Le traitement des semences à la Clothianidine n’a pas d’impact négatif détectable sur les colonies d’abeilles domestiques et leurs agents pathogènes

Plan d’étude

En 2013, un total de 16 champs (8,9 ± 5,4 ha; moyenne ± s.d.) dans le sud de la Suède, destinés au colza oléagineux semé au printemps (Brassica napus L.) ont été appariés en fonction de la proximité géographique (mais séparés de > 4 km) et de l’utilisation des terres (Fig. 1, voir ci-dessus). Le paysage environnant a été inspecté pour l’absence de cultures en fleurs. Cependant, en 2013, deux champs sont restés dans l’étude même si un autre champ de colza était présent à proximité, afin de conserver autant de paires de fermes que possible34. Dans chaque paire de fermes, un champ a été assigné au hasard pour être semé avec des graines de colza traitées à la clothianidine, tandis que l’autre champ a été semé avec des graines non traitées à la clothianidine (traitées: 8; témoins: 8). Les mêmes fermes appariées ont été utilisées en 2014, mais avec les traitements inversés, c’est-à-dire que les emplacements avec des champs traités en 2013 avaient des champs témoins en 2014 et vice versa (traités: 6; témoins: 4). En raison de la rotation des cultures, différents champs de chaque ferme ont été utilisés en 2013 et 2014 (Fig. 1, voir ci-dessus). Afin de créer la Fig. 1, nous avons téléchargé une carte de la base de données des frontières du monde (téléchargeable ici: http://thematicmapping.org/downloads/world_borders.php).

Des informations sur les variables du paysage environnant pour les différentes exploitations agricoles en 2014 sont présentées dans le tableau supplémentaire 7. En 2014, la moitié des champs focaux avaient du colza supplémentaire semé au printemps (1 à 13 ha) dans un rayon de 2 km. Les graines traitées à la clothianidine pour les champs focal ont été recouvertes d’Elado, un mélange de deux ingrédients actifs déposé par la marque déposée: la clothianidine (400 g l-1) et la β-cyfluthrine (+80 g l−1), choisies pour cette étude parce qu’il s’agissait du traitement insecticide de semences prédominant dans le colza en Suède et dans d’autres parties de l’Europe63. La clothianidine est absorbée par la plante et distribuée de manière systémique à toutes ses parties pour se protéger contre les insectes64. la β-cyfluthrine n’est pas considérée comme systémique et aucun résidu n’a été détecté dans les échantillons recueillis dans le cadre de cette étude34. Les graines traitées à la clothianidine et les graines témoins ont été enrobées du fongicide thiram en 2013.

Les agriculteurs participants ont reçu l’instruction de ne pas utiliser d’autres néonicotinoïdes dans les champs pendant l’étude, bien que d’autres pulvérisations foliaires insecticides, principalement Plenum (pymétrozine), Avaunt/Steward (indoxacarbe) et Mavrik (tau-fluvalinate; également utilisé comme varroacide en apiculture), aient été utilisées pour la lutte antiparasitaire (tableau supplémentaire 8). Cependant, Biscaya, nom commercial pour une formulation de pulvérisation contenant le thiaclopride néonicotinoïde, a été appliqué sur un champ témoin en 2013, suivi d’un spray Mavrik 1 semaine plus tard, et sur un champ traité en 2014, à chaque fois à 0,3 L ha−1. Le thiaclopride a une toxicité aiguë considérablement plus faible pour les abeilles que la clothianidine65 et seules des traces de thiaclopride ont été détectées dans les échantillons de pollen, de nectar et d’abeilles en 2013 et aucune en 2014. Tandis que Rundlöf et al.34 n’a observé aucun changement dans les résultats lorsque les champs où Biscaya a été appliqué ont été exclus des analyses, nous avons détecté des changements qualitatifs (Tableau supplémentaire 9). Ces changements pourraient être dus aux résidus thiacloprides plus élevés détectés en 2014, mais pourraient tout aussi bien ne pas être liés à Biscaya mais plutôt à la différence entre le Biscaya / Mavrik et les combinaisons de pulvérisation d’insecticides alternatives utilisées34 ou être dus à une puissance statistique réduite.

Colonies d’abeilles

Cent seize colonies d’abeilles ont été préparées à la fin du mois de mai 2013 par un apiculteur professionnel dans des ruches Langstroth simples de taille normale contenant deux peignes à couvain principalement scellé (avec des abeilles), deux nids d’abeilles pleins (avec des abeilles), un peigne vide étiré, cinq peignes avec fond de cire, des abeilles secouées de deux peignes et soit un 1 an (84 colonies expérimentales) ou 2 ans – reine ancienne (12 colonies expérimentales plus 20 colonies de réserve) d’ascendance connue pour produire des abeilles relativement petites et de taille égale (3418 ± 123 abeilles adultes; moyenne ± m.e.m.; n = 96 colonies) colonies avec beaucoup de place pour la croissance qui pourraient devenir assez fortes pour survivre à l’hiver à venir, mais ne pas dépasser leur espace pendant l’été. Six colonies expérimentales ont été placées le long de la lisière du champ dans chacun des 16 champs de colza (96 colonies au total) entre le 14 et le 28 juin 2013 au début de la floraison du colza (fig. 1). La lignée et l’âge des reines ont été appariés entre les couples de ferme, mais les colonies ont été réparties de manière aléatoire. Les colonies ont été maintenues dans un champ de colza d’hiver de 60 ha à gestion biologique en pleine floraison avant d’être placées dans les 16 champs expérimentaux (fig. 1) pour s’assurer que la croissance des colonies avant l’expérience était basée autant que possible sur une recherche de nourriture sans pesticides.

Lorsque la floraison du colza dans le champ expérimental a cessé, les colonies ont été déplacées entre le 2 et le 31 juillet (fig. supplémentaire. 1) dans un rucher commun pour hiverner. Le 10 août, les colonies ont reçu un traitement à la vapeur d’acide formique contre les acariens Varroa, composé de 20 ml d’acide formique à 60% imbibé d’une éponge domestique plate placée sous le couvercle interne au-dessus des cadres. Les colonies ont reçu un total de 20 kg de sucre par colonie sous forme d’une solution de saccharose à 55-60% v / v, fournie dans une boîte d’alimentation à trois reprises en août–septembre 2013. Un traitement de Varroa léger supplémentaire a été effectué le 4 décembre par aspersion de 30 ml d’acide oxalique à 2,6% dans du saccharose à 60% entre les cadres, directement sur la grappe d’abeilles. Au printemps 2014, les colonies ont été déplacées dans un champ de colza à gestion biologique avant d’être placées dans les 10 champs de colza semés au printemps (fig. 1). Les colonies ont été considérées pour inclusion dans la partie 2014 de l’étude si elles avaient une reine pondeuse de 2 ans en avril 2014 (à l’exclusion des colonies qui sont mortes, re-mises en reine ou avaient des reines de 3 ans en avril 2014) et n’avaient pas essaimé au début de juin 2014. Ces restrictions, en plus de l’exigence selon laquelle les colonies seraient exposées/non exposées à la clothianidine pendant les deux années de l’expérience, signifiaient qu’en 2014, seules quatre colonies pouvaient être allouées à chaque champ. Les colonies placées dans des champs traités en 2013 ont de nouveau été placées dans des champs traités en 2014, afin d’évaluer les effets cumulatifs d’une exposition pluriannuelle à la clothianidine, mais ont été par ailleurs re-randomisées avant le placement afin de minimiser les biais involontaires. Malgré cela, deux colonies témoins de 2013 ont dû être placées dans un champ traité à la clothianidine en 2014, en raison d’un nombre insuffisant de colonies exposées admissibles pour les six champs traités à la clothianidine. Suffisamment de colonies étaient disponibles pour les quatre champs témoins. La force des colonies a été égalisée comme décrit pour 2013, mais seulement au sein de chaque groupe de traitement. Les colonies ont été réduites et égalisées une deuxième fois (8 juin 2014), après que certaines d’entre elles eurent pris trop d’ampleur et tenté d’essaimer (fig. 1). Chaque colonie réduite comprenait 1 peigne à miel complet (avec abeilles), 3 peignes avec couvain principalement scellé (avec abeilles), et la reine originale de 2013 et 6 peignes avec fond de teint en cire. Les colonies ont été déplacées vers les champs de colza de printemps entre le 16 et le 25 juin 2014 et ramenées sur le site d’hivernage commun entre le 14 et le 22 juillet 2014 (fig. 1).

Analyses des résidus

Pour confirmer l’exposition à la clothianidine, 24 abeilles adultes par champ capturées à l’entrée de la ruche, des granules de pollen prélevés sur 5 abeilles butineuses dans les champs de colza oléagineux et du nectar retiré de l’estomac de 5 abeilles butineuses dans les champs de colza oléagineux ont été analysés à partir de chaque site à la recherche de résidus de clothianidine. Le pollen (> 25 ml) a été collecté à l’aide de pièges à pollen installés pendant 1 jour sur trois colonies par site et analysés pour déterminer l’origine des espèces végétales. Les échantillons ont été manipulés et analysés comme dans Rundlöf et al.34 et récoltées lors des évaluations des pics de floraison au cours des deux années (Fig. 1), avec les concentrations de clothianidine et de quatre autres néonicotinoïdes utilisées en Suède (Tableau supplémentaire 2) quantifiées par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS / MS) et le pollen identifié au type de colza par microscopie optique et une bibliothèque de référence de pollen (voir Tableau supplémentaire 2 pour les limites de détection et de quantification). Pour des analyses plus approfondies de la variation de l’exposition aux néonicotinoïdes des abeilles dans différents sites, nous avons collecté 12 abeilles par site à l’entrée de la ruche. Cet échantillonnage a été effectué sur trois sites traités à la clothianidine en 2013. Le nectar a été extrait de l’estomac de miel des abeilles collectées. Les concentrations de clothianidine ont ensuite été quantifiées à la fois dans le nectar et le tissu d’abeille pour chaque individu d’abeille. Plus de détails sur le traitement des échantillons pour différentes matrices, la méthode LC-MS / MS et les contrôles de qualité sont donnés dans les Méthodes supplémentaires.

Le développement des colonies, le ré-assèchement et la production de miel

Le développement des colonies d’abeilles a été évalué par le même observateur qualifié et un assistant. La présence d’une reine pondeuse a été établie, ainsi que la présence de cellules royales. Si un événement de récusation s’accompagnait d’une perte importante d’abeilles adultes, il était réputé avoir essaimé. Si aucune perte d’abeilles adultes n’a été observée, la colonie a été réputée avoir été rétablie par sursédure. La production et le développement du miel des colonies ont été déterminés en pesant les colonies et en évaluant la force des colonies à l’aide de la méthode de Liebefeld 66, comme le nombre total d’abeilles adultes et la superficie de couvée couverte sur toutes les montures. Le nombre d’abeilles adultes a été estimé en comptant les abeilles des deux côtés des 10 cadres. Le nombre de cellules couvées (quantité de couvées) a été déterminé en multipliant la proportion de couvées fermées par 2700, qui est le nombre de cellules d’un côté des cadres utilisés. Les colonies ont été pesées lors d’évaluations pré-exposition et post-exposition (à l’aide d’une balance de banc Mettler Toledo pouvant peser jusqu’à 32 kg avec une précision de 1 g), pour estimer la production de miel. Les cadres pleins de miel ont été remplacés par des cadres vides pendant la floraison du colza, pour permettre à la colonie de croître et de réduire l’essaimage. Les cadres pleins et vides ont été pesés pour être inclus dans le calcul de la production de miel. Lors de l’évaluation post-exposition, autant de cadres de miel que possible ont été retirés (maximum 10% de la surface couverte de couvain couvert) pour simuler la récolte de miel des apiculteurs. Des évaluations préalables à l’exposition ont été effectuées dans le champ de colza ensemencé en hiver à gestion biologique du 6 au 17 juin 2013 et du 9 au 11 juin 2014, et des évaluations post-exposition dans le rucher commun d’hivernage du 29 juillet au 9 août 2013 et du 28 au 31 juillet 2014 (Fig. supplémentaire). 1). De plus, une évaluation de la force des colonies printanières a été réalisée en avril 2014 en estimant le nombre total d’abeilles adultes et le nombre de couvées plafonnées (fig. 1). L’évaluateur de la colonie et les assistants ont été aveuglés pendant la collecte des données concernant le régime de traitement des champs.

Collecte et traitement d’échantillons d’agents pathogènes et de parasites

Des échantillons d’environ 100 abeilles adultes ont été prélevés dans chaque colonie lors d’évaluations pré et post-exposition dans les champs expérimentaux de colza traités à la clothianidine et témoins en 2013 et 2014 (fig. supplémentaire. 1). Les abeilles ont été prélevées dans le peigne extérieur de chaque colonie et se composaient donc d’un mélange d’abeilles domestiques et d’abeilles butineuses 67. Tous les échantillons d’abeilles ont été stockés à -20 ° C jusqu’à ce que les travaux de laboratoire soient effectués. Le V. les taux d’infestation par destructeurs pour chaque colonie ont été déterminés en lavant les échantillons d’abeilles adultes avec de l’eau savonneuse pour déloger et compter les mites68. L’abdomen de 60 abeilles adultes par colonie (pour les analyses de colonies individuelles) ou par rucher (pour les analyses de colonies groupées de 2013, 10 abeilles par colonie) a été retiré et placé dans un sac en polyéthylène avec une maille intérieure (BioReba). Les abdomens ont été broyés dans le sac à l’aide d’un pilon et 30 ml d’eau sans nucléase (Milli-Q) (0,5 ml par abeille) ont été mélangés à fond avec l’échantillon pour créer une suspension homogène. Plusieurs aliquotes de 1 ml de cette suspension ont été retirées et congelées immédiatement à -80 °C pour l’extraction de l’ADN et de l’ARN et comme matériau de référence futur.

Parasites, agents pathogènes, microbes symbiotiques et gènes immunitaires

Les échantillons d’abeilles collectés ont été évalués pour une variété de parasites et de microbes pathogènes et non pathogènes afin d’étudier l’impact du placement de colonies dans des champs traités à la clothianidine sur leur prévalence et leur abondance. Les organismes comprenaient l’ectoparasite ubiquitaire Varroa destructor, 13 virus: virus de la paralysie aiguë des abeilles (ABPV), virus de la paralysie létale des pucerons (ALPV), virus de la rivière Big Sioux (BSRV), virus de la cellule reine noire (BQCV), virus de la paralysie chronique des abeilles (CBPV), virus de l’aile déformée de type A (DWV-A), virus de l’aile déformée de type B (DWV-B), virus israélien de la paralysie aiguë (IAPV), virus de l’abeille du Cachemire (KBV), souche 1 du virus du lac Sinaï (LSV-1) et souche 2 (LSV-2), virus de la sacro- SBV), le virus de la paralysie lente des abeilles (SBPV); deux parasites intestinaux microsporidiens communs des abeilles (Nosema apis et Nosema ceranae) et deux bactéries intestinales symbiotiques (Gammaproteobacterium: Gilliamella apicola et Betaproteobacterium: Snodgrassella alvi). Pour les échantillons de 2013, nous avons également analysé au niveau des ruchers les taux d’ARNm de huit gènes d’abeilles mellifères (Amel/LRR, Apidaecin, cSP33, Dorsal-1A, Eater-like, NimC2, PGRP-S2 et SPH51) dont l’expression avait été précédemment liée à l’exposition aux pesticides, aux agents pathogènes et/ou aux parasites19,44 et à l’immunité (sociale) des abeilles mellifères 45.

Extraction de l’acide nucléique

L’ADN a été extrait des homogénats d’abeilles en utilisant le protocole d’extraction de l’ADN des spores de Nosema 69, qui est suffisamment robuste pour extraire également de l’ADN de bactéries et d’autres microorganismes. Un total de 500 µl d’homogénéat primaire d’abeille a été centrifugé pendant 5 min dans une microfuge à 13 000 tr/min. La pastille a été congelée à plusieurs reprises – décongelée avec de l’azote liquide et broyée avec un micropestle stérile en téflon jusqu’à ce qu’elle soit pulvérisée. Le culot pulvérisé a été remis en suspension dans 400 µl de tampon de lyse Dneasy AP1 de tissus végétaux Qiagen contenant 4 µl de RNase-A (10 mg ml−1) et incubé et agité pendant 10 min à 65 oC, après quoi 130 µl de tampon de neutralisation P3 (acétate de potassium 3,0 M pH 5.5) a été ajouté, suivi de 5 min d’incubation sur glace et de centrifugation pendant 5 min à 14 000 tr/min pour éliminer les débris de lyse. L’ADN a été purifié à partir de 500 µl du surnageant par le robot d’extraction Qiacube automatisé Qiagen, en suivant le protocole DNeasy de la plante et en éluant l’ADN dans 100 µl d’eau sans nucléase. L’ARN a été extrait par le robot Qiacube directement à partir d’un homogénéat primaire de 100 µl d’abeilles à l’aide du protocole RNeasy de la plante Qiagen (y compris le déchiqueteur Qia pour une homogénéisation supplémentaire 70) et l’ARN a été élué dans 50 µl d’eau exempte de nucléase. La concentration approximative en acide nucléique a été déterminée par NanoDrop, après quoi les échantillons ont été dilués avec de l’eau exempte de nucléase jusqu’à une concentration uniforme de 10 ng µl-1 (ADN et LSV−1 (ARN)) ou de 20 ng µl-1 (pour tous les autres échantillons d’ARN) et stockés à -80 ° C.

RT−qPCR et qPCR

Les différents microorganismes et cibles d’ARNm de l’hôte ont été détectés et quantifiés par PCR (RT-qPCR) pour les agents pathogènes avec un génome d’ARN et les cibles d’ARNm du gène de référence immunitaire et interne, ou par PCR quantitative (qPCR) pour les organismes avec un génome d’ADN. Les détails des essais sont présentés dans le Tableau Supplémentaire 10, le Tableau Supplémentaire 11 et le Tableau Supplémentaire 12. L’amorce inverse pour Amel / LRR a été légèrement repensée à partir de Di Prisco et al.19 parce que la complémentarité extrêmement élevée entre les amorces avant et arrière d’origine a entraîné des niveaux élevés d’artefacts de PCR dominant le signal quantitatif. Les réactions ont été conduites en double, dans des volumes réactionnels de 20 µl (ADN) ou 10 µl (ARN) contenant un gabarit de 2 µl (ADN) ou 1,5 µl (ARN), 0,4 µM (ADN) ou 0.2 µM (ARN) d’amorces avant et arrière et soit le mélange qPCR Bio-Rad Eva Green (ADN), soit le mélange RT-qPCR iTaq en une étape Bio-Rad avec chimie de détection verte SYBR (ARN). Les réactions ont été incubées dans des plaques qPCR optiques à 96 puits dans le thermocycleur Bio-Rad CFX connect, en utilisant les profils de cycles d’amplification suivants : 10 min à 50 °C pour la synthèse d’ADN complémentaire (ADNc) (RT-qPCR uniquement): 5 min à 95 °C (pour inactiver la transcriptase inverse et activer la Taq polymérase) suivi de 40 cycles de 10 s à 95 °C pour la dénaturation et de 30 s à 58 °C pour le recuit d’amorce, l’extension et la collecte de données. Pour les essais d’ADN, les profils de cycles d’amplification suivants ont été utilisés: 2 min à 98 ° C pour la dénaturation initiale, suivis de 40 cycles de 5 s à 98 °C pour la dénaturation et de 10 s à 60 ° C pour le recuit d’amorçage, l’extension et la collecte de données. Les cycles d’amplification ont été suivis d’une analyse de la courbe de fusion pour déterminer la spécificité de l’amplification en lisant la fluorescence par incréments de 0,5 °C de 65 °C à 95 °C. Sur chaque plaque réactionnelle étaient inclus des contrôles de dosage positifs et négatifs (non-gabarit). Pour chaque type de dosage (Tableau Supplémentaire 10, Tableau Supplémentaire 11 et Tableau Supplémentaire 12), une courbe d’étalonnage a été préparée par une série de dilution 10 fois d’un témoin positif de concentration connue couvrant 6 ordres de grandeur, pour la conversion de données quantitatives, l’établissement du profil de courbe de fusion de référence de l’amplicon et l’estimation des statistiques de performance de la réaction.

Conversion et normalisation des données

Les courbes de fusion des réactions individuelles ont été évaluées visuellement afin de séparer les amplifications non spécifiques, qui diffèrent dans les profils de température de fusion des amplicons ADNc /ADN cibles véritables. Les amplifications non spécifiques ont été supprimées de l’ensemble de données. Tous les essais ont été effectués en double, la valeur moyenne de ces deux doublons étant utilisée dans d’autres calculs. Les deux doublons devaient produire une valeur quantitative positive et réussir l’analyse de la courbe de fusion pour que les données soient incluses dans l’ensemble de données. Les données brutes de RT-qPCR de toutes les amplifications confirmées ont ensuite été converties en nombres estimés de copies de chaque ARN cible, en utilisant la courbe d’étalonnage correspondante pour le test. Ces données ont été multipliées par les différents facteurs de dilution tout au long de la procédure pour calculer les copies estimées de chaque cible par bee69. Étant donné que l’ARN se dégrade facilement, il existe un risque que des différences entre les échantillons individuels dans la qualité de l’ARN (c’est-à-dire la dégradation) puissent affecter les résultats70. Pour corriger cela, des tests RT-qPCR pour l’ARNm d’un gène de référence interne commun de l’abeille domestique (RP49) ont été effectués sur tous les échantillons. Les données pour les cibles d’ARN d’intérêt ont ensuite été normalisées à la valeur moyenne pour l’ARNm RP49, corrigeant ainsi les données pour les différences de qualité d’ARN spécifiques à l’échantillon par rapport à la performance RT-qpcr70.

Analyses statistiques

Les proportions de pollen collecté par des abeilles provenant de plantes de type colza ont été comparées entre les traitements (traitement des graines de clothianidine / non traitées) en utilisant un modèle linéaire généralisé en supposant une distribution binominale et en corrigeant la surdispersion. Les concentrations de clothianidine dans le nectar et le pollen recueillis par les abeilles et dans les tissus d’abeilles ont été comparées entre les traitements à l’aide de tests Wilcoxon–Mann–Whitney. Pour comparer les concentrations de clothianidine dans le tissu d’abeilles et le nectar d’abeilles individuelles entre les champs, nous avons utilisé des analyses de variance (ANOVA), avec l’identité du champ comme prédicteur. De plus, les concentrations de clothianidine dans les tissus et la teneur en nectar de l’estomac des abeilles individuelles ont été mises en relation en utilisant une régression linéaire multiple avec l’identité du champ et la concentration de clothianidine dans le nectar comme variables explicatives et la concentration de clothianidine dans les tissus d’abeilles comme variable de réponse.

L’étude a suivi en général un plan d’impact avant-après-contrôle (BACI), avec une structure de champ appariée, répété pendant deux années consécutives au niveau de la colonie pour obtenir des données sur le développement de la colonie ainsi que sur la prévalence et l’abondance des parasites, des agents pathogènes et des bactéries intestinales. Les années 2013 et 2014 ont été analysées ensemble dans un modèle complet, avec le traitement des semences, la floraison, l’année et leurs interactions comme facteurs fixes. L’effet du traitement à la clothianidine a été évalué par l’interaction entre la floraison et le traitement des semences, car ce terme reflète la différence de changement entre les traitements par rapport à la ou aux fleurs de colza. Si l’interaction à trois voies (bloom × seed treatment × year) était significative (c’est-à-dire si la variable réagissait différemment au traitement à la clothianidine d’une année à l’autre), l’ensemble de données était divisé par année et l’année était supprimée comme facteur fixe. De plus, l’ensemble de données n’a été analysé que pendant 1 an si les données consistaient en une taille d’échantillon ≤10 en une année à la fois pour la prévalence et l’abondance du microbiote (tableau supplémentaire 1). Les colonies qui ont essaimé (8 dans les champs témoins et 10 dans les champs traités à la clothianidine en 2013; une dans un champ témoin et deux dans les champs traités à la clothianidine en 2014) ont été exclues de l’analyse, car l’essaimage a un effet important sur le développement des colonies. Est également exclue la colonie unique qui a perdu sa reine pendant le transport avant le placement au champ en 2013 (champ traité). L’exclusion des colonies qui ont essaimé de l’analyse a altéré qualitativement certains résultats (voir le tableau supplémentaire 13). Les changements de niveau de signification peuvent être dus à une puissance statistique réduite, à un hasard aléatoire ou à des effets biologiques.

Des modèles linéaires à effets mixtes (LMM) ont été utilisés pour tester l’effet du traitement à la clothianidine sur le développement des colonies mesuré en nombre de cellules couvées (quantité de couvées) et en nombre d’abeilles adultes. Le traitement des semences (clothianidine ou témoin), la floraison (avant ou après la floraison du colza), l’année (2013 ou 2014) et leurs interactions ont été des facteurs fixes. L’identité du couple de ferme, l’identité de la ferme et l’identité de la colonie ont été incluses comme facteurs aléatoires. La production de miel a été comparée entre les traitements en utilisant une LMM avec l’identité de la paire de fermes et l’identité de la ferme comme facteurs aléatoires. Des modèles mixtes linéaires généralisés (GMGL) ont été utilisés pour tester l’influence du traitement à la clothianidine sur le ré-étouffement et la mortalité des colonies avec l’identité de la ferme comme facteur aléatoire.

L’influence du traitement à la clothianidine sur le développement des colonies printanières, mesurée en nombre d’abeilles adultes et en quantité de couvain, a été testée à l’aide d’un LMM et d’un GLMM, respectivement, avec le traitement des semences comme facteur fixe et l’identité du couple de ferme et l’identité de la ferme comme facteurs aléatoires. Pour le nombre de cellules couvées plafonnées, nous avons utilisé une distribution d’erreur binomiale négative et une fonction de lien logarithmique.

Les données sur le microbiome et les acariens Varroa ont été analysées à la fois sur leur caractère binomial (présence / absence) et quantitatif (abondance), en utilisant respectivement des GLMM (avec des distributions d’erreurs binomiales et une fonction de lien logit) et des LMMM (avec des distributions d’erreurs normales), avec le traitement des semences, la floraison, l’année et leurs interactions comme facteurs fixes. Les MGGL sur la prévalence des microorganismes ou des varroas ne comprenaient que l’identité de la colonie comme facteur aléatoire, car la taille effective de l’échantillon (c.-à-d. le résultat moins fréquent des données sur la présence/l’absence) ne permettait pas d’inclure davantage de facteurs aléatoires. Seuls les organismes et les années ayant une taille d’échantillon (effective) > 10 ont été analysés pour les données de prévalence et d’abondance. De plus, les colonies qui n’ont pas été au moins une fois testées positives pour un microorganisme particulier ont été exclues de l’analyse de l’abondance. L’abondance des pathogènes et des bactéries des abeilles a été transformée logarithmiquement (log10), car elles sont généralement distribuées de manière exponentielle. Les LMMS sur l’abondance de l’organisme cible contenaient l’identité du couple de ferme, l’identité de la ferme et l’identité de la colonie comme facteurs aléatoires. Le nombre d’acariens Varroa pour 100 abeilles et le poids de la colonie ont été transformés en racines carrées pour éviter les résidus non normalement distribués. Les intervalles de confiance ont été calculés en fonction de la probabilité du profil. Pour les données transformées à la racine carrée, les estimations ont été rétrocédées à l’échelle d’origine pour les illustrations graphiques.

Les transcrits des gènes immunitaires n’étaient disponibles que pour 2013 et au niveau du rucher, mais suivaient également le plan BACI. Les LMMS sur l’expression des gènes contenaient le traitement des semences et la floraison en tant que facteurs fixes et l’identité de la ferme en tant que facteurs aléatoires.

Des analyses de données statistiques ont été effectuées à l’aide de R, à l’exception des analyses portant sur la vérification de l’exposition à la clothianidine et de l’utilisation des sols, pour lesquelles SAS 9.4 pour Windows (SAS Institute Inc.) a été utilisé. Les LMM ont été ajustées à l’aide de la fonction lmer du package lme4 et les GLMM ont été ajustées à l’aide de la fonction glmmTMB du package glmmTMB dans R. Les valeurs de P des GLMM ont été calculées par des tests de rapport de vraisemblance. Les valeurs de P des LMMs ont été calculées à l’aide de la fonction Anova de l’ensemble car, les tests F de type III ont été utilisés pour les modèles contenant des interactions et les tests F de type II pour les modèles sans interactions (c.-à-d. évaluation du printemps et production de miel). Les effets des facteurs fixes ont été estimés à l’aide de contrastes somme à zéro dans tous les modèles, à l’exception de ceux sur les résidus de néonicotinoïdes. Les contrastes somme à zéro permettent de déterminer les principaux effets /interactions (c’est-à-dire l’estimation indépendamment d’autres variables indépendantes) et montrent les effets des facteurs comme des écarts par rapport à la grande moyenne (interception). Pour les facteurs à deux niveaux, l’amplitude de l’écart de chaque niveau par rapport à la moyenne générale est la même, mais la direction diffère. Nous représentons les effets des facteurs (traitement des semences, floraison, année), comme la déviance du deuxième niveau (clothianidine, après, 2014) de la grande moyenne. C’était également le cas pour les interactions, de sorte que, par exemple, l’interaction traitement des semences × floraison indique dans quelle mesure les colonies exposées à la clothianidine différaient du changement moyen des deux traitements par rapport à la floraison du colza oléagineux.

Analyse de puissance

Nous avons effectué des analyses de puissance pour le nombre d’abeilles adultes et le nombre de cellules couvées et la production de miel afin d’étudier la taille de l’effet que nous pourrions potentiellement détecter compte tenu de notre choix de conception, de réplication et de modèle. La puissance a été déterminée pour une gamme de tailles d’effets à un niveau de confiance nominal de α = 0,05 par 1000 simulations de Monte Carlo par taille d’effet en utilisant la fonction powerSim du package simr. La puissance a été calculée pour une gamme de tailles d’effet, exprimée par la variation du nombre d’abeilles adultes, du nombre de cellules couvées ou de la production de miel. En divisant la taille de l’effet avec le nombre moyen d’abeilles, le nombre moyen de cellules de couvain ou la production de miel de toutes les colonies témoins, nous avons obtenu la taille de l’effet exprimée en pourcentage de variation de ces matrices (fig. 3). Cette analyse de puissance a permis de comparer notre taille d’effet avec la taille d’effet présentée par Rundlöf et al.34. En utilisant le modèle complet, nous avons pu détecter une taille d’effet pour le nombre d’abeilles adultes inférieure à 5% avec une puissance de 80% par rapport à la taille d’effet inférieure à 20% présentée par Rundlöf et al.34. C’est encore plus bas que les exigences d’une taille d’effet < 7 % fixées par la norme EFSA32. En raison d’une interaction significative entre le traitement des semences, la floraison et l’année, l’ensemble de données sur le nombre de cellules de couvain plafonnées a été analysé séparément pour chaque année. Par conséquent, nous présentons ici l’analyse de puissance pour chaque année. La taille de l’effet à laquelle 80 % a été atteint est passée de moins de 10 % en 2013 à légèrement inférieure à 11 % en 2014 (Fig. 3), probablement en raison de la réplication réduite en 2014. Nous avons également effectué une analyse de puissance de la production de miel (quantité de miel par colonie en kg) à l’aide de l’ensemble de données des deux années, montrant qu’une taille d’effet inférieure à 20% pouvait être détectée avec une puissance de 80% (fig. 3).

Résumé des rapports

De plus amples informations sur la conception expérimentale sont disponibles dans le Résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.