche culminant 6 jours après la lésion et revenant aux niveaux basaux après 30 jours (figure 7a), et une diminution significative des taux d’IL-1β a été observée après 3 et 6 jours chez les animaux traités par LC. Chez les animaux témoins, la transcription de l’ARNm de l’IL-1β était plus forte au jour 3 que l’expression la plus faible 1 jour après la blessure, mais les deux ont été significativement réduits par le traitement par LC (figure 7b). Les taux d’IL-1β dans le foie ont également été réduits après une seule injection de LC au jour -1, s’inclinant aux niveaux basaux à 30 jours (données non présentées).

L’activité de la métalloprotéinase de la matrice artérielle (MMP-2) a augmenté après une lésion, présentant un motif en forme de cloche culminant à 6 jours (292 ± 46) et revenant aux niveaux basaux à 14 jours (Figure 7c). La LC a considérablement atténué l’activité de MMP-2, et au jour 6, elle n’était que de 52 ± 17.

Discussion

Cette étude montre pour la première fois que l’inactivation des macrophages par administration systémique de clodronate encapsulé par des liposomes inhibe la perte luminale après une lésion par ballonnet chez le rat et le lapin hypercholestérolémique. Ces résultats valident notre hypothèse selon laquelle les macrophages jouent un rôle central dans la pathogenèse des artériopathies accélérées. L’augmentation observée de la surface luminale a été obtenue principalement par la réduction de l’hyperplasie néointimale. Une légère augmentation du remodelage expansif a également été démontrée, mais sa contribution à la différence de surface luminale était minime.

Le clodronate appartient à la famille des BPs, médicaments utilisés cliniquement dans les troubles osseux, y compris l’ostéoporose. Étant hautement hydrophiles et chargés négativement, les BP libres sont presque incapables de traverser les membranes cellulaires.L’absorption de 7 PB par les ostéoclastes résorbants osseux (provenant de macrophages provenant de monocytes sanguins) se produit lorsque les cellules engloutissent un os enduit de médicament.7 Ni le clodronate libre ni la LC n’ont inhibé la prolifération du SMC ou de l’EC ou la formation néointimale. L’endocytose efficace et sélective du clodronate dans les macrophages est obtenue en encapsulant du clodronate dans des liposomes.9,10,14 Après la phagocytose, l’action lysosomale perturbe les bicouches graisseuses du liposome et le clodronate libre est libéré dans la cellule, provoquant des dommages fonctionnels irréversibles et une apoptose.L’administration de 8,15

LC a probablement interrompu la réponse de phase précoce à la lésion, qui est médiée par la migration des macrophages en réponse à l’expression de MCP-1.16 L’injection de LC avant la lésion a fortement appauvri le monocyte sanguin (Figure 2) et le nombre et l’activité des macrophages dans le foie, la rate et la paroi artérielle lésée (Figures 3, 4 et 5). La réduction des monocytes disponibles au moment de la lésion a réduit l’hyperplasie intimale, peut-être similaire aux effets observés avec la désactivation des monocytes sanguins par l’IL-10.17 Bloquant la migration des monocytes / macrophages vers le vaisseau lésé à partir de la lumière et / ou de l’adventice (Figure 5) a empêché les effets de ces cellules sur la migration et la prolifération des SMC.

Les taux d’IL-1β et de MMP-2 ont été réduits dans les segments artériels lésés après le traitement par LC. Ces principaux produits de macrophages activés, sécrétés après une lésion artérielle, contribuent au processus de prolifération néointimale.18-20 Une prolifération réduite des CSM peut également contribuer à la réduction de l’IL-1β et du MMP-2.21 Néanmoins, puisque la LC n’affecte pas les CSM et les CSM et n’a aucun effet sur les fibroblastes,9 le macrophage est probablement la cible principale de la LC. L’inhibition de l’hyperplasie intimale dans le modèle de rat, sans cellules de mousse dans l’artère, soutient en outre l’épuisement systémique des macrophages, car le mécanisme conduisant à une prolifération réduite de SMC et à la formation néointimale. Pris ensemble, cet effet immunomodulateur systémique transitoire et anti-inflammatoire a réduit la migration et la prolifération du SMC et la resténose artérielle.

Nos résultats sont en même temps que les effets bénéfiques observés après modulation de la fonction des macrophages par diverses modalités. Une réduction de la formation de néointima après lésion a été obtenue chez le lapin par blocage de la Mac-122 et chez les souris déficientes en Mac-1.23 Ainsi, conformément aux rapports récents, 9,17,22,23 le processus inflammatoire joue un rôle central dans la cascade de la formation de néointima. L’épuisement des macrophages réduit également l’hyperplasie des greffes veineuses.24 Malgré les différentes pathologies en termes de déclencheur, de vaisseau affecté, de plaque sous-jacente dans l’artère angioplastie, de composition du tissu sténotique et de durée du processus, l’effet positif dans le modèle de greffe veineuse suggère un rôle commun des macrophages dans la stimulation de l’hyperplasie intimale vasculaire.

Implications et limites

Le clodronate libre ne pénètre pas dans les cellules et a une demi-vie courte dans la circulation systémique.6 Le clodronate qui s’échappe des macrophages et des liposomes morts ne s’accumule pas de manière significative dans les tissus autres que les os. Aucun effet n’a été observé sur la croissance somatique ou sur la teneur en minéraux sériques après le traitement par LC, car le résultat de la formulation liposomale, comme avec la plupart des autres liposomes et systèmes d’administration de médicaments particulaires, se trouvait dans le système réticulo-endothélial. De plus, deux injections de 15 mg / kg de clodronate libre ne devraient avoir aucun effet sur l’os normal.25

L’inactivation des macrophages comporte un danger d’immunosuppression et d’infection. Cependant, comme dans les études sur le mice26 déficient en Mac-1 et les rats24, aucune infection manifeste n’a été observée dans notre étude avec une déplétion transitoire des macrophages. Les monocytes sanguins se sont complètement rétablis dans cette étude 6 jours après l’injection et les concentrations d’IL-1β sont revenues aux niveaux basaux. D’autres ont montré que la récupération de la fonction des macrophages 4 à 6 jours après l’épuisement induit par la LC n’induisait aucun effet toxique à long terme.6,14 Les implications cliniques d’une déplétion transitoire et partielle des macrophages hépatiques et spléniques avec LC systémique devraient être examinées plus en détail dans les essais chez l’homme.

Un grand nombre de rapports de tentatives pharmacologiques d’inhibition de l’hyperplasie intimale chez l’animal ne se sont pas traduits par une inhibition ultérieure de la resténose chez l’homme. La présente étude utilise la LC comme outil d’investigation pour élucider le rôle de l’inflammation dans la réparation vasculaire et la valeur possible de la modulation de l’immunité innée dans la réduction de l’hyperplasie intimale post-blessure. Le fait que le bénéfice ait été observé chez deux modèles animaux, le rat et le lapin hypercholestérolémique, avec des lésions disparates et des degrés d’inflammation différents, confirme le rôle majeur des monocytes et des macrophages dans la réparation vasculaire et augmente la valeur prédictive de l’inhibition de la resténose chez l’homme.

Les zones riches en macrophages sont répandues dans les lésions athérosclérotiques des patients souffrant d’angor instable et d’infarctus aigu du myocarde,3 et les macrophages médient probablement la rupture de la plaque athéroscléreuse et l’apparition soudaine de syndromes coronaires aigus.27 D’autres études sont justifiées pour déterminer si l’appauvrissement des macrophages par les bisphosphonates liposomaux peut conférer une stratégie pour stabiliser d’autres vasculopathies et cardiomyopathies à médiation inflammatoire, y compris les syndromes coronariens aigus.

En conclusion, l’administration de LC a inhibé la prolifération néointimale après lésion par ballonnet chez le rat et dans les modèles de lapins hypercholestérolémiques. Le mécanisme suggéré est une modulation transitoire sélective systémique de l’activité monocyte/macrophage. Les macrophages, bien que relativement maigres dans les tissus néointimaux, jouent un rôle majeur dans le processus de prolifération néointimale. Par conséquent, la modulation précoce et l’inactivation des macrophages pendant 1 semaine après la blessure diminuent considérablement le rétrécissement artériel postangioplastie à un moment ultérieur.

Notes de bas de page