Obtenir de la CLARTÉ: Le processus d’Hydrogel crée un cerveau transparent
Processus de CLARTÉ: entretien avec le bio-ingénieur et psychiatre de Stanford Karl Deisseroth. Longueur: 3:58
” Étudier des systèmes intacts avec ce type de résolution moléculaire et de portée mondiale – pour pouvoir voir les détails fins et la vue d’ensemble en même temps — a été un objectif majeur non atteint en biologie, et un objectif que la CLARTÉ commence à aborder “, a déclaré Deisseroth.
“Cet exploit de génie chimique promet de transformer la façon dont nous étudions l’anatomie du cerveau et comment la maladie le modifie”, a déclaré Thomas Insel, MD, directeur de l’Institut national de la santé mentale. “L’étude approfondie de notre organe tridimensionnel le plus important ne sera plus limitée par des méthodes bidimensionnelles.”
Cerveau de souris adulte intact avant et après le processus de CLARITY de deux jours. Sur l’image de droite, les fines structures cérébrales peuvent être vues faiblement comme les zones de flou au-dessus des mots “nombre”, “inexploré”, “continent” et “étirements”.”
La recherche dans cette étude a été réalisée principalement sur un cerveau de souris, mais les chercheurs ont utilisé CLARITY sur le poisson zèbre et sur des échantillons de cerveau humain conservés avec des résultats similaires, établissant une voie pour de futures études d’échantillons humains et d’autres organismes.
“La CLARTÉ promet de révolutionner notre compréhension de la façon dont les changements locaux et mondiaux de la structure et de l’activité du cerveau se traduisent par des comportements”, a déclaré Paul Frankland, pH.D., chercheur principal en neurosciences et en santé mentale à l’Hospital for Sick Children Research Institute de Toronto, qui n’a pas participé à la recherche. La collègue de Frankland, la scientifique principale Sheena Josselyn, PhD, a ajouté que le processus pourrait transformer le cerveau d ‘”une mystérieuse boîte noire” en quelque chose d’essentiellement transparent.
Un lieu impénétrable
Le monticule de matière grise alambiquée et de câblage qu’est le cerveau est un lieu complexe et impénétrable. Les neuroscientifiques ont eu du mal à comprendre pleinement ses circuits dans leur quête pour comprendre comment fonctionne le cerveau et pourquoi, parfois, il ne le fait pas.
Karl Deisseroth
CLARITY est le résultat d’un effort de recherche dans le laboratoire de Deisseroth pour extraire les éléments opaques — en particulier les lipides — d’un cerveau tout en conservant les caractéristiques importantes entièrement intactes. Les lipides sont des molécules grasses présentes dans tout le cerveau et le corps. Dans le cerveau, en particulier, ils aident à former des membranes cellulaires et donnent au cerveau une grande partie de sa structure. Cependant, les lipides représentent un double défi pour l’étude biologique, car ils rendent le cerveau largement imperméable aux produits chimiques et à la lumière.
Les neuroscientifiques auraient aimé extraire les lipides pour révéler la structure fine du cerveau sans trancher ni sectionner, mais pour un problème majeur: l’élimination de ces molécules structurellement importantes provoque l’effondrement du tissu restant.
Les recherches antérieures se sont plutôt concentrées sur l’automatisation de l’approche de coupe / coupe, ou sur le traitement du cerveau avec des molécules organiques qui facilitent la pénétration de la lumière uniquement, mais pas les sondes macromoléculaires. Avec CLARTÉ, l’équipe de Deisseroth a adopté une approche fondamentalement différente.
“Nous nous sommes appuyés sur le génie chimique pour transformer les tissus biologiques en un nouvel état intact mais optiquement transparent et perméable aux macromolécules”, a déclaré Chung, le premier auteur de l’article.
Cette nouvelle forme est créée en remplaçant les lipides du cerveau par un hydrogel. L’hydrogel est construit à partir du cerveau lui-même dans un processus conceptuellement similaire à la pétrification, en utilisant ce qui est initialement une suspension aqueuse de molécules courtes et individuelles appelées monomères d’hydrogel. Le cerveau intact, post mortem est immergé dans la solution d’hydrogel et les monomères infusent le tissu. Ensuite, lorsqu’ils sont “déclenchés thermiquement” ou chauffés légèrement à environ la température corporelle, les monomères commencent à se congeler en longues chaînes moléculaires appelées polymères, formant un maillage dans tout le cerveau. Ce maillage tient tout ensemble, mais, surtout, il ne se lie pas aux lipides.
Avec le tissu ainsi étayé, l’équipe est capable d’extraire vigoureusement et rapidement les lipides grâce à un processus appelé électrophorèse. Il reste un cerveau transparent en 3D avec toutes ses structures importantes – neurones, axones, dendrites, synapses, protéines, acides nucléiques, etc. – intactes et en place.
Mieux faire les choses
La clarté va alors mieux. En préservant la continuité complète des structures neuronales, la CLARTÉ permet non seulement de tracer les connexions neuronales individuelles sur de longues distances à travers le cerveau, mais fournit également un moyen de recueillir des informations moléculaires riches décrivant la fonction d’une cellule qui ne sont pas possibles avec d’autres méthodes.
“Nous pensions que si nous pouvions éliminer les lipides de manière non destructive, nous pourrions être en mesure de faire pénétrer la lumière et les macromolécules profondément dans les tissus, ce qui permettrait non seulement une imagerie 3D, mais également une analyse moléculaire 3D du cerveau intact”, a déclaré Deisseroth, titulaire de la chaire de professeur D.H. Chen.
En utilisant des anticorps fluorescents connus pour rechercher et s’attacher uniquement à des protéines spécifiques, l’équipe de Deisseroth a montré qu’elle pouvait cibler des structures spécifiques dans le cerveau de souris modifié par la CLARTÉ – ou “clarifié” — et faire en sorte que ces structures et seules ces structures s’allument sous éclairage. Les chercheurs peuvent tracer des circuits neuronaux à travers tout le cerveau ou explorer en profondeur les nuances du câblage des circuits locaux. Ils peuvent voir les relations entre les cellules et étudier les structures subcellulaires. Ils peuvent même examiner les relations chimiques des complexes protéiques, des acides nucléiques et des neurotransmetteurs.
Un rendu tridimensionnel du cerveau clarifié imagé d’en bas (moitié ventrale). Une vidéo de survol du cerveau des rongeurs est disponible ici.
” Pouvoir déterminer la structure moléculaire de diverses cellules et leurs contacts grâce à la coloration des anticorps est une capacité essentielle de CLARTÉ, distincte de la transparence optique, qui nous permet de visualiser les relations entre les composants du cerveau de manière fondamentalement nouvelle “, a déclaré Deisseroth, qui est l’un des 15 experts de la “dream team ” qui définira les objectifs de l’initiative de recherche sur le cerveau de 100 millions de dollars annoncée le 2 avril par le président Obama.
Et dans une autre capacité significative du point de vue de la recherche, les chercheurs sont maintenant en mesure de retirer le cerveau clarifié, de rincer les anticorps fluorescents et de répéter à nouveau le processus de coloration en utilisant différents anticorps pour explorer différentes cibles moléculaires dans le même cerveau. Ce processus de coloration / décoloration peut être répété plusieurs fois, ont montré les auteurs, et les différents ensembles de données sont alignés les uns avec les autres.
Ouverture de la porte
La clarté a donc permis d’effectuer des analyses structurales très détaillées et fines sur des cerveaux intacts, même des tissus humains préservés depuis de nombreuses années, a montré l’équipe. La transformation de cerveaux humains en spécimens transparents mais stables avec un câblage accessible et des détails moléculaires peut améliorer la compréhension des fondements structurels du fonctionnement et de la maladie du cerveau.
Vue tridimensionnelle de l’hippocampe coloré montrant des neurones exprimant la fluorescence (en vert), reliant les interneurones (en rouge) et soutenant la glie (en bleu).
Au-delà des avantages immédiats et apparents pour les neurosciences, Deisseroth a averti que la CLARTÉ a fait un bond en avant sur notre capacité à traiter les données. “Transformer des quantités massives de données en informations utiles pose d’immenses défis informatiques qu’il faudra relever. Nous devrons développer des approches informatiques améliorées pour la segmentation d’images, l’enregistrement d’images 3D, le traçage automatisé et l’acquisition d’images “, a-t-il déclaré.
En effet, ces pressions augmenteront à mesure que la CLARTÉ pourrait commencer à soutenir une compréhension plus profonde des systèmes et organes biologiques intacts à grande échelle, peut-être même des organismes entiers.
“Les relations intrasystématiques, non seulement dans le cerveau des mammifères, mais également dans d’autres tissus ou maladies pour lesquels une compréhension complète n’est possible que lorsque l’on peut effectuer une analyse approfondie de systèmes uniques et intacts”, a déclaré Deisseroth. “La CLARTÉ peut s’appliquer à n’importe quel système biologique, et il sera intéressant de voir comment d’autres branches de la biologie peuvent l’utiliser.”
Parmi les autres coauteurs, citons Jenelle Wallace, étudiante de premier cycle; les étudiants des cycles supérieurssung-Yon Kim, Kelly Zalocusky, Joanna Mattis, Aleksandra Denisin et Logan Grosenick; les assistants de recherche Sandhiya Kalyanasundaram, Julie Mirzabekov, Sally Pak et Charu Ramakrishnan; les chercheurs postdoctoraux Aaron Andalman, PhD, et Tom Davidson, PhD; l’ancienne étudiante de premier cycle Hannah Bernstein; et l’ancienne scientifique Viviana Gradinaru.
La recherche a été soutenue par l’Institut National de la Santé mentale (subvention MH099647); la National Science Foundation; la Fondation Simons; le président et prévôt de l’Université de Stanford; les fondations Wiegers, Snyder, Reeves, Gatsby et Yu; le programme de RÉPARATION de la DARPA; et le Fonds Burroughs Wellcome.
Le département de bioingénierie de Stanford a également soutenu les travaux. Le département est géré conjointement par l’École d’ingénierie et l’École de médecine.
