Les mutations de la chromométhylase d'Arabidopsis cmt3 bloquent la méthylation et le silençage non CG d'un gène endogène | Jiotower

Résultats et discussion

Pour identifier les facteurs qui contrôlent la méthylation et le silençage des gènes WS PAI, nous avons isolé un variant mutant de WS, pai1C251Y, dans lequel le silençage du gène singulet méthylé PAI2 peut être visualisé par l’intensité d’un phénotype de plante fluorescente bleue sous lumière ultraviolette (UV) (Bartee et Bender 2001). Dans la souche pai1C251Y, les seules sources potentielles d’activité enzymatique PAI sont le gène PAI1, qui est paralysé par une mutation faux sens, et le gène PAI2, qui est réduit au silence. En raison de cette carence en PAI, la souche accumule des intermédiaires fluorescents de la voie du tryptophane, ainsi qu’une pigmentation jaune-vert des feuilles, une taille réduite, une buissonnerie accrue et une fertilité réduite. Cependant, des mutations de deuxième site qui soulagent le silençage de PAI2 supprimeront les phénotypes déficients en PAI (Bartee et Bender, 2001). Ainsi, nous avons mutagénisé la souche pai1C251Y et criblé des plantules avec des phénotypes fluorescents faibles supprimés. En tant que criblage secondaire, nous avons testé la méthylation du PAI par analyse Southern blot avec des enzymes de restriction sensibles à la méthylation. Plus précisément, nous avons dosé la méthylation avec les isoschizomères HpaII et MspI, qui reconnaissent la séquence 5′-CCGG-3′. HpaII est sensible à la méthylation des cytosines internes (CG) et externes (CNG), alors que MspI n’est sensible qu’à la méthylation des cytosines externes. Ces enzymes se clivent une fois dans chaque locus WS PAI et révèlent à la fois la densité et le schéma de méthylation de chaque gène (Bender et Fink, 1995; Luff et al. 1999; Melquist et coll. 1999).

À partir de cette stratégie de criblage, nous avons isolé 11 allèles de perte de fonction dans le gène CMT3 (voir ci-dessous et Matériaux et méthodes). Les mutants cmt3 du fond pai1C251Y ont montré une fluorescence fortement réduite au début du développement des plantules et une fluorescence partiellement réduite chez les plantes adultes, avec une taille accrue, une diminution de la buissonnerie et une fertilité accrue (Fig. (Figue.1).1). Ces isolats de cmt3 fluorescents intermédiaires ne sont pas revenus à la nonfluorescence, qui est un diagnostic de la perte de méthylation résiduelle de la PAI2 (Bender et Fink, 1995), à une fréquence détectable. Ils ont montré un clivage partiellement accru avec HpaII et un clivage fortement accru avec MspI pour les gènes PAI par rapport au pai1C251Y parental (Fig. (Figue.2 BIS).2 BIS). Le profil de clivage suggère que les mutants cmt3 sont les plus affectés par le maintien de la méthylation du GNC des gènes PAI. Pour déterminer si les mutants cmt3 affectaient également la méthylation d’une séquence génomique très répétée, nous avons reprogrammé la tache Southern HpaII/MspI avec une sonde sur les séquences de répétition associées au centromère (CEN) de 180 pb (Vongs et al. 1993). Cette sonde a révélé peu d’effet sur le clivage HpaII, mais a augmenté le clivage MspI, conformément au schéma observé pour les gènes PAI (Fig. (Figue.2B).2B). Un schéma similaire d’augmentation du clivage MspI a également été observé au niveau de l’ADNr répété (données non présentées). Tous les 11 allèles cmt3 testés présentaient des schémas de méthylation identiques dans ces essais. De plus, lorsque les allèles cmt3 ont été séparés de l’allèle pai1C251Y dans un arrière-plan WS de type sauvage, ils ont également présenté des motifs de méthylation identiques dans ces essais (Fig. (Figue.2).2). Les patrons de méthylation PAI et CEN étaient distincts des patrons induits par les mutations caractérisées déficientes en méthylation ddm1 et met1 (Fig. (Figue.2; 2; Bartee et Bender 2001).

Pour déterminer plus précisément les motifs de méthylation dans le fond mutant cmt3, nous avons effectué un séquençage génomique des motifs de méthylation dans les régions promotrices PAI1 et PAI2 d’un allèle cmt3 représentatif en utilisant la mutagenèse au bisulfite de sodium (Frommer et al. 1992). Cette analyse a révélé que la majorité des cytosines méthylées (87% dans PAI1 et 70% dans PAI2) se produisaient au niveau des résidus CG (Fig. (Figue.3; 3; Tableau Table1).1). Comparé au promoteur WS PAI1 de type sauvage (Luff et al. 1999; Tableau Table1), 1), la méthylation du CG a été réduite de 34%, la méthylation du GNC a été éliminée et la méthylation asymétrique a été réduite de 93%; dans le promoteur PAI2, la méthylation du CG a été réduite de 8%, la méthylation du GNC a été réduite de 92% et la méthylation non-CG a été réduite de 75%. Ainsi, la perte de la fonction CMT3 a un fort effet sur le maintien du GNC et de la méthylation asymétrique et un effet plus faible sur le maintien de la méthylation du CG. Ces résultats concordent avec les rapports selon lesquels Arabidopsis CMT3 et le maïs ZMET2 sont importants pour le maintien de la méthylation du GNC à divers sites génomiques (Lindroth et al. 2001; Papa et coll. 2001), mais ils montrent en outre que le CMT3 est également important pour le maintien de la méthylation asymétrique des gènes PAI. Ce résultat implique soit que CMT3 contrôle directement la méthylation symétrique et asymétrique, soit que la réduction de la méthylation symétrique dans le fond mutant cmt3 entraîne une réduction de la méthylation asymétrique comme conséquence secondaire. Étant donné que les séquences méthylées dans le promoteur et le premier exon du gène rapporteur PAI2 (∼370 pb) ne contiennent que 16 motifs CG dispersés, la perte de méthylation non-CG hypométhyle de manière significative cette région du gène (Fig. (Figue.3), 3), tenant compte de l’expression améliorée de PAI2 chez le mutant suppresseur.

Le locus mutant cmt3 dans les isolats suppresseurs de cmt3 pai1C251Y a été cartographié par croisements avec la souche polymorphe Nd-0, qui présente une disposition similaire des gènes PAI densément méthylés que l’on trouve dans WS (Melquist et al. 1999). La descendance F2 avec des phénotypes faiblement fluorescents diagnostique de l’homozygotie pour pai1C251Y et cmt3 a été identifiée par inspection visuelle sous lumière UV et confirmée par MSPI Southern blot pour un fort clivage PAI similaire à celui observé dans les isolats suppresseurs parentaux. Une population cartographique de plantes F2 répondant à ces critères a ensuite été utilisée pour marquer les loci génomiques liés au phénotype supprimé. L’analyse cartographique a révélé une liaison à un seul locus sur le bras inférieur du chromosome 1. Parce que le gène putatif de la cytosine méthyltransférase CMT3 correspond à ce locus, nous nous sommes concentrés sur ce gène en tant que candidat. Dans chaque population cartographique, nous avons trouvé une liaison complète avec un marqueur polymorphe situé à moins de 100 kb du gène CMT3. Pour confirmer que le gène CMT3 était bien le site des mutations suppresseurs de méthylation, nous avons cloné et séquencé le gène à partir des 11 isolats mutants. Le séquençage a révélé un seul changement de base dans la séquence codante CMT3 dans chaque isolat. Trois des allèles mutants ont affecté des acides aminés absolument conservés dans le domaine catalytique de la méthyltransférase, y compris l’allèle cmt3G456D représentatif utilisé pour le séquençage du bisulfite. On a prédit qu’un autre allèle terminerait prématurément la protéine. Deux allèles ont créé des mutations de jonction d’épissure. Les cinq allèles restants ont affecté les acides aminés entre le motif IV de la méthyltransférase et l’extrémité C de la protéine qui sont hautement conservés parmi les gènes CMT (Fig. (Figue.4).4).

Pour confirmer davantage que le gène CMT3 était le locus mutant, nous avons transformé les isolats de cmt3 pai1C251Y avec un clone génomique WS de type sauvage du gène CMT3. Les plantules transformantes étaient fortement fluorescentes, de la même manière que celles de la souche pai1C251Y (Fig. (Figue.1).1). Les lignées transformantes testées par Southern blot dans la génération T2 ont montré une reméthylation du gène PAI2 aux niveaux observés dans la souche pai1C251Y originale (données non montrées). Ainsi, le gène CMT3 cloné pourrait compléter les défauts de méthylation mutants. En tant que témoin, le mutant représentant pai1C251Y cmt3G456D a également été transformé avec un clone génomique WS de type sauvage du gène CMT2. Les plantules transformantes CMT2 étaient faiblement fluorescentes, de la même manière que celles de la souche parentale non transformée (Fig. (Figue.1), 1), et n’a pas montré de reméthylation détectable de PAI2. Cette analyse montre que CMT2 ne peut pas se substituer à la fonction CMT3. À cet égard, il est intéressant de noter que CMT2 diffère de CMT3 principalement par sa séquence N-terminale (Fig. (Figue.44).

Souches Arabidopsis déficientes en méthylation Précédemment caractérisées avec des défauts dans le gène DDM1 lié au facteur de remodelage de la chromatine SWI2/SNF2 (Jeddeloh et al. 1999) ou le gène de la MET1 cytosine méthyltransférase lié au Dnmt1 présente des anomalies progressives du développement (Finnegan et al. 1996; Kakutani et coll. 1996; Ronemus et coll. 1996). Notre analyse préliminaire des souches pai1C251Y cmt3 de six générations consanguines et cmt3 de deux générations consanguines n’a révélé aucune ségrégation évidente des changements morphologiques. Cette différence entre cmt3 et d’autres mutants déficients en méthylation est susceptible de refléter le fait que la méthylation de la CG est retenue à un degré plus élevé dans cmt3 que dans ddm1 ou met1 (Fig. (Figue.2; 2; Bartee et Bender 2001). Parce que de nombreux sites méthylés endogènes du génome d’Arabidopsis, tels que les répétitions CEN (Fig. (Figue.2; 2; Vongs et coll. 1993; Lindroth et coll. 2001), et le promoteur du gène homéo-domaine FWA (Soppe et al. 2000; Lindroth et coll. 2001), portant principalement la méthylation de la CG, on ne s’attendrait pas à ce que les mutations de la cmt3 affectent fortement ces loci. Au lieu de cela, CMT3 agit très probablement comme une méthylase renforçante qui ajoute une couche supplémentaire de méthylation à des régions génomiques particulières telles que les gènes PAI, dans lesquelles l’augmentation de la densité de méthylation conduit à un silençage accru. Un modèle spécifique est que la couche basale de méthylation de CG fournie par d’autres fonctions telles que MET1 pourrait servir de guide pour CMT3, qui décorerait ensuite la couche basale avec une méthylation supplémentaire de CG et de non-CG. Le recrutement de CMT3 dans des régions ciblées pourrait impliquer des interactions entre la protéine chromatine et le motif chromodomaine (Henikoff et Comai, 1998), ainsi que des interactions médiées par les séquences N-terminales uniques.

Parce que des champignons tels que Neurospora crassa et Ascobolus immersus peuvent maintenir une méthylation sans CG (Selker et al. 1993; Goyon et coll. 1994), ces organismes pourraient coder des gènes CMT. À l’inverse, comme les animaux tels que les humains et les souris n’ont pas de méthylation non CG, on prévoit que ces organismes manquent de gènes CMT, comme c’est le cas d’après les analyses des bases de données de séquences actuelles. L’absence apparente de méthylases de type CMT dans les génomes animaux (Finnegan et Kovac, 2000) suggère que les animaux ont développé d’autres mécanismes pour renforcer les états de la chromatine.