Transformation du pesticide récalcitrant chlordécone par Desulfovibrio sp.86 avec un passage de la déchloration à ouverture annulaire à l'activité de sulfuration réductrice / Rapports scientifiques

Isolement de Desulfovibrio sp.86
Analyse du génome de Desulfovibrio sp.86
Desulfovibrio sp.86 dégrade le chlordécone en produits de transformation connus ainsi qu’un composé soufré inattendu
Synthèse de l’étalon de chlordecthiol et confirmation que le produit de transformation F1 est identique au chlordecthiol
La capacité de Desulfovibrio sp.86 pour dégrader les produits de transformation du chlordécone
Étude des conditions d’incubation conduisant à la sulfuration réductrice bactérienne
Pertinence environnementale de la sulfuration réductrice du chlordécone

Isolement de Desulfovibrio sp.86

Isolement de Desulfovibrio sp.86 a été réalisé par le consortium de dégradation du chlordécone 865 en utilisant des conditions de réduction des sulfates. Comme le consortium bactérien 86, capable de transformer le chlordécone, a été obtenu à partir d’un milieu minéral enrichi (MM) nommé MM + 5, additionné de chlordécone, la composition chimique principale a été conservée mais les donneurs et accepteurs d’électrons ont été modifiés. Plusieurs formulations de milieux utilisées pour enrichir les bactéries réductrices de sulfate utilisent des acides organiques, par exemple le lactate, comme sources de carbone et d’énergie (donneur d’électrons) et le sulfate utilisé comme accepteur d’élétron pour la croissance15,16, 17, 18. Dans ce contexte, le pyruvate dans le milieu liquide MM+ a été remplacé par du lactate et du sulfate a été ajouté (milieu liquide MMD, voir section “Méthodes”). L’enrichissement a été étalé sur gélose MMD et les colonies bactériennes brunes de type vibrio (observées au microscope optique) ont été purifiées par deux stries de plaques supplémentaires (Fig. S1). Une souche bactérienne isolée s’est avérée identique à Desulfovibrio sp.86 du consortium 86 sur la base de l’identité à 100% de leurs gènes d’ARNr 16S (1538 pb chacun).

Analyse du génome de Desulfovibrio sp.86

Le génome entier est constitué d’un seul chromosome circulaire de 3 464 070 pb. L’analyse checkm19 réalisée avec 61 génomes et 284 lignées indique que le génome appartient aux Deltaprotéobactéries et que la complétude CheckM est de 100 % (zéro marqueur essentiel manquant). La teneur moyenne en G+C de l’ADN est de 58,06%. Un total de 3 342 séquences d’ADN codantes (CDSS) ont été prédites pour le chromosome, 4 pseudogènes et 10 ARN divers (ARN divers), 3 opérons d’ARNr et 54 gènes d’ARNt.

Les trois gènes de l’ARNr 16S de Desulfovibrio sp.86 sont identiques. Leurs meilleurs coups de SOUFFLE (NCBI) ont été de Desulfovibrio sp non cultivé. clones provenant de piles à combustible microbiennes telles que MFC63A04 (numéro d’accession Genbank: FJ823865; couverture 98%; identité 99,87%) 20. Un arbre phylogénétique utilisant l’ARNr 16S disponible de bactéries cultivables a confirmé les similitudes entre Desulfovibrio sp.86 et Desulfovibrio simplex DSM4141 (numéro d’accession de l’ARNr de Genbank 16S : NR_117110; couverture 99%; identité 99, 22%; séquence génomique indisponible) (Fig. S2) 21. Au niveau génomique, Desulfovibrio sp.86 se classe premier avec Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans str. Génome ATCC 27,774 (Banque de gènes: NC_011883). Néanmoins, Desulfovibrio sp.86 ne partage que 1 408 gènes (43%) avec D. desulfuricans (plus de 80% d’identité en acides aminés et 80% de couverture d’alignement). De plus, les identités nucléotidiques moyennes (ANI) entre Desulfovibrio sp.86 et les génomes séquencés de Desulfovibrio sont inférieurs à la valeur limite ANI de 95% généralement acceptée pour la délimitation des espèces (Fig. S3) 22. Ces résultats indiquent que Desulfovibrio sp.86 est probablement une nouvelle espèce du phylum Desulfovibrio. La présence de deux superoxyde dismutases et d’un gène catalase explique sa tolérance relative à l’oxygène. Comme prévu, le Desulfovibrio sp.le génome 86 présente un complément génétique étendu pour le métabolisme du soufre, englobant les voies de respiration du soufre avec des sources inorganiques telles que le sulfate, le sulfite, le bisulfite et le tétrathionate comme accepteurs d’électrons. Les sources de soufre organique peuvent être fournies par des produits de fermentation de la biomasse soufrée (sulfoquinovose de lipides sulfoquinovosyles) sulfoacétate, de l’acide aminé sulfuré non protéogène taurine via le sulfoacétaldéhyde, ou des alcanesulfonates23.

Desulfovibrio sp.86 dégrade le chlordécone en produits de transformation connus ainsi qu’un composé soufré inattendu

La capacité de dégradation du chlordécone du Desulfovibrio sp isolé.la souche 86 a été étudiée en utilisant les techniques GC–MS (Spectrométrie de masse par Chromatographie en phase gazeuse) et LC-HRMS (Spectrométrie de masse à Haute Résolution par Chromatographie en Phase Liquide) dans des conditions de croissance appliquées avec succès pour Desulfovibrio sp.86 isolement (milieu liquide MMD). Le Na2S a été utilisé comme réducteur et une atmosphère anaérobie N2 / H2 (98/2; V / V) a été appliquée à l’aide d’un système de boîte à gants. Ces conditions d’incubation ont conduit à la disparition complète du signal de chlordécone dans la GC–MS et la LC-HRMS, et ont abouti à des profils TP GC–MS et LC-HRMS similaires à ceux obtenus avec Citrobacter sp.866 : monohydrochlordécone A1, pentachloroindène B1, tétrachloroindènes B3-B4 et acides polychloroindénécarboxyliques C1-C2 et C3-C4 (Fig. 1 bis, b). Dans le système de boîte à gants, des cultures bactériennes ont été réalisées à l’aide de flacons en verre de 100 mL avec un film poreux hydrophobe pour permettre l’échange de gaz et éviter la contamination. Cette condition d’incubation a été considérée comme une condition d'” atmosphère renouvelée ” (RA). Dans ce système, l’atmosphère était régulièrement renouvelée avec N 2/H 2 (98/2; V/V) et la boîte n’était pas thermostatée de sorte que la température variait entre 25 et 33 °C Pour mieux contrôler les conditions de croissance et de dégradation, Desulfovibrio sp.86 cultures ont été placées en milieu MMD à l’aide de flacons en verre de 100 mL, scellés avec des septa en caoutchouc butyle, dans une étuve à 30 °C. Les flacons scellés ont d’abord été purgés avec du gaz N2/H2 (98/2; V/V) pour assurer l’anaérobiose. Cette condition d’incubation a été considérée comme des conditions d'” atmosphère confinée ” (CA).

Après une incubation de six semaines avec le chlordécone, le pesticide n’était plus détectable par les mêmes techniques analytiques. En même temps, un seul composé chloré inconnu nommé F1 est apparu. Il n’était détectable que par GC-MS (25,6 min) (Fig. 1c). Comme dans les cultures de dégradation du chlordécone précédemment rapportées5,6, la transformation principale du chlordécone est apparue pendant la phase stationnaire (Fig. 1e). Étant donné qu’aucun pic chloré visible n’a pu être observé dans LC-HRMS (Fig. 1d), nous avons basé l’élucidation structurelle de F1 sur l’interprétation des données GC–MS (Fig. 1f). En supposant que le motif isotopique plus élevé centré à m /z 507,8 contenait l’ion moléculaire, nous avons émis l’hypothèse de deux formules neutres possibles pour F1, C10Cl10O2H2 et C10Cl10SH2. Les fragments à la source étaient très similaires à ceux observés dans les structures polychlorées à base de bishomocubane, y compris le chlordécone, les hydrochlordécones, le chlordécol et le mirex5, 6, 24. En effet, les patrons isotopiques à m/z 201,0, 235,9 et 271.9 provient vraisemblablement de la rétrocyclodimérisation du bishomocubane à la source connue et correspond à des fragments de C5 chargés positivement. La comparaison avec des simulations isotopiques a limité la possibilité aux ions radicaux suivants: +· +· et +·, avec n = 0,1. Cette dernière formule générique bis-oxygénée s’est avérée hautement improbable car elle nécessitait la présence d’une fonction gem-diol ou d’une fraction gem-chlorhydrine sur le cycle cyclopentényle qui devait résister aux conditions chromatographiques difficiles de GC (> 200 °C). Au lieu de cela, nous avons conclu qu’une fraction soufrée, c’est-à-dire une fonction thiol, était probablement présente sur le polycycle de bishomocubane. Nous avons proposé pour F1 la structure représentée à la Fig. 2a et a suggéré le nom de chlordecthiol, l’analogue soufré du chlordécol (alcool de chlordécone).

Synthèse de l’étalon de chlordecthiol et confirmation que le produit de transformation F1 est identique au chlordecthiol

Afin de confirmer la structure de F1, le chlordecthiol standard a été synthétisé chimiquement et entièrement caractérisé. Pour obtenir une sulfuration réductrice chimique du chlordécone, deux étapes étaient nécessaires. La première consistait en la conversion de la fonction gem-diol du chlordécone en équilibre avec la cétone form20,25 correspondante en l’analogue soufré, c’est-à-dire la fraction gem-thiol/thiocarbonyle. Pour effectuer cette étape, des réactifs soufrés contenant du phosphore sont généralement appliqués26,27. Ici, nous avons utilisé du décasulfure de phosphore (P4S10) également appelé réactif de Berzelius 27,28 selon le protocole de Zaidi et de collègues qui ont synthétisé avec succès le camphorthiol29 (Fig. 2 bis). La deuxième étape a consisté en la réduction de l’intermédiaire gem-thiol à l’aide de NaBH4. Après purification, on obtient un solide blanc avec un rendement global de 73% (Fig. 2 bis). Les analyses RMN 1D et 2D ont confirmé la structure du chlordecthiol: (i) deux signaux 1H intégrant chacun un proton et couplés ensemble (δ 3,78 ppm, d, J = 5,5 Hz et δ 2,01 ppm, d, J = 5,5 Hz), celui à δ 3,78 ppm étant corrélé à un signal 13C décalé en champ inférieur (δ 55,1 ppm) dans l’expérience HSQC qui rendent parfaitement compte de la fraction CH à côté de la fonction thiol et (ii) un total de six signaux 13C visibles reflétant le plan de symétrie conservé dans la structure actuelle du bishomocubane (Fig. 2a, Fig. S19–23). Bien qu’en transformation microbienne, F1 n’ait pas pu être détecté à l’aide de l’outil LC-HRMS dans les conditions développées, un échantillon concentré du chlordecthiol étalon synthétique a fourni un signal significatif. La présence d’un atome de soufre et la formule neutre attendue C10Cl10SH2 ont été confirmées (Fig. 2c, d), et les formules brutes C10Cl10O2H2 ont été exclues (Fig. 2b). Enfin, l’analyse GC–MS a démontré la correspondance parfaite (c’est-à-dire le même temps de rétention de 25,6 min et les mêmes spectres de masse dans la source Fig. S6) entre la norme synthétique et TP F1, l’attribuant ainsi définitivement comme chlordecthiol. En effet, F1 représente le premier membre d’une nouvelle famille de chlordécone TPs possédant pour la première fois un atome de soufre.

La capacité de Desulfovibrio sp.86 pour dégrader les produits de transformation du chlordécone

Composés A1, B1, C1-C2 et F1 représentatifs des quatre familles de TPs éventuellement formées en présence de Desulfovibrio sp.86 ont été synthétisés selon des protocoles chimiques précédemment rapportés6 et développés ici pour F1. Chacun d’eux a été incubé en présence de Desulfovibrio sp.86 cultures dans des conditions dont il a été démontré qu’elles favorisent la sulfuration réductrice (flacon scellé; conditions de CA) ou la déchloration avec ouverture annulaire (flacon ouvert; conditions de PR). Une double surveillance GC-MS et LC-HRMS de tous les échantillons a été effectuée.

Après une incubation d’un mois dans des conditions de CA, le 10-monohydrochlordécone A1 a été complètement transformé en deux composés chlorés inconnus à peine séparés par GC-MS (temps de rétention: 24,3 min F2 et 24,5 min F3, Fig. 3, Fig. S7-S11). Ils ont montré un spectre de masse identique dans la source qui était très similaire au motif de fragmentation F1 (Fig. S8). Tous les fragments détectés dans la source se sont révélés posséder un atome de chlore de moins que leurs analogues dans le spectre de masse F1. Les composés F2 et F3 sont donc supposés être des diastéréoisomères du 10-monohydrochlordecthiol (Fig. 3c). Ceci a été confirmé par la synthèse chimique des deux étalons 10-monohydrochlordecthiol à partir du 10-monohydrochlordécone A1 selon le procédé précédemment appliqué pour la synthèse du chlordecthiol F1 (Fig. S24–27). Ces étalons chimiques avaient les mêmes temps de rétention (24,3 et 24,5 min) et les mêmes spectres de masse par rapport aux F2 et F3 biologiques (Fig. S8). TPs B1, C1-C2 et F1 sont restés inchangés même après une incubation de six mois avec Desulfovibrio sp.86 sous conditions d’AC.

Après une incubation de six mois dans des conditions de PR, le chlordecthiol F1 a été partiellement converti en 10-monohydrochlordecthiols F2 et F3, et deux autres espèces chlorées inconnues détectées par GC-MS, nommées F4 (temps de rétention: 17,9 min) et F5 (temps de rétention: 26,6 min) (Fig. 3d, Fig. S12). Aucun de ces deux composés n’a donné de signal détectable dans LC-HRMS. L’analyse GC–MS a permis de proposer C10Cl6SH4 comme formule brute pour F4 (Fig. S14), et C11Cl10SH4 pour F5 (Fig. S15). Le chlordécsulfure de méthyle a été synthétisé chimiquement et entièrement caractérisé par RMN (Fig. S28–31). La correspondance parfaite des temps de rétention de GC et des spectres de masse de GC du chlordécsulfure de méthyle et du F5 biologique (Fig. S13) confirme son identité postulée. À noter, la structure de F5 (Fig. 3d) représente une forme S-méthylée de F1. La nature exacte de F4 reste à éclaircir (voir SI – Texte supplémentaire). Tous les autres TPS sont restés inchangés dans les conditions d’AR.

En résumé, A1 (formé dans des conditions de RA) a subi une sulfuration réductrice tout comme le chlordécone; dans les deux conditions d’incubation, les polychloroindènes (B1 et C1-C2) ne semblaient pas dégradables par Desulfovibrio sp.86, alors que F1 (produit dans des conditions CA) pourrait être transformé dans des conditions RA (Fig. 3).

Étude des conditions d’incubation conduisant à la sulfuration réductrice bactérienne

Pour interroger les paramètres physico-chimiques ou physiologiques influençant les voies de transformation du chlordécone dans les cultures de Desulfovibrio sp.86, La surveillance GC–MS (présence de B1 et de F1 comme preuves des conditions de RA et de CA, respectivement) a été choisie.

Deux composés inorganiques contenant du soufre, le réducteur Na2S et l’accepteur d’électrons Na2SO4, étaient présents dans le milieu liquide MMD d’origine. Une première série d’expériences dans des flacons scellés avec substitution de Na2S par d’autres agents réducteurs, sulfurés ou non, à savoir la cystéine et le citrate de titane (III) (TiCi) a conduit à un taux comparable de chlordecthiol F1 (Tableau 1). Des traces de TP B1 ont également été observées dans toutes les expériences, y compris Na2S, le témoin positif (tableau 1).

Tableau 1 Influence de l’agent réducteur sur le profil TP du chlordécone.

Une deuxième série d’expériences a été conçue en utilisant le Na2S comme agent réducteur et d’autres accepteurs d’électrons à base de soufre dans des flacons scellés (tableau 2). L’utilisation de sulfate inorganique enrichi en 34S à 90% a abouti à un produit de chlordecthiol présentant un niveau d’enrichissement similaire en 34S (90% 34S-F1 / 10% F1, Fig. S16). L’analyse GC–MS de l’espace de tête de culture a également révélé la présence de H234S et de H3C34SH (Fig. S16), montrant ainsi que Desulfovbibrio sp.86 produit du H2S à partir de sulfate. Ces gaz ont été détectés dans l’espace de tête de culture dans des conditions de CA, en utilisant le milieu MMD, alors qu’ils étaient absents de l’espace de tête de culture dans des conditions de RA qui correspondaient à l’atmosphère de la boîte à gants (Fig. S17). L’absence de sulfate n’a pas inhibé Desulfovibrio sp.86 croissance, mais elle a entraîné la formation de B1 (tableau 2) 5. Le remplacement du sulfate par du sulfite, du bisulfite ou du thiosulfate a conduit dans tous les cas à la formation de chlordecthiol F1.

Tableau 2 Influence de l’accepteur d’électrons à base de soufre sur le profil TP du chlordécone.

Une troisième série d’expériences utilisant des pots a étudié l’effet de la nature de la phase gazeuse en contact avec la culture. Entre l’état RA utilisant des flacons ouverts dans une boîte à gants et l’état CA utilisant des flacons scellés dans un four, plusieurs paramètres différaient (nature et volume de l’atmosphère, température). En utilisant un système de pots comprenant plusieurs flacons, nous étudions de manière sélective l’effet du renouvellement de l’atmosphère sur la transformation du chlordécone par Desulfovibrio sp.86 en MMD moyen. Dans chaque cas, des flacons ouverts avec des films poreux hydrophobes ont été placés dans des bocaux initialement purgés avec un gaz sélectionné. Tous les pots ont été incubés à 30 °C. Certains d’entre eux ont été rincés plusieurs fois, pour imiter le système de boîte à gants, tandis que d’autres ont été maintenus fermés.

Les pots 1-4 contenaient deux flacons ouverts identiques remplis de MMD, de chlordécone et de Desulfovibrio sp.86 inoculum et un témoin abiotique négatif. Parmi eux, deux pots ont été rincés deux fois par semaine, le pot 1 avec (N2 / H2 (98/2; V / V)), le pot 2 avec N2 (Fig. 4a), alors que les pots 3 et 4, initialement purgés avec N2 et (N2/H2 (98/2; V/V)) ont respectivement été laissés non rincés (Fig. 4b).

Les deux derniers pots (pot 5 et 6) contenaient trois flacons ouverts remplis de MMD, de chlordécone et de Desulfovibrio sp.86, plus une culture sans sulfate. Ces bocaux ont d’abord été rincés avec (N2/H2 (98/2; V/V)) et laissés sans rinçage pendant 2 mois (Fig. 4c).

Parallèlement aux bocaux, deux flacons scellés remplis de MMD sans sulfate, de chlordécone et de Desulfovibrio sp.86 ont été rincés avec du H2S synthétisé extemporairement (Fig. S4).

Après deux mois d’incubation à 30 °C, la TP B1 a été détectée dans des flacons placés dans les pots rincés 1 et 2 (Tableau 3a), alors que la TP F1 n’a été trouvée que dans des flacons placés dans des pots non rincés 3 et 4 (tableau 3b). Aucune TP n’était présente dans les témoins abiotiques. Dans les pots 5 et 6, F1 était présent à la fois dans Desulfovibrio sp sans sulfate et sans sulfate.86 cultures ouvertes (tableau 3c). De la même manière, Desulfovibrio sp.86 cultures sans sulfate, rincées avec H2S ont montré des niveaux significatifs de TP F1, alors qu’aucune transformation n’a été observée dans le témoin négatif (tableau 3d).

Tableau 3 Influence de l’atmosphère gazeuse sur le profil de TP du chlordécone.

Une expérience chimique supplémentaire a été réalisée pour évaluer l’influence du H2S sur la transformation du chlordécone. Un protocole chimique classique permettant la formation de TPs B et C a été appliqué (chlordécone, citrate de titane, vitamine B12, eau). Sous atmosphère N2, B et C TPs ont été obtenus, cependant sous atmosphère H2S, seul A1 a été produit (Fig. S18).

Ces résultats montrent clairement que la formation de chlordecthiol F1 nécessite un système d’incubation fermé avec une atmosphère réductrice. Cependant, H2 comme atmosphère de gaz initiale n’est pas obligatoire alors que la présence de H2S est requise. Chimiquement, la présence de H2S empêche le processus de déchloration à ouverture annulaire.

Pertinence environnementale de la sulfuration réductrice du chlordécone

Nous avons réexaminé notre précédente collecte d’échantillons environnementaux contaminés au chlordécone de l’île de la Martinique (huit sols et deux sédiments de lit) dans lesquels différentes concentrations de TPS de chlordécone avaient été rapportées6. Parmi les nouveaux TPS contenant du soufre rapportés ici, nous avons trouvé des niveaux appréciables de F1 dans les deux échantillons de sédiments de lit (927 et 928) à une concentration estimée à environ 50 µg/kg et 20 µg/kg de sédiments humides, respectivement (tableau S1). En parallèle, les données sur la diversité des populations bactériennes issues de l’analyse par métabarcodage de ces échantillons (Fig. 5, Fig. S5) ont été traitées pour récupérer un regroupement hiérarchique d’échantillons environnementaux selon leur composition taxonomique 6. On a remarqué que les bactéries réductrices de sulfate étaient beaucoup plus présentes dans les sédiments du lit que dans les autres compartiments, comme indiqué précédemment 30,31,32.

Transformation du pesticide récalcitrant chlordécone par Desulfovibrio sp.86 avec un passage de la déchloration à ouverture annulaire à l’activité de sulfuration réductrice