Les matrices de collagène recombinant humain injectables limitent le remodelage indésirable et améliorent la fonction cardiaque après un infarctus du myocarde

Conception de l’étude

Ici, nous avons mené une étude pour (i) concevoir des hydrogels de collagène cliniquement pertinents en utilisant des collagènes humains recombinants de type I et de type III; (ii) caractériser et comparer les propriétés physiques des matériaux rHCI et rHCIII; (iii) évaluer le potentiel thérapeutique des matériaux pour traiter l’IM chez la souris; et (iv) identifier les mécanismes sous-jacents aux effets thérapeutiques observés du traitement par rHC. Pour des expériences in vivo, la ligature de l’artère LAD chez la souris a été choisie comme modèle animal cliniquement pertinent et bien établi de l’IM. Pour les évaluations fonctionnelles, histologiques et moléculaires, le nombre d’animaux par groupe a été réduit à trois à quinze souris, comme spécifié dans les légendes de la figure. Des souris ont été assignées au hasard à des groupes de traitement et toutes les analyses ont été effectuées en aveugle.

Préparation et caractérisation des matrices rHC

Une solution de collagène à 1% a été préparée en dissolvant 0,1 g de collagène lyophilisé (rHCI et rHCIII, à partir de Fibrogène) dans 10 ml de sulfate de chondroïtine ddH2O ultra-pur (CS; Wako), de N-éthyl-N-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC) et de N-hydroxysuccinimide (NHS) ont été ajoutés pour produire un mélange final avec un rapport massique de 1: 4: 0,5: 0,3 pour le collagène: CS: NHS: EDC. Les matériaux ont été préparés sur glace à l’aide d’un système fermé qui permet un mélange homogène sans ajout de bulles. Après un mélange complet, le pH a été ajusté à 7.4 par NaOH (1,0 N). Des matrices sans CS ont été préparées de la même manière mais avec du PBS ajouté pour compenser le volume de CS. Des matrices marquées avec Alexa-Fluor®594-NHS ont été préparées en ajoutant 20 µL de la solution mère de colorant (1 mg/mL dans le DMSO) aux gels avant d’ajouter le NaOH (25 nmol de colorant par hydrogel), suivi de 20 étapes de mélange.

Viscosité du matériau

Des mesures de viscosité ont été effectuées à l’aide d’un rhéomètre Brookfield R/ S plus (Brookfield) à 37 ° C. Une broche conique C25–2/30 a été utilisée pour comprimer le matériau (déplacement de 50 µm) sur un socle à température contrôlée. La viscosité a été mesurée avec un bloc de rotation de rampe à une vitesse de 1 / min unités préréglées à une vitesse de cisaillement de cinq unités sur un temps de 30 min.

Degré de réticulation

Des expériences de calorimétrie différentielle à balayage (DSC) ont été effectuées pour évaluer le degré de réticulation. En bref, des mesures ont été effectuées dans un calorimètre à balayage différentiel Q2000 (instruments TA) dans la plage de 8 à 80 ° C en utilisant une vitesse de balayage de 5 ° C min−1. Les matrices de collagène (5-20 mg) ont été séchées en surface avec du papier filtre et scellées hermétiquement avec un couvercle en aluminium (Tzero; TA Instruments) dans un bac à échantillons en aluminium (Tzero; TA Instruments). La température de dénaturation (Td) a été mesurée au début du pic endothermique.

Teneur en eau

La teneur en eau des matériaux a été mesurée en pesant le poids humide (W0) de l’échantillon, équilibré en PBS pendant 96 h à 4 °C. Le matériau a ensuite été séché sous vide à température ambiante pendant 96 h pour obtenir la masse sèche (W). La teneur totale en eau des hydrogels (poids) a ensuite été calculée selon l’équation:

Dégradation

La dégradation enzymatique a été mesurée à l’aide de 50-100 mg d’hydrogel placé dans 5 ml de collagénase de type I (10 U / ml dans le PBS) à 37 ° C. La masse solide restante a été mesurée sur une période allant jusqu’à 24 h. Le taux de dégradation est calculé à partir de la pente initiale des tracés de masse restante par rapport au temps et rapporté en mg / min.

Porosité du matériau

Des mesures en microscopie électronique à balayage à basse température (Cryo-SEM) ont été effectuées à -50 °C à l’aide d’un Tescan (Modèle: Vega II-XMU) équipé d’un porte–échantillon à étage froid, d’un détecteur d’électrons à rétrodiffusion (ESB) et d’un détecteur d’électrons secondaires (SE). La taille des pores a été mesurée sur au moins 250 individus de 4 à 6 zones aléatoires de l’échantillon à l’aide du logiciel ImageJ®. Le diamètre des pores a été quantifié à l’aide de l’axe longitudinal du pore à l’aide de l’outil en ligne droite. La surface de l’image a été ajustée par rapport à la barre d’échelle de taille obtenue à partir du système Tescan Vega II 65.

Expériences sur des animaux

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de soins aux animaux de l’Université d’Ottawa et effectuées conformément au Guide de Soins et d’utilisation des animaux de laboratoire de l’Institut national de la Santé.Le modèle

MI

MI a été induit chez des souris femelles C57BL/6 de 9 semaines (Charles River; le nombre de souris/groupe est indiqué dans les légendes de la figure) et l’administration du traitement a été effectuée en utilisant un protocole établi26,27. Des souris ont été anesthésiées (isoflurane à 2%), intubées et le cœur a été exposé via une quatrième thoracotomie intercostale. L’artère coronaire descendante antérieure gauche (DAL) a ensuite été ligaturée juste en dessous de son émergence de l’oreillette gauche. Cette procédure entraîne un IM important impliquant les parties antérolatérale, postérieure et apicale du cœur, ce qui a été confirmé au moment de la chirurgie par un blanchiment myocardique dans la région fournie par l’artère. La buprénorphine à courte durée d’action a été administrée au moins une heure avant la chirurgie, et la buprénorphine à longue durée d’action a été administrée par voie sous-cutanée immédiatement avant la chirurgie pour une analgésie périopératoire. À 1 semaine après l’IM (ligne de base), des souris ont été assignées au hasard pour recevoir un traitement de matrices PBS (contrôle), rHCI ou rHCIII, administrées en cinq injections intramyocardiaques équivolumétriques (10 µl par site, 50 µl au total) à l’aide d’une aiguille de 27 G en utilisant une procédure thoracique fermée guidée par ultrasons. La seringue est fixée dans un micromanipulateur (VisualSonics) et, avant la procédure d’injection, l’aiguille et la sonde RMV scanhead sont alignées le long de l’axe cardiaque. Par l’intermédiaire du champ de vision ultrasonore, le micromanipulateur est utilisé pour positionner la pointe de l’aiguille à l’endroit souhaité dans le myocarde pour l’administration des injections (voir fig. 1 et Vidéo supplémentaire 1). Des souris ont été tuées par anesthésie terminale 2 jours ou 4 semaines après le traitement et des cœurs ont été collectés pour une histologie et / ou des mesures des propriétés mécaniques.

Échocardiographie

L’échocardiographie transthoracique a été réalisée sur des vues grand axe à l’aide d’un système Vevo770 en mode B avec une sonde à tête de balayage à microvisualisation en temps réel de la série 707B (VisualSonics). L’imagerie a été réalisée au début du traitement avant l’injection (7 jours après l’IM) et 28 jours après l’injection pour déterminer la fraction d’éjection ventriculaire gauche (FEVG), le changement de zone fractionnaire (FAC), le volume systolique final (VSE), le volume diastolique final (VDE), le volume de l’AVC et le débit cardiaque. Notez que la FEVG, le VSE et le VDE sont utilisés comme prédicteurs cliniques de la FH et de la survie après le MI44.

Imagerie ex vivo de la matrice marquée Alexa-Fluor®594

Les matrices rHC marquées chimiquement (25 nmol de colorant par hydrogel) ont été injectées dans le cœur de souris infarctus, comme décrit ci-dessus. Les animaux ont été tués 2 h, 2 jours et 7 jours après le traitement, et les cœurs ont été récoltés et imagés ex vivo par IVIS® Spectrum (PerkinElmer) pour visualiser la distribution de rHCI et de rHCIII dans les cœurs (λexcitation: 570 nm; λémission: 640 nm). Pour l’histologie, des coupes de tissus ont été préparées dans de l’acétone puis colorées avec du DAPI suivi d’une imagerie à l’aide d’un scanner à diapositives Leica Aperio Versa avec un grossissement final de ×20 et une pile Z avec huit étapes à 1,5 µm.

Analyse de déformation

L’échocardiographie transthoracique a été réalisée sur des vues grand axe à l’aide d’un système Vevo3100 en mode B avec une sonde à tête de balayage à microvisualisation en temps réel de la série MX400 (VisualSonics). L’imagerie a été réalisée au début du traitement avant l’injection (7 jours après l’IM) et 2 jours après l’injection afin de déterminer la tension endocardique longitudinale au moment de la fermeture de la valve aortique (représentant la systole terminale). La souche du segment 5 (segment médian antérieur), correspondant à la zone frontalière ciblée pour l’injection de traitement, a été analysée à l’aide de l’application Vevostrain du logiciel Vevo LAB 3.1.1 (VisualSonics) 41. Des exemples représentatifs des mesures effectuées sont repris dans la Fig. 10 pour tous les groupes expérimentaux plus un animal sain (non infarcté).

Électrocardiographie

Des électrocardiogrammes ont été obtenus simultanément à l’échocardiographie en utilisant un système Vevo3100 (VisualSonics) au début du traitement avant l’injection (7 jours après l’IM) et 2 jours après l’injection. Des électrocardiogrammes ont été exportés de Vevo LAB 3.1.1. logiciel (VisualSonics). La longueur des intervalles PR, QT et QRS a été déterminée à l’aide du logiciel ImageJ (Tableau supplémentaire 1).

Propriétés mécaniques du myocarde

Les souris ont été euthanasiées par anesthésie terminale 2 ou 28 jours après le traitement et les cœurs ont été récoltés. Des morceaux rectangulaires (2,5 × 5 mm) du ventricule gauche comprenant la cicatrice et la zone frontalière ont été excisés. Pour déterminer l’élasticité en traction du tissu (module de Young), les échantillons ont été soumis à des tests mécaniques dans un testeur universel mécanique Instron (Modèle 3342, Instron) équipé d’un logiciel Série IX / S, en utilisant une vitesse de traverse de 10 mm min−1.

Histologie/immunohistochimie

Des lames de coupes de tissu myocardique ont été préparées à partir d’un sous-ensemble de coeurs qui n’ont pas été utilisés pour les mesures de propriétés mécaniques. 28 jours après l’injection, les cœurs ont été récoltés, perfusés avec du PBS, incorporés dans de l’OCT et congelés dans de l’azote liquide. Des sections de 10 µm ont été découpées à l’aide d’un cryostat. Pour évaluer la taille de la cicatrice, des coupes de tissu ont été fixées dans 4% de PFA pendant 1 h et colorées avec la procédure trichrome de Masson (Sigma). Des images prises avec un microscope Olympus BX50 utilisant un objectif de 2 × et huit sections par souris ont été utilisées pour mesurer l’épaisseur de la paroi distante et pour déterminer la taille de la cicatrice à l’aide de la méthode de l’arc de ligne médiane à l’aide du logiciel miquant66. Pour l’immunohistochimie, des coupes de tissus ont été fixées dans de l’acétone pendant 20 min, perméabilisées avec du triton à 0,1% pendant 10 min puis bloquées dans du sérum à 10% pendant 1 h à température ambiante. Les anticorps primaires ont été appliqués pendant une nuit à 4 °C dans du sérum à 10%, puis les lames ont été rincées et traitées avec des anticorps secondaires pendant 1 h à température ambiante, avant d’être montées avec du milieu de montage fluorescent (Dako). Pour la détection des vaisseaux sanguins et des myofibroblastes, PECAM-1 (également connu sous le nom de CD31; Santa Cruz 101454, 1:50) et α-SMA (Abcam 5694,1:200) des anticorps ont été utilisés et détectés avec AF594 anti-rat (Life Technologies A11008, 1:500) et AF488 anti-lapin (Life Technologies A11007, 1:500), respectivement. Des macrophages M2 ont été détectés par l’anticorps anti-CD206 conjugué AF488 (Biolegend 141710, 1:50). Pour la coloration cardiaque à la troponine I, des coupes ont été incubées avec de l’agglutinine de germe de blé marquée AF488 (ThermoFisher, W11261) pendant 1 h à 37 °C suivi d’une incubation avec un anticorps primaire à la troponine I cardiaque de chèvre (Abcam ab56357, 1:200) et détectées par un anticorps secondaire AF594 anti-chèvre d’âne (Life Technologies A-11058, 1:500). Enfin, pour la coloration de connexin 43, des coupes ont été incubées avec des anticorps primaires connexin 43/GJA1 (Abcam ab11370, 1:400) et de la troponine cardiaque I (Abcam ab188877, 1:200) suivis d’une détection avec des anticorps secondaires AF488 anti-lapin (Life Technologies A11007, 1:500) et anti-chèvre AF594 d’âne (Life Technologies A-11058, 1:500), respectivement. Des images fluorescentes ont été obtenues à l’aide d’un microscope observateur Zeiss Axio avec un objectif ×20 et pour les sections colorées connexin 43, un scanner de diapositives Leica Aperio Versa avec un objectif 20 × a été utilisé. Pour toutes les taches IHC, quatre sections par souris ont été analysées et pour chaque section 2 à 4 images dans la zone frontalière, l’infarctus et les régions éloignées ont été utilisées pour l’analyse. Pour la coloration H & E, des coupes de tissus ont été fixées dans du formol à 10%. Des coupes ont ensuite été colorées d’abord dans la solution No 2 d’hématoxyline gill pendant 7 min, suivie d’une différenciation acide-alcool, puis d’éosine à 0,5% pendant 7 min, suivie d’une déshydratation (toutes les solutions de Sigma). Les images ont été prises avec un microscope Olympus BX50. La zone frontalière a été désignée comme le champ de vision directement adjacent de chaque côté de la région de l’infarctus qui commence lorsque 50% du VG est constitué de tissu cicatriciel fibrotique (voir Fig. 11 pour une représentation schématique).

Expériences sur des souris Cx3cr1-EGFP

Pour évaluer le recrutement de cellules mononucléées circulantes dans le myocarde après un traitement rHC, des souris B6.129P-Cx3cr1 tm1Litt/J (Cx3cr1-EGFP) ont été achetées au laboratoire Jackson. Ces souris expriment une protéine fluorescente verte améliorée dans les monocytes, les cellules dendritiques, les cellules NK et la microglie cérébrale, et constituent un modèle rapporté pour l’étude du recrutement de cellules mononucléées au cœur 67. À 1 semaine après l’IM, les souris ont reçu un traitement de 50 µl de PBS, rHCI ou rHCIII, comme décrit ci-dessus. Les animaux ont été tués 2 jours après le traitement et le sang a été collecté dans des tubes d’EDTA. En outre, les cœurs ont été perfusés avec du PBS et le ventricule droit et la région apicale du ventricule gauche ont été collectés. Les tissus ont été rincés à l’HBSS et digérés en 2.4U/ml de dispase I (Roche) et 1 mg/ml de Collagénase B (Roche) pendant 40 min à 37 °C. Les échantillons ont été lavés trois fois avec du PBS, centrifugés pendant 5 min à 400 g, et les cellules isolées ont été préparées pour la cytométrie en flux (FACS Aria III; Becton Dickinson). Les cellules ont été marquées avec APC anti-souris/CD11B humain (Biolegend 101211), PE anti-souris Ly-6G/ 6C (Biolegend 108407), PE/Cy5 anti-souris F4/80 (Biolegend 123111), PE/Cy7 anti-souris CD38 (Biolegend 102717) et Alexa Fluor® 700 anti-souris CD206 (Biolegend 141733 ), suivant les dilutions recommandées par le fabricant (0.25 µg/L pour 1 × 106 cellules pour CD11b, Ly-6G/6C, CD38 et CD206, et 1 µg/L pour 1 × 106 cellules pour F4/80). Voir la Fig. 12 pour la stratégie de tri / gating.

Isolement cellulaire et cytométrie en flux pour les sous-ensembles de monocytes

Deux jours après l’injection, des souris ont été tuées par inhalation de CO2 suivie d’une luxation cervicale. Le sang a été prélevé sur des souris par ponction cardiaque dans une solution d’EDTA de 50 mM, et les globules rouges ont été lysés avec un tampon de lyse des globules rouges (RBC) selon le protocole du fabricant (Biolegend 420301). Des cellules ont été isolées à partir de cœurs de souris récoltés à l’aide d’un tampon de digestion contenant: DNase I (50 U/µL; Sigma D5025), collagénase de type II (400 U/mL; ThermoFisher 17101015), collagénase D (0,15 U/mL; Sigma 11088866001) et hyaluronidase (10 U/mL; Sigma H3506). Après une heure de digestion à 37 °C, des cellules cardiaques isolées ont été passées à travers un filtre de 70 µm. Enfin, les moucherons de souris récoltés ont été écrasés et triturés à travers un filtre de 70 µm suivi d’une incubation avec un tampon de lyse des globules rouges (RBC). Les pastilles cellulaires ont été collectées par centrifugation à ×400g pendant 5 min à 4 °C. Des cellules isolées de tous les tissus ont été incubées avec le colorant de viabilité Zombie Aqua fixable (1:500, Biolegend 423101) pendant 20 min à température ambiante. Ensuite, les récepteurs Fc ont été bloqués avec le réactif TruStain X (1:100, Biolegend 103319) pendant 10 min à température ambiante. Les cellules ont ensuite été incubées avec un cocktail d’anticorps pendant 45 min à température ambiante contenant CD45-APC/Fire 750 (1:160, Biolegend 30-F11), CD11b-PE/Cy7 (1:80, Biolegend M1/70), Ly6G-PerCP/Cy5.5 (1:160, Biolegend 1A8), CD3-PE (1:160, Biolegend 17A2), B220 – AF488 (1:50, Biolegend RA3-6B2), F480-AF647 (1:100, Biolegend BM8) et Ly6C-BV421 (1:80, BD Biosciences AL-21). La cytométrie en flux a été réalisée à l’aide d’un BD FACS Aria III, et les données ont été analysées avec le logiciel FlowJo V10.5.2 (voir Fig. 12 pour la stratégie de tri / gating). Le nombre total de cellules viables pour chaque post-isolement tissulaire a été déterminé par exclusion du bleu de trypan à l’aide d’un hémocytomètre. Le nombre total de cellules au sein de chaque population de leucocytes a été déterminé en utilisant le pourcentage de cellules vivantes pour une population de cellules donnée et le nombre total de cellules vivantes comptabilisées après l’isolement, qui a ensuite été normalisé en mg de tissu ou en mL de sang prélevés. Stratégie de blocage: Les cellules individuelles ont été bloquées sur la base de FSC-A et FSC-H. Les cellules individuelles vivantes ont été bloquées sur une faible coloration pour le colorant Zombie Aqua live / dead. De cette population de cellules uniques vivantes, les leucocytes étaient CD45 +. Les sous-ensembles leucocytaires ont été caractérisés comme suit: neutrophiles CD45 + CD11b + Ly6G+, monocytes bas Ly6C CD45 + CD11b + Ly6G−F480−Ly6C−, monocytes hauts Ly6C CD45 + CD11b + Ly6G−F480−Ly6C+, macrophages CD45 + CD11b + Ly6G−F480+, lymphocytes T CD45 + CD11b−Ly6G−CD3 + B220 − et lymphocytes B CD45 + CD11b−Ly6G−CD3−B220 +. Remarque pour le sang, l’expression de F480 n’a pas été utilisée dans la stratégie de déclenchement. Les portes ont été définies par rapport aux contrôles d’isotype.

Études de cardiomyocytes néonataux

Les myocytes ventriculaires de rat néonatal (NRVMs) ont été fraîchement isolés à l’aide d’un protocole établi68. Les ventricules gauches prélevés sur des rats Sprague-Dawley âgés de 2 jours (Harlan) ont été digérés par la trypsine (Amersham Biosciences) et la collagénase de type II (Worthington Biochemical). Des cellules isolées ont été remises en suspension dans le milieu M-199 (Life Technologies) additionné de FBS à 10%, de glucose à 19,4 mM, de l-glutamine à 2 mM, de pénicilline à 2 U / mL, de vitamine B12 à 0,8 µg / mL, d’HEPES à 10 mM et d’acides aminés non essentiels à 1 × MEM (Sigma-Aldrich). Deux tours de pré-plaquage de 60 min ont été effectués, au cours desquels des fibroblastes cardiaques se fixent au fond de la cuvette, enrichissant ainsi la population non adhérente pour les NRVMs. Les cellules non adhérentes (NRVMS) ont ensuite été ensemencées sur les différentes matrices de collagène dans des plaques à 24 puits (40 000 cellules/cm2). Pour le test de survie, des NRVM en culture de 3 jours ont été soumis à des milieux M-199 contenant du peroxyde d’hydrogène de 50 µM pendant 3 h, après quoi un test de marquage terminal de la désoxynucléotidyl transférase dUTP Nick-End (TUNEL) a été effectué et les cellules mortes ont été comptées dans trois champs de vision aléatoires.

Cultures cellulaires

À l’aide d’un protocole établi, des macrophages dérivés de la moelle osseuse ont été isolés à partir de micro C57BL/6J âgé de 8 à 12 semaines 69. Des souris ont été euthanasiées par inhalation de CO2 et luxation cervicale, et les os du tibia ont été prélevés et rincés avec du milieu pour isoler la moelle osseuse. L’isolat de moelle osseuse a été pipeté à plusieurs reprises pour obtenir une suspension unicellulaire, qui a ensuite été passée à travers une passoire cellulaire. Des cellules fraîchement isolées ont été cultivées pendant 1 semaine dans du DMEM additionné de 10% de FBS, de milieux conditionnés à 20% de L929 et de pénicilline-streptomycine, puis plaquées sur les hydrogels rHC pendant 3 jours. Des cellules ont été prélevées dans les hydrogels rHC à l’aide d’une solution saline tampon CaCl2 de 3 mM contenant 250 unités de collagénase I (Gibco). La polarisation des macrophages a été évaluée par cytométrie en flux (FACS Aria III; Becton Dickinson) en utilisant CD86 et CD206 (Biolegend) pour identifier les macrophages M1 et M2, respectivement. Pour l’isolement des cellules mononucléées, la moelle osseuse des os du tibia a été prélevée comme décrit ci-dessus. Les cellules mononucléées ont été purifiées par centrifugation par gradient de densité à l’aide d’Histopaque® (Sigma) selon les instructions du fabricant. Les cellules ont été marquées par 0.5 µg/ml de DAPI (Sigma) pendant 30 min à 37 °C.

Test d’adhésion des macrophages

Des cellules mononucléées ont été isolées par rinçage des tibias et des fémurs de souris âgées de 6 à 12 semaines. Les cellules ont été purifiées par centrifugation par gradient de densité à l’aide d’Histopaque® (Sigma) selon les instructions du fabricant. Les cellules mononucléées ont été comptées et marquées avec du DAPI. Les cellules ont été plaquées sur les différents biomatériaux à une concentration de 50 000 cellules/ cm2 pendant 24 h. Les cellules ont été fixées avec 4% de PFA pendant 5 min, et les cellules ont été comptées. Les données ont été exprimées par rapport au témoin (puits non revêtus, i.e., EPTC) pour minimiser l’effet de la variabilité des cellules entre donneurs.

Essai de migration des macrophages

Des cellules mononucléées de moelle osseuse ont été cultivées dans du DMEM additionné de 10% de FBS, de 20% de milieu conditionné par L929 et de Stylo/Strep pendant 7 jours pour générer des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM) et marquées avec du DAPI, comme décrit ci-dessus. Les BMDM (2 × 105) ont ensuite été remis en suspension dans de l’EBM dépourvu de facteurs de croissance et de sérum, et chargés dans la chambre supérieure d’une plaque Transwell (Life Technologies) recouverte de 100 µL de rHCI ou de rHCIII. La chambre inférieure contenait des milieux à macrophages complets tels que décrits ci-dessus. Après 24 h, les inserts ont été retirés et le nombre de BMDM qui ont migré à travers le biomatériau a été quantifié en aveugle à l’aide d’un microscope à fluorescence Zeiss Z1. Les données ont été exprimées par rapport au témoin (puits non revêtus, c.-à-d. EPTC) afin de minimiser l’effet de la variabilité des cellules entre donneurs.

Dosage de polarisation des macrophages

Des BMDM ont été générées dans du DMEM additionné de 10% de FBS, de milieu conditionné à 20% de L929 et de Stylo/Strep pendant 7 jours, comme décrit ci-dessus. Pour les expériences d’activation des macrophages, les cellules ont été stimulées pendant 3 jours avec du lipopolysaccharide (1 µg / ml; Sigma) plus IFN-γ (50 ng / ml; Sigma) pour l’activation de M1, ou avec de l’IL-4 (20 ng / ml; Systèmes R & D) pour l’activation de M2. L’ARN total a été extrait à l’aide du réactif Tri (Recherche Zymo), selon le protocole du fabricant. L’ADNc du premier brin a été synthétisé avec la Transcriptase inverse Smartscribe (Takara Bio USA) et des amorces hexamères aléatoires (Fisher Scientific). Les taux d’ARNm des gènes cibles ont été évalués par RT-PCR quantitative avec LightCycler 480 SYBR Green I Mastermix (Roche) et un système de PCR en Temps réel LightCycler 480 (Roche). Les séquences des paires d’amorces sont énumérées dans le tableau supplémentaire 2. Les changements relatifs dans l’expression de l’ARNm ont été déterminés par la méthode ∆∆Ct, exprimés en niveaux par rapport à 18S. Les données ont été exprimées par rapport au témoin (puits non revêtus, c.-à-d. EPTC) afin de minimiser l’effet de la variabilité des cellules entre donneurs.

Survie après exposition au H2O2

Les cellules ont été cultivées pendant 7 jours dans du DMEM additionné de 10% de FBS, de milieu conditionné à 20% de L929 et de Stylo/streptocoque. Le jour 7, le milieu a été changé en DMEM contenant 0,5 mM de peroxyde d’hydrogène, et les cellules ont été cultivées pendant 3 h avant d’être colorées au 7-AAD pour analyse par cytométrie en flux. Les données ont été exprimées par rapport au témoin (puits non revêtus, c.-à-d. EPTC) afin de minimiser l’effet de la variabilité des cellules entre donneurs.

Analyse statistique

L’analyse statistique a été réalisée à l’aide de Kaleida Graph 4.5®. Toutes les données sont présentées comme la moyenne ± SEM. Pour la comparaison des données in vivo entre les traitements, une ANOVA a été utilisée suivie de la correction de Holm pour les comparaisons multiples. La taille de la cicatrice a été analysée à l’aide d’une régression multiple, y compris le groupe de traitement (rHCI, rHCIII et PBS) et la FEVG de base. rHCI et rHCIII par rapport au PBS étaient des prédicteurs significatifs de la taille de l’infarctus, en plus de la FEVG de base. Le coefficient de corrélation pour le modèle est de 0,6 en utilisant la régression linéaire multiple de STATA. Les données NRVM in vitro, macrophages et fibroblastes cardiaques ont été analysées soit par un test t de Student, soit par une ANOVA unidirectionnelle avec une correction de Holm pour des comparaisons multiples, comme spécifié dans les légendes de la figure.

Résumé des rapports

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le Résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.