Synthèse du collagène
Régulation de la synthèse du collagène osseux
La synthèse du collagène dans des cultures d’organes de calvaires de rongeurs et de cultures cellulaires a été évaluée à l’aide de plusieurs essais différents. Dans le dosage le plus utilisé, les calvaires et les cellules sont incubés avec de la proline radiomarquée pendant plusieurs heures avant la fin de la culture. L’incorporation de proline radiomarquée dans des protéines digestibles en collagénase (marquage CDP) et des protéines non collagènes (marquage NCP) est mesurée dans des extraits des cultures utilisant une collagénase bactérienne hautement purifiée. Le pourcentage de synthèse de collagène est calculé à partir des valeurs CDP et NCP après correction de la plus grande abondance de proline dans le collagène par rapport aux protéines non collagènes. La production de collagène peut également être déterminée en mesurant la teneur en hydroxyproline des cultures cellulaires ou organiques, car l’hydroxyproline est pratiquement unique aux collagènes. Ces méthodes ne distinguent pas les différents types de collagène fibrillaire. Cependant, le collagène synthétisé par les cultures d’organes osseux et la plupart des cultures de cellules ostéoblastiques est en grande partie de type I (> 95%), de sorte que la valeur de marquage CDP reflète généralement la synthèse de collagène de type I. Si désiré, la production de différents types de collagène peut être distinguée par chromatographie échangeuse d’ions et électrophorèse sur gel de polyacrylamide d’extraits radiomarqués de cultures cellulaires ou organiques. L’expression du collagène de type I dans les cultures cellulaires humaines a également été évaluée en mesurant la sécrétion du propeptide C-terminal procollagène I. Enfin, des sondes d’ADNc spécifiques dans le Northern blot et des amorces spécifiques aux allèles dans des dosages de réaction en chaîne transcriptase-polymérase inverse ont été utilisées pour évaluer l’expression de l’ARNm du collagène dans des modèles osseux. La mesure de l’effet du 1,25(OH)2D3 sur la synthèse du collagène et les taux d’ARNm a donné des résultats comparables en utilisant ces différents tests.
1,25 (OH) 2D3 inhibe la synthèse du collagène dans des cultures d’organes de calvaires fœtaux de rat de 21 jours et de calvaires de souris néonatales avec peu ou pas d’effet sur la synthèse des protéines non collagènes. L’inhibition maximale de la synthèse du collagène par 1,25 (OH) 2D3 chez les calvaires de rat (environ 50%) se produit à 10 nM. Le 1,24R, 25-(OH) 3D3 inhibe également la synthèse du collagène mais est moins puissant que le 1,25 (OH) 2D3. Le 25-(OH)D3 et le 24R, le 25(OH)2D3 n’altèrent pas la synthèse du collagène en dessous de 100 nM. Les métabolites de la vitamine D inhibent la synthèse du collagène et stimulent la résorption des os longs du rat fœtal avec des puissances relatives similaires qui sont en corrélation avec l’affinité des métabolites pour les VDR du squelette. Pour déterminer la sélectivité cellulaire de l’inhibition 1,25(OH)2D3 de la synthèse du collagène, des cultures d’organes de calvaires de rats fœtaux ont été traitées avec du 1,25 (OH) 2D3 pendant 22 h, puis incubées avec de la proline tritiée pendant les 2 dernières heures de culture. L’os central (ostéoblastes matures) a été disséqué libre du périoste (ostéoprogéniteurs et fibroblastes moins matures) et les deux compartiments ont été analysés séparément pour l’incorporation de proline tritiée. 1,25 (OH) 2D3 diminue la synthèse du collagène dans l’os central mais pas le périoste, indiquant la sélectivité de l’effet 1,25 (OH) 2D3 pour les ostéoblastes matures. En utilisant un protocole in vivo dans lequel des rats néonatals ont reçu de multiples injections de proline tritiée sur une matrice osseuse nouvellement synthétisée par radiomarquage, 25 ng de 1,25 (OH) 2D3 administrés aux jours 1, 3 et 5 ont inhibé la synthèse de la matrice osseuse évaluée par histomorphométrie d’autoradiographies du tibia et du calvaire.
1,25 (OH) 2D3 inhibe également la production de collagène dans les cellules d’ostéosarcome ostéoblastique de rat ROS 17/2,8, les cellules ostéoblastiques primaires de rat et de souris et une lignée de cellules ostéoblastiques murines immortalisées (MMB-1). Le 1,25 (OH) 2D3 a un effet inhibiteur plus important sur la synthèse du collagène de type I lors de la croissance en phase logarithmique des cellules ostéoblastiques murines primaires qu’à la confluence, peut-être parce que les cellules proliférantes contenaient plus de VDR. De même, l’inhibition 1,25 (OH) 2D3 de la synthèse du collagène est plus importante dans les cultures clairsemées de cellules MMB-1 qui ont des niveaux de VDR plus élevés que les cellules MMB-1 confluentes. L’inhibition 1,25 (OH) 2D3 de la synthèse du collagène est équivalente dans les cellules ostéoblastiques primaires de rat clairsemées et confluentes, mais le nombre de VDR n’a pas changé pendant la croissance des cellules. Prises ensemble, ces données montrent que l’ampleur de l’inhibition de la synthèse du collagène par 1,25 (OH) 2D3 est largement déterminée par la quantité cellulaire de VDRs. 1,25 (OH) 2D3 inhibe les taux d’ARNm de collagène pendant la phase proliférative des cultures à long terme de cellules ostéoblastiques primaires de rat et empêche la formation de nodules osseux minéralisés par ces cultures. Ces études montrent que le 1,25(OH)2D3 inhibe la différenciation des ostéoprogéniteurs qui forment des nodules minéralisés dans les cultures cellulaires ostéoblastiques primaires du rat. Cependant, l’inhibition de la formation de nodules par 1,25 (OH) 2D3 peut être secondaire à la suppression de la synthèse de collagène de type I dans les cultures.
Contrairement aux effets inhibiteurs décrits ci-dessus, 1,25(OH)2D3 stimule de manière transitoire la synthèse de collagène et de protéines non collagènes (environ deux fois), qui culmine entre 12 et 24 h, dans la lignée cellulaire ostéoblastique murine immortalisée MC3T3-E1. Dans cette étude, le pourcentage de collagène synthétisé par les cultures (collagène par rapport à la synthèse totale des protéines) n’a pas été rapporté; en conséquence, il n’a pas été possible de déterminer la sélectivité de l’effet 1,25 (OH) 2D3 pour la synthèse du collagène. 1,25 (OH) 2D3 augmente également l’expression du collagène dans la lignée cellulaire d’ostéosarcome ostéoblastique humain MG-63 et les cultures primaires de cellules ostéoblastiques humaines. Fait intéressant, l’augmentation de la synthèse du collagène de 1,25 (OH) 2D3 dans les cellules MG63 est bloquée par la protéine de liaison au facteur de croissance analogue à l’insuline 5, qui interagit directement avec le VDR et empêche l’hétérodimérisation avec le récepteur rétinoïde X RXR. Cependant, dans d’autres études, 1,25 (OH) 2D3 a été montré pour diminuer le pourcentage de synthèse de collagène dans les cellules MC3T3-E1. MC3T3-E1 et MG-63 représentent des cellules préostéoblastiques qui subissent une différenciation ostéogénique in vitro avec l’acide ascorbique; 1,25 (OH) 2D3 inhibe la croissance cellulaire et augmente l’expression de l’ostéocalcine et l’activité de la phosphatase alcaline dans les deux lignées cellulaires. Les cellules MC3T3E1, comme la plupart des lignées cellulaires ostéoblastiques immortalisées, présentent une variation phénotypique significative. Par conséquent, certains de ces résultats divergents peuvent être dus à des variations dans les cellules utilisées pour les expériences. Collectivement, ces données suggèrent que le 1,25 (OH) 2D3 peut agir comme une hormone de différenciation dans les cellules précoces de la lignée des ostéoblastes, ce qui entraîne une augmentation de l’expression du collagène de type I. En revanche, 1,25 (OH) 2D3 inhibe l’expression du collagène de type I dans les ostéoblastes matures.
