PCR de colonie

La PCR de colonie est une méthode pratique à haut débit pour déterminer la présence ou l’absence d’ADN d’insertion dans les constructions plasmidiques. Les transformants individuels peuvent être lysés dans l’eau avec une courte étape de chauffage ou ajoutés directement à la réaction de PCR et lysés pendant l’étape de chauffage initiale. Cette étape initiale de chauffage provoque la libération de l’ADN plasmidique de la cellule, de sorte qu’il peut servir de modèle pour la réaction d’amplification. Des amorces conçues pour cibler spécifiquement l’ADN d’insertion peuvent être utilisées pour déterminer si la construction contient le fragment d’ADN d’intérêt. Alternativement, des amorces ciblant l’ADN vectoriel flanquant l’insert peuvent être utilisées pour déterminer si l’insert a ou non la taille moléculaire correcte. Les amorces spécifiques à l’insert peuvent fournir des informations à la fois sur la spécificité et la taille de l’ADN de l’insert, tandis que l’utilisation d’amorces spécifiques au vecteur permet de cribler plusieurs constructions simultanément. La PCR des colonies peut également être utilisée pour déterminer l’orientation de l’insert. L’amplification par PCR du plasmide à l’aide d’une amorce spécifique à l’insert associée à une amorce spécifique au vecteur peut être conçue pour produire un amplicon d’une taille spécifique uniquement si l’insert est dans la bonne orientation. Dans toutes les conceptions expérimentales, la présence ou l’absence d’un amplicon PCR et la taille du produit sont déterminées par électrophorèse à côté d’un marqueur de taille d’ADN sur un gel d’agarose.