L’expression constitutive de gènes sélectionnés à partir des voies pentose phosphate et aromatique augmente le rendement en acide shikimique dans des cultures en lots à haute teneur en glucose d’une souche d’Escherichia coli dépourvue de PTS et de pykF

Construction de souches dérivées de PB12 aroK-aroL contenant un plasmide conçu pour pour l’expression constitutive d’un opéron synthétique utilisé dans la production d’acide shikimique

Des preuves non publiées de notre laboratoire indiquent que la production de composés aromatiques dans la souche PB12 évoluée en laboratoire peut atteindre des niveaux plus élevés lorsque l’induction transcriptionnelle des gènes impliqués dans la canalisation du flux de carbone dans la voie AAA se produit au début des fermentations. Compte tenu de cette observation, une nouvelle stratégie a été développée pour optimiser la production de SA dans PB12 portant des gènes aroK et aroL inactifs (Figure 1). Cette stratégie comprenait la conception et la construction d’un plasmide pour l’expression forte et stable de six gènes clés disposés sous la forme d’un opéron synthétique, contrôlé exclusivement par un seul promoteur Trc. Afin de réduire la charge métabolique, un seul plasmide dérivé de pBR327 portant le locus par pour une stabilité plasmidique accrue a été utilisé comme vecteur, après incorporation d’un fragment contenant le promoteur, le polylinker et les terminateurs transcriptionnels de pTrc99A (Figure 2).

La partie initiale de l’opéron a été construite par amplification séquentielle et ligature des 4 premières séquences codantes (aroB, tktA, aroGfbr et aroE) dans le polylinker du plasmide pBRINT-Ts Cm, utilisé comme échafaudage de clonage (voir Méthodes). Plus tard, la construction de 4 gènes a été transférée au plasmide hybride pTrc327par en conjonction avec 2 autres gènes (aroD et zwf), conduisant à un opéron de 8 Ko contenu dans un plasmide de 12 Ko (Figure 2). Le plasmide résultant, appelé pTrcAro6, a été transformé en la souche PB12 aroK-aroL- dépourvue du gène lacIq, permettant l’expression constitutive des gènes d’intérêt (Tableau 1). Pour simplifier, la souche aroK-aroL-lacI- PB12 générée a été appelée AR2. Après l’inactivation du gène pykF dans AR2, la souche résultante a été nommée AR3. Les souches dérivées de AR2 et AR3 portant le plasmide pTrcAro6 ont été nommées respectivement AR26 et AR36 (Tableau 1).

La disposition spatiale des séquences codantes qui constituent l’opéron synthétique dans pTrcAro6, flanquées du promoteur Trc et des terminateurs transcriptionnels, est illustrée à la figure 2. aroB est le premier gène de l’opéron car plusieurs preuves indiquent que sa faible expression est l’une des étapes limitantes de la production de composés aromatiques. Le plasmide pTrcAro6 porte également les gènes tktA et aroGfbr, dont les produits sont impliqués dans la synthèse de l’E4P et sa condensation avec le PEP pour former le DAHP, le premier composé aromatique (Figure 1). Les gènes aroD et aroE ont également été inclus pour favoriser une conversion efficace de DHQ en SA. De plus, ce plasmide porte le gène zwf, codant pour la première enzyme du PPP (Figure 1). La décision d’inclure ce gène était basée sur les observations suivantes: 1) la surexpression de zwf a sensiblement récupéré la perte de vitesse de croissance due à la charge métabolique plasmidique dans la souche JM101 se développant sur le glucose comme seule source de carbone; 2) il a été rapporté que la souche PB12 présente une partition de flux de carbone particulièrement faible au nœud glucose 6-phosphate (G6P) vers le PPP (5% du G6P consommé contre 22% dans la souche parentale JM101). Par conséquent, une surexpression de ce gène devrait augmenter la disponibilité du NADPH, nécessaire en quantités catalytiques par l’enzyme shikimate déshydrogénase (AroE), et peut atténuer les affectations potentielles de croissance en redirigeant plus de G6P vers la biosynthèse des nucléotides et des acides aminés dans les souches dérivées de PB12. Cependant, les expériences présentées dans ce rapport ne visaient pas à disséquer l’effet spécifique d’un gène utilisé, mais cherchaient plutôt à caractériser les conséquences de l’expression de tous comme un opéron.

Afin de favoriser une traduction efficace de chaque gène, chaque séquence codante a été amplifiée à l’aide d’amorces désignées qui ont introduit une séquence consensus Shine-Dalgarno située à 8 pb en amont du site de départ de la traduction. La séquence nucléotidique de l’opéron construit est présentée dans le fichier supplémentaire 1.

Évaluation des effets de l’inactivation de pykF chez des souches exprimant l’opéron Aro6

Pour évaluer les effets de l’inactivation de pykF sur la production de SA, les performances des souches de production AR26 (pykF+) et AR36 (pykF-) ont été comparées à l’aide de flacons à secousses contenant 15 g/L de Glc et 5 g/L de YE. Comme témoin, les mêmes souches contenant un plasmide pTrc327par vide (sans l’opéron Aro6), AR2e et AR3e, ont également été incluses.

Même si l’AS s’est accumulé dans tous les cas, comme prévu pour les mutants d’aroK et d’aroL, les souches contenant du pTrcAro6 ont atteint des concentrations d’AS plus élevées que celles avec un plasmide vide (Figure 3b). De plus, le titre SA était presque deux fois plus élevé dans AR36 que dans AR26 (6,1 g/L contre 3,3 g/L). Une diminution de la consommation de Glc a été observée dans la souche AR26 après environ 18 h de culture, en corrélation avec une concentration élevée en acétate et un arrêt de la production de SA. En revanche, la souche AR36 a présenté une consommation constante de Glc et des quantités négligeables d’acétate ont été produites (Figure 3c, 3d). Ces résultats démontrent que les gènes présents dans l’opéron artificiel sont fonctionnels et favorisent la production de SA depuis le début de la culture. Leur expression constitutive a diminué le taux de croissance spécifique (μ) de 25% dans le fond pykF+, et l’a légèrement augmenté dans le variant pykF-, mais n’a pas entraîné de changements significatifs de la biomasse maximale produite (Xmax) par rapport aux souches avec un plasmide vide (Figure 3a). Remarquablement, dans les souches exprimant l’opéron dans ces conditions de croissance, l’inactivation du gène pykF a augmenté la production de SA, éliminé l’accumulation d’acétate et permis une consommation régulière de Glc.

Comportement des souches AR26, AR36, et de leurs dérivés plasmidiques vides, AR2e (pykF+) et AR3e (pykF-), en utilisant des flacons agités contenant 15 g/L de Glc et 5 g/L de YE (a, b, c, d), et des fermenteurs 1 L contenant 100 g/L de Glc et 15 g/L de YE (e). a) Croissance; b) production de SA; c) Consommation de Glc; d) production d’acétate; e) Consommation de Glc et production SA d’AR26 et d’AR36 dans les fermenteurs. Les barres d’erreur représentent l’écart type.

Pour déterminer si la production d’acétate plus élevée et la production d’AS plus faible dans AR26 par rapport à AR36 sont une conséquence de la faible disponibilité en oxygène et de l’acidification intrinsèquement faibles du milieu dans les cultures en flacons agités, les deux souches ont été cultivées dans des fermenteurs de lot de 1 L dans des conditions contrôlées de pH et de tension d’oxygène dissous (DOT). Comme approche pour augmenter le titre de SA, la concentration initiale de Glc dans ces expériences a été portée à 100 g / L, et la concentration de YE a été simultanément augmentée à 15 g / L pour permettre une production de biomasse plus élevée.

Dans ces conditions, la souche AR36 a produit 42 g/L de SA en 60 h, consommant tout le Glc, et accumulant 12 g/L d’acétate. En revanche, après 47 h, la souche AR26 a produit un maximum de 13 g/L de SA, n’a pas épuisé le Glc et a accumulé 29 g/L d’acétate (Figure 3e et tableau 2). Indépendamment des conditions contrôlées dans les fermenteurs, où le pH était maintenu à 7 et le POINT était supérieur à 20% en tout temps, les profils de production des deux souches ressemblaient au comportement observé dans les flacons à secousses, AR26 produisant plus d’acétate et moins de SA. Même lorsque le taux de consommation volumétrique global de Glc (Qsglobal), μ et Xmax atteints par les deux souches étaient similaires, la productivité, le rendement et le titre étaient plus de deux fois plus élevés dans AR36 que dans AR26 (Figure 3e et tableau 2).

Il est remarquable que des différences aussi importantes dans la production d’acétate et de SA aient été observées en perturbant un seul gène, ce qui démontre les avantages de l’inactivation combinée de PTS et de pykF lors de l’utilisation d’un système d’expression constitutif dans une souche évoluée d’E. coli. Pour tenir compte des améliorations observées dans la production de SA, nous suggérons que l’expression précoce et constante des enzymes codées dans l’opéron pourrait maintenir une consommation régulière d’intermédiaires glycolytiques à travers les cultures, empêchant de fortes fluctuations de leurs concentrations intracellulaires. Nous émettons l’hypothèse que la combinaison de cet état métabolique stable avec un flux réduit de PEP en pyruvate causé par l’inactivation du gène pykF peut augmenter la disponibilité de PEP et d’autres précurseurs glycolytiques pour la production d’AS sans diminuer le taux de consommation de Glc. Cependant, nous reconnaissons qu’en l’absence de concentrations de métabolites intracellulaires mesurées, ces remarques sont spéculatives.

Profils de fermentation d’AR36 dans des cultures batch

Compte tenu des résultats précédents, AR36 a été sélectionné pour une caractérisation plus poussée de ses performances cinétiques et stoechiométriques dans des fermenteurs de 1 L. Pour atteindre cet objectif, la production de SA a été testée dans trois conditions différentes de culture à substrat élevé. La croissance, la Ccg et les sous-produits ont été mesurés pour chaque cas, ce qui a permis de comparer les productivités et les rendements.

Tout d’abord, 50 g/L de Glc et 15 g/L de YE ont été utilisés (figure 4a). La croissance s’est produite au cours des 10 premières heures, générant 6,3 g /L de poids de cellules sèches avec un μ de 0,53 h-1. Dans cette condition, 24 g / L de SA ont été produits en 32 h. La consommation de Glc et la production de SA se sont produites depuis le début de la fermentation et ont duré jusqu’à l’épuisement du Glc, bien que le taux de consommation spécifique de Glc (qs) et la productivité spécifique de SA (qp) soient plus élevés en phase exponentielle (tableau 3). Le rendement résultant de l’AS sur Glc (YSA/ Glc) était de 0,47 mol/mol et la productivité volumétrique globale de l’AS (Qpglobal) était de 0.74 gSA/L*h (tableau 3). En ce qui concerne l’accumulation de sous-produits dans la voie SA, des concentrations de 2,4 g/L de DAHP, 2,1 g/L de DHS, 1,4 g/L de QA, 0,4 g/L de GA et 0,3 g/L de DHQ étaient présentes dans le surnageant en fin de fermentation (Figure 5a). Dans ces conditions, pratiquement aucun acétate n’a été produit au cours de la fermentation, atteignant une concentration maximale de 1,5 g/L après 32 h (Figure 4a).

Profil de fermentation de la souche AR36 cultivée dans des bioréacteurs de 1 L avec trois concentrations de substrat différentes. a) 50 g /L de Glc et 15 g /L de YE; b) 100 g /L de Glc et 15 g /L de YE; c) 100 g / L de Glc et 30 g /L de YE. Glc: cercles; SA: carrés; acétate: triangles ouverts; concentration de biomasse: triangles inversés. Les barres d’erreur représentent l’écart type.

Des sous-produits aromatiques de la voie SA détectés dans des cultures fermenteurs de 1 L de la souche AR36 en utilisant trois concentrations de substrat différentes. a) 50 g /L de Glc et 15 g /L de YE; b) 100 g /L de Glc et 15 g /L de YE; c) 100 g / L de Glc et 30 g /L de YE. Diamant: DAHP (3-désoxy-D-arabinoheptulosonate 7-phosphate); carrés: DHQ (acide 3-déhydroquinique); cercles: DHS (acide 3-déhydrochikimique); triangles: QA (acide quinique); triangles inversés: GA (acide gallique). Les barres d’erreur représentent l’écart type.

Considérant que 50 g/L de Glc ont été consommés complètement, une deuxième expérience de lot a été initiée avec 100 g/L de Glc et 15 g/L de YE. Comme indiqué dans la comparaison avec AR26 dans la section précédente, AR36 cultivé dans ces conditions a produit environ 42 g/L de SA en 60 h (Figure 4b). Dans ce cas, après avoir consommé environ 100 g/L de glucose et atteint la concentration maximale en SA, la souche a produit 12 g/L d’acétate. Les valeurs obtenues pour YSA/Glc, Qpglobal, Qsglobal, Xmax et μ, étaient similaires à celles obtenues avec 50 g/L de Glc et 15 g/L de YE (Tableau 3). Ces expériences montrent que lorsque l’on utilise la même concentration de YE, deux fois la quantité de Glc est consommée en presque deux fois plus de temps, ce qui indique que le taux moyen de consommation de glucose est maintenu entre les deux conditions de culture. Concentrations de 4,8 g / L de DAHP, 2,8 g / L de DHS, 3,4 g / L d’AQ, 0.7 g/L de GA et 0,9 g/L de DHQ étaient présents dans le surnageant après 60 h (Figure 5b). Il est intéressant de noter qu’en doublant la concentration de Glc, les produits intermédiaires de la voie AAA ont augmenté de manière assez proportionnelle avec l’AS, ce qui indique que la consommation de 100 g / L de Glc n’a apparemment pas généré de nouveaux goulots d’étranglement du flux de carbone. En conséquence, la quantité de SA formée par rapport au total des composés aromatiques produits était proche de 80% dans les deux expériences (figure 6).

Pourcentage molaire de chaque composé aromatique produit dans la souche AR36 par rapport au total dans les cultures discontinues commençant par: a) 50 g/L de Glc et 15 g/L de YE; b) 100 g/L de Glc et 15 g/L de YE; c) 100 g/L de Glc et 30 g/L de YE. Les rendements calculés et les rapports molaires des composés aromatiques produits sont indiqués sous chaque barre. Les comparaisons ont été faites avec les concentrations mesurées dans le surnageant à la fin des fermentations. YSA/Glc = rendement en SA de Glc; YTAC/Glc = rendement des composés aromatiques totaux de Glc; Ymax = rendement théorique maximal des composés aromatiques.

L’effet de l’augmentation du YE sur la productivité de l’AS a été étudié avec une troisième série d’expériences, utilisant 100 g/L de Glc et 30 g/L de YE. Bien que la biomasse ait été doublée en utilisant deux fois la concentration de YE, le titre SA, μ et YSA/ Glc étaient très similaires à ceux obtenus en culture avec 100 g /L de Glc et 15 g /L de YE (Figure 4b et Figure 4c). En conjonction avec les données obtenues à partir des deux autres conditions, ces résultats suggèrent que la quantité de YE détermine principalement la biomasse maximale pouvant être atteinte. De plus, un accroissement de la concentration initiale de YE n’a pas modifié le titre de SA et confirme l’observation selon laquelle l’AS est principalement produite à partir de glucose. La relation directe entre la concentration initiale d’YE et la biomasse maximale générée, quelle que soit la concentration initiale de Glc testée dans ces conditions de croissance, suggère qu’un ou plusieurs nutriments limitants sont fournis par l’YE. Il semblerait également que de tels nutriments ne puissent pas être synthétisés à partir de Glc, d’où leur épuisement par YE limite la croissance bien avant que le Glc ne soit épuisé. On s’attend à ce que les acides aminés aromatiques et les vitamines présents dans l’YE qui sont nécessaires pour contrer l’auxotrophie AR36 deviennent limitants; cependant, d’autres composés de ce milieu complexe peuvent également jouer un rôle dans la limitation de la croissance au fil du temps.

Pour une concentration initiale en YE de 30 g/L, un total de 106 g/L de Glc et 43 g/L de SA ont été consommés et produits, respectivement, en environ la moitié du temps que la fermentation avec 15 g/L de YE. Avec 30 g/L de YE, le Qsglobal et le Qpglobal ont été multipliés par deux, par rapport aux fermentations avec 15 g/L de YE, même si le titre SA est resté inchangé (Tableau 3). Étant donné que la biomasse a également été multipliée par deux, la qp et la qs calculées étaient similaires entre les trois expériences, à la fois en phase exponentielle et en phase stationnaire, montrant la robustesse métabolique de la souche modifiée dans les conditions testées.

De plus, les résultats ont montré qu’une augmentation de la concentration en YE n’augmentait pas considérablement la concentration des intermédiaires de la voie SA (figure 5c). A cet égard, il a été reconnu que la présence de quantités élevées d’intermédiaires de voie peut avoir un impact négatif sur la récupération de l’AS à partir du bouillon de fermentation. Cette préoccupation a orienté certains efforts sur le sujet, menant à la mise à l’essai des conditions de culture, des antécédents génétiques et de l’utilisation d’analogues de glucose non métabolisables, pour tenter de minimiser la génération de sous-produits.

Dans ces expériences, une proportion élevée de SA par rapport aux sous-produits a été détectée sans appliquer de modification supplémentaire à la souche ou au procédé. La concentration de chaque intermédiaire de voie a été comparée à la somme de tous les intermédiaires aromatiques, et leurs pourcentages ont été utilisés pour calculer le rapport molaire de SA à chaque sous-produit à la fin des fermentations (Figure 6). Le rapport de SA s’est avéré supérieur à 10 pour DHS, QA ou DAHP, et supérieur à 40 pour GA ou DHQ pour toutes les concentrations de substrat testées. Remarquablement, dans toutes les conditions les rendements SA obtenus étaient proches de 50% du maximum théorique et les rendements en composés aromatiques totaux (TAC) étaient supérieurs à 60% du maximum théorique, estimés à 0.86 molTAC/molGlc (voir Méthodes et figure 6). Cela reflète la redirection efficace du glucose vers la voie AAA dans la souche AR36, même lors de l’utilisation de cultures batch à haute teneur en glucose. Le rapport SA/sous-produits, ainsi que les rendements SA et TAC obtenus sont assez constants pour toutes les conditions évaluées, et représentent à notre connaissance les valeurs les plus élevées rapportées pour un processus de fermentation de production SA. Ces améliorations peuvent être justifiées en tenant compte du fait que la plate-forme présente dans la souche modifiée permet une expression plus homogène des enzymes nécessaires sur un fond génétique efficace. Ceci, contrairement à d’autres systèmes d’expression où les gènes requis sont exprimés à partir de plasmides séparés, sous différents promoteurs, ou dans des souches non optimisées pour une utilisation efficace de niveaux élevés de Glc. Outre les avantages concernant la dynamique d’expression des gènes, le fait que l’IPTG ne soit pas nécessaire pour induire l’opéron Aro6 représente un avantage économique important pour le processus de production, car le prix élevé de l’IPTG limite son utilisation dans les fermentations à grande échelle.

Aperçu des métabolismes glycolytiques et acétate de la souche AR36 par RT-qPCR

Pour mieux comprendre les changements métaboliques induits par l’expression constitutive de l’opéron synthétique Aro6 dans la souche AR36, les taux de transcription de plusieurs gènes ont été mesurés à trois stades de croissance différents dans des cultures contenant 50 g/L de Glc et 15 g/L de YE. Comme détaillé dans les méthodes, les données obtenues à partir de la phase exponentielle précoce (EE), de la phase exponentielle tardive (LE) et de la phase stationnaire (ST) ont été normalisées par rapport aux valeurs mesurées à partir de la souche AR3e à EE, cultivée dans les mêmes conditions de culture.

Les résultats indiquent que la présence et l’expression de l’opéron dans la souche AR36 augmentent les niveaux transcriptionnels de plusieurs gènes codant pour les enzymes glycolytiques pendant les phases EE et LE (Figure 1 et Figure 7a). L’augmentation de l’expression des gènes galP et glk est particulièrement intéressante car il a été rapporté que leurs produits contrôlent l’importation et la phosphorylation du glucose dans PB12, la souche parentale d’AR36. En outre, il y a une augmentation significative des niveaux transcriptionnels d’igp et d’eno, mais pas de pykA. Ces changements peuvent se traduire par une plus grande disponibilité de PEP et de fructose 6-P (qui peuvent être directement convertis en E4P par la transkétolase codée par un plasmide), augmentant le rendement en composés aromatiques. Nous supposons que la régulation à la hausse observée des gènes glycolytiques dans la souche AR36 pourrait être l’une des conséquences de faibles niveaux de certains intermédiaires glycolytiques (glucose 6-phosphate, fructose 6-phosphate et PEP), causée par l’expression forte et constitutive des enzymes codées par les opérons qui consomment ces métabolites.

Changements transcriptionnels résultant de l’expression de l’opéron synthétique Aro6 dans la souche AR36. À titre de comparaison, le taux de transcription de chaque gène a été déterminé en trois points différents de la courbe de croissance de la souche AR36, cultivée avec 50 g/L de Glc et 15 g/L de YE (voir Figure 4a). Toutes les données ont été normalisées par rapport aux valeurs obtenues à partir de la souche AR3e au début de la phase de croissance exponentielle. a) Gènes codant pour les enzymes glycolytiques; b) gènes impliqués dans l’assimilation et la biosynthèse de l’acétate; c) gènes compris dans l’opéron synthétique Aro6 (voir Figure 1 et Figure 2). Barres noires: phase exponentielle précoce; barres grises: phase exponentielle tardive; barres blanches: phase stationnaire. Les barres d’erreur représentent l’écart type.

D’autre part, les niveaux transcriptionnels des gènes codant pour les enzymes impliquées dans la biosynthèse de l’acétate (poxB, ackA et pta) n’ont pas été modifiés par la présence de l’opéron synthétique, tandis que l’actP et l’acs, codant pour les enzymes impliquées dans l’assimilation de l’acétate, ont été fortement régulés à la hausse dans les phases EE et LE (Figure 7b). Une régulation à la hausse des gènes actP et acs a également été détectée dans la phase de croissance exponentielle de la souche parentale PB12 qui est capable de co-utiliser le Glc et l’acétate dans un milieu minimal. Ces résultats sont en corrélation avec les faibles niveaux d’acétate dans la condition de croissance mesurée (figure 4a). Fait important, les valeurs transcriptionnelles de ces gènes impliqués dans l’assimilation de l’acétate étaient faibles en phase ST (figure 7b). Si cette réponse est représentative des autres conditions de croissance utilisées, elle pourrait expliquer en partie l’accumulation d’acétate observée dans les fermentations avec 100 g/L de Glc, qui consomment des quantités plus élevées de Glc pendant la phase stationnaire (Figure 4b et Figure 4c). Ces résultats mettent en évidence l’actP et l’acs comme cibles génétiques potentielles pour augmenter artificiellement leur expression aux stades tardifs de la culture, en tirant parti des capacités attendues de la souche AR36 pour utiliser simultanément le Glc et l’acétate, présents dans sa souche parentale PB12.

Les gènes présents dans l’opéron synthétique ont montré des niveaux d’expression très forts (même en phase stationnaire), reflétant la nature constitutive du promoteur et un nombre élevé de copies du plasmide (Figure 7c). Ces résultats sont en corrélation avec la consommation ininterrompue de Glc et la production de SA observées pendant toute la fermentation (Figure 4a), suggérant que les enzymes codées par les gènes de l’opéron sont présentes tout au long du temps de culture. On peut voir sur la figure 7c que les niveaux de transcription d’aroD et de zwf sont respectivement comparativement plus élevés et plus bas que les quatre autres gènes de l’opéron. Cette observation doit être prise avec prudence car les six gènes de l’opéron sont comparés à ceux présents dans le chromosome de la souche de référence AR3e. Comme les valeurs obtenues pour les six gènes ne sont pas normalisées entre eux, les variations de leur expression chromosomique dans la souche AR3e peuvent modifier les comparaisons relatives avec la souche AR36. Néanmoins, les données transcriptomiques sont cohérentes avec le rapport élevé de SA aux intermédiaires aromatiques obtenus dans les conditions testées, ce qui est à prévoir si tous les gènes de l’opéron étaient correctement exprimés. Avec les données cinétiques et stœchiométriques, ces résultats mettent en évidence les avantages de l’utilisation d’un opéron synthétique exprimé de manière constitutive comme stratégie alternative pour augmenter le rendement en SA de Glc dans une souche évoluée dépourvue de PTS et de pykF.