Le collagène de type III est crucial pour la fibrillogenèse du collagène I et pour le développement cardiovasculaire normal

RÉSULTATS ET DISCUSSION

Les cellules ES (J-1) (22) ont été transfectées avec un vecteur de ciblage contenant un fragment d’ADN génomique du gène Col3a1 dans lequel la région promotrice du gène et le premier exon codant pour le peptide signal ont été supprimés (Fig. 1 BIS). Des clones de cellules ES ciblées ont été identifiés par analyse Southern blot et utilisés pour l’injection de blastocystes (Fig. 1B Supérieur). Des souris mutantes ont été dérivées de deux clones de cellules ES ciblés indépendamment et identifiées par analyse Southern blot (Fig. 1B Plus bas). L’analyse des protéines du collagène de la queue et de la peau a montré que les souris mutantes hétérozygotes ont une réduction d’environ 50% du collagène de type III alors qu’aucun collagène de type III n’a été détecté chez les animaux mutants homozygotes (Fig. 1C).

Les animaux mutants étaient fertiles, mais seules les souris hétérozygotes étaient phénotypiquement normales. Les souris mutantes homozygotes affichaient un taux de survie moyen de 5 % à l’âge du sevrage, la plupart des décès survenant dans les 48 premières heures suivant la naissance (tableau 1). La cause précise de la létalité néonatale n’est pas claire car les chiots morts ont été cannibalisés avant de pouvoir être examinés, et l’analyse histologique au microscope optique des mutants homozygotes vivants du nouveau-né n’a détecté aucune anomalie grave. Les souris mutantes homozygotes adultes semblaient normales, sauf qu’elles étaient environ 15 % plus petites que leurs congénères de type sauvage du même sexe (données non présentées). La durée de vie moyenne des souris mutantes homozygotes était cependant d’environ 6 mois, soit un cinquième de la durée de vie normale. L’autopsie a montré que la rupture des vaisseaux sanguins était la principale cause du raccourcissement de la durée de vie de ces souris (tableau 2). Les sites de rupture étaient sporadiques et principalement associés à de gros vaisseaux sanguins. Une analyse histochimique a été effectuée pour trouver le défaut à l’origine de la fragilité de la paroi des vaisseaux sanguins. Figue. 2 A et B montrent une coupe transversale de l’aorte abdominale normale. La paroi de l’aorte est constituée d’intima et de médias (Fig. 2A, flèche) et l’adventice (Fig. 2 A et B, pointes de flèches). Le milieu est constitué de fibres élastiques (Fig. 2B, grandes flèches) et les cellules musculaires lisses (Fig. 2B, petites flèches) et assure l’élasticité de l’aorte tandis que l’adventice comprend principalement des fibrilles de collagène de type I et limite la dilatation de l’aorte. Figue. 2C montre une coupe transversale d’un anévrisme disséquant de l’aorte abdominale d’une souris mutante homozygote. La rupture a traversé les médias (flèche), ce qui a conduit à un canal rempli de sang (étoile) entre les médias et l’adventice (pointes de flèches) et a partiellement effondré la lumière de l’aorte. L’adventice s’est finalement rompue ailleurs et le sang s’est infiltré dans la cavité péritonéale, comme c’est le cas chez les humains atteints d’anévrisme aortique mortel (20). La disposition globale des fibres élastiques et des cellules musculaires lisses (Fig. 2D) était similaire à celle des commandes (Fig. 2B). L’intensité et la distribution du matériau de la matrice extracellulaire et la coloration plus foncée dans l’adventice et entre les fibres élastiques et les cellules musculaires lisses dans l’intima des souris mutantes (Fig. 2D) étaient comparables à celles des témoins sauvages (Fig. 2B). Aucune anomalie évidente du cœur et des artères moyennes et petites chez les animaux mutants n’a été observée au microscope optique (données non présentées).

En plus de l’anévrisme, les souris mutantes ont montré une hypertrophie intestinale fréquente et une rupture intestinale occasionnelle entraînant la mort (tableau 2). Environ 60% des souris mutantes homozygotes présentaient des lésions cutanées, dont les plus graves se présentaient sous la forme d’une plaie ouverte de ≈1 cm de longueur au niveau de l’épaule, qui pénétrait complètement la peau et exposait le tissu sous-cutané (Fig. 3). Les blessures n’étaient pas dues à des combats entre animaux, car elles ont été observées chez des animaux en cage séparément. L’analyse au microscope optique de la peau, de l’intestin et d’autres organes internes, y compris le foie et les poumons, n’a révélé aucune anomalie manifeste chez les animaux mutants (données non présentées).

Pour définir les défauts structurels chez les animaux mutants, des analyses au microscope électronique de l’aorte et du cœur ont été effectuées. Figue. 4 montre que les fibrilles de collagène situées entre les cellules musculaires lisses ou entre les cellules musculaires lisses et les fibres élastiques (Fig. 4A, flèches) étaient absents ou fortement réduits dans le milieu de l’aorte mutante (Fig. 4B, flèches). Plus frappant encore, dans l’adventice où la majorité du collagène est de type I, le diamètre des fibrilles de collagène de l’aorte mutante était très variable (voir Fig. 4 D à C). Lorsque les fibrilles ont été comptées et que le diamètre de ces fibrilles a été mesuré dans une zone donnée de l’adventice, nous avons constaté que le nombre de fibrilles chez les mutants était réduit à environ un tiers de celui des souris de type sauvage alors que le diamètre moyen des fibrilles chez les mutants était environ le double de celui des souris de type sauvage (Fig. 5). Comme dans l’aorte, les fibrilles de collagène entre l’épicarde et le myocarde étaient réduites ou manquantes et les microvillosités de l’épicarde étaient sous-développées dans le cœur des souris mutantes (données non montrées).

En plus du système cardiovasculaire, la peau, l’intestin, le foie et le poumon de souris mutantes ont été examinés par microscopie électronique. Comme pour l’adventice de l’aorte, le collagène et les fibrilles dans la peau mutante (Fig. 4F, flèches et pointes de flèches) étaient désorganisées et leur diamètre était très variable par rapport à ceux des souris sauvages (Fig. 4E, flèches). Cette altération a également été observée dans le foie et le poumon de souris mutantes (données non présentées). De plus, les fibrilles de collagène étaient manquantes ou fortement réduites dans la sous-muqueuse et la séreuse des intestins mutants (données non montrées), ce qui suggère que les fibrilles de collagène dans ces zones sont principalement des fibrilles de collagène de type III.

Des études antérieures introduisant des mutations ciblées dans les gènes Col1a1, Col2a1, Col5a2 et Col9a1 ont apporté des informations importantes sur la fonction de ces collagènes (24-27). Nous montrons ici que le collagène de type III joue un rôle essentiel dans la fibrillogenèse, qui est une partie importante du développement d’organes tels que le système cardiovasculaire, l’intestin et la peau. L’absence de collagène de type III a perturbé la fibrillogenèse et a entraîné un développement défectueux et une défaillance fonctionnelle de ces organes. Dans des conditions physiologiques, le collagène de type III n’est pas seulement un composant essentiel des fibrilles dans les tissus tels que les milieux de l’aorte, mais aussi un élément régulateur important dans la fibrillogenèse du collagène de type I. Nos résultats suggèrent que le collagène de type III régule le diamètre des fibrilles de collagène de type I, qui sert de mécanisme pour répondre aux exigences physiologiques de différents tissus ou d’un tissu à différents stades de développement. Le phénotype des souris déficientes en collagène de type III ressemble étroitement aux manifestations cliniques des patients atteints du syndrome d’Ehlers–Danlos de type IV chez qui la mort résulte d’une rupture des vaisseaux sanguins ou de l’intestin (20). Ces souris mutantes devraient donc s’avérer de bons modèles animaux pour comprendre cette maladie et éventuellement tester des approches thérapeutiques.