COLO 205

a sejtek sikeres tenyésztése:

*kérjük, olvassa el a következő fontos műszaki információkat, mielőtt kezelné az ECACC által szállított cellavonalakat*. Ez az információ PDF formátumban is elérhető a főmenüből, az ‘Ügyfélszolgálat’ alatt (kattintson ide).

fagyasztott sejtek tárolása

átvételkor a fagyasztott ampullákat haladéktalanul közvetlenül a gázfázisú folyékony nitrogénbe kell helyezni, kivéve, ha azokat azonnal fel kell használni. Ne használjon alternatívaként a -80cc fagyasztót; ez az életképesség elvesztését eredményezi.

hogyan kell kezelni a fagyasztott sejteket az átvételkor

az ecacc által szállított fagyasztott cellavonalak szállításának kézhezvételekor fontos, hogy a végfelhasználó késedelem nélkül felhívja a szállítmány figyelmét. Az ampullák szárazjégből történő eltávolítása előtt konzultálni kell a sejtvonalakat kísérő műszaki tanácsokkal. A kézhezvételt követő helyes kezelés kritikus fontosságú a sejtvonal sikeres létrehozásához a végfelhasználó laboratóriumában.

a sejtvonal megrendelésekor a végfelhasználóknak figyelembe kell venniük az új sejtvonal tenyésztési feltételeit is, és gondoskodniuk kell arról, hogy a megfelelő táptalaj rendelkezésre álljon, amikor a sejtek megérkeznek.

a Sejtszámlálás fontossága

végezzen életképes sejtszámot, amikor újraéleszti és betakarítja a sejttenyészeteket. A sejtek tenyésztésben történő létrehozásának elmulasztásának egyik leggyakoribb oka az, hogy az újraélesztés idején helytelen életképes sejtvetési sűrűséget alkalmaznak, azaz a sejtek túl alacsony vagy túl magas vetését. Ez elkerülhető az életképes sejtszám elvégzésével és az ajánlott vetési sűrűség betartásával.

az adott cellavonalhoz, amellyel dolgozik, olvassa el a weboldalunk ‘leírás’ fülén megadott információkat. Ez az információ megtalálható a Cell Line adatlapon is, amelyet nyomtatott formában nyújtunk Önnek a cell line szállítással együtt. A vetés sűrűségét a szubkultúra rutininformációi mutatják. Amikor a sejteket azonnal újraélesztik, használja a megadott vetési sűrűségtartomány közepétől a felső végéig.

fagyasztott sejtek újraélesztése

fontos, hogy a fagyasztott ampullákat óvatosan kezelje; viseljen laboratóriumi kabátot, teljes védő maszkot és kesztyűt. Ritkán az ampullák felmelegedéskor felrobbanhatnak a csapdába esett maradék folyékony nitrogén tágulása miatt.

1. Mikrobiológiai biztonsági szekrényben tartson egy 70% – os alkohollal átitatott szövetet a fagyasztott ampulla kupakja körül. Forgassa el a kupakot negyed fordulattal, hogy felszabaduljon az esetlegesen beszorult folyékony nitrogén. Húzza meg újra a kupakot. Gyorsan vigye az ampullát egy 37oc-os vízfürdőbe, amíg csak egy vagy két kis jégkristály marad (1-2 perc). A sejtmembránok károsodásának minimalizálása érdekében fontos a gyors olvadás.
Megjegyzés: Ne merítse teljesen az ampullát, mert ez növelheti a szennyeződés kockázatát.

2. Törölje ampulla egy szövet átitatott 70% – os alkohol felnyitás előtt.

3. Pipettázza az ampulla teljes tartalmát egy steril csőbe (pl. 15 ml űrtartalom). Ezután lassan adjunk hozzá 5 ml előmelegített közeget, amelyet már kiegészítettünk a megfelelő alkotóelemekkel. Az életképes sejtsűrűséget tripánkék folttal, hemocitométerrel és fordított mikroszkóppal határozzuk meg a sejtek megszámlálásához, vagy ezzel egyenértékű sejtszámlálási módszerrel. Vigye át a sejtszuszpenzió megfelelő térfogatát a sejtvonal adatbevitelénél ajánlott sejtvetési sűrűség elérése érdekében.

tapadó sejtvonalak esetén: állítsa be a táptalaj térfogatát, és szükség esetén a lombik méretét, hogy elérje a sejtvonal adatlapján ajánlott sejtvetési sűrűséget. A krioprotektáns eltávolítására szolgáló centrifugálás előtti lépés általában nem szükséges, mivel az első közegcsere eltávolítja a maradék krioprotektánst. Ha igen, akkor ez meg lesz adva az adatlapon. Ha a sejteket szubkultúra helyett azonnal fel kell használni (pl. sejtalapú vizsgálathoz), tanácsos lehet egy előcentrifugálási lépést végrehajtani a krioprotektáns eltávolítása érdekében.

szuszpenziós sejtvonalakhoz*: a krioprotektáns eltávolítására előcentrifugálási lépés ajánlott, pl. a sejteket 150 x g-os centrifugálással 5 percig pellet-eljük, majd a sejtpelletet friss közegben reszuszpendáljuk a megfelelő térfogat felhasználásával a megfelelő vetési sűrűség elérése érdekében.

1. Inkubáljuk a lombikokat az adatlapon javasolt hőmérsékleten és CO2 szinten. CO2-kel táplált inkubátor használata esetén a lombiknak légtelenített kupakkal kell rendelkeznie, hogy lehetővé tegye a gázcserét.

Hibridoma kultúrák fagyasztott

a hibridóma tenyészetek fagyasztásból történő visszanyerésekor nem szokatlan, hogy a növekedés kezdetben a vártnál lassabb, és megfigyelhető az életképesség csökkenése. Az aktívan szaporodó tenyészet létrehozása akár 2 hétig is eltarthat.

újraélesztéskor elengedhetetlen a centrifugálási lépés a krioprotektáns eltávolításához. Gyorsan felolvasztjuk a fagyasztott ampullát vízfürdőben 37 6CC hőmérsékleten 1-2 percig. Tegyük át a tartalmát egy centrifugacsőbe, és lassan adjunk hozzá 5-10 ml előmelegített tápközeget+. Távolítson el egy mintát a számláláshoz. Centrifugáljuk 100 x g-on 2-3 percig pellet sejtekhez és viszonylag nagy sűrűségű, 5-7 x 105 sejt/ml-es maghoz. Helyezze a tenyésztőlombikot laposra, és rendszeresen figyelje meg, amíg életképes proliferáló sejtek nem láthatók.

+gyakran a hibridoma kultúrák számára előnyös lehet, ha 20% – os FBS-vel kiegészített médiával reszuszpendálják a kultúra létrehozásának korai kritikus szakaszában, azonnal az újraélesztés után.

eljárás a sejtek fagyasztására

az ECACC elővigyázatosságból javasolja a sejtvonal(ok) állományának fagyasztását röviddel a kézhezvétel után (2-4 x 106 sejt/ml között).

a következő útmutató a sejtvonalak előkészítéséhez és krioprezerválásához áll rendelkezésre.

1. A sejtek betakarítása a növekedés log fázisában ugyanúgy, mint a rutin szubkultúrában. Tapadó sejtvonalak esetén a lehető legközelebb 80-90% – os összefolyást kell betakarítani.

2. A szokásos eljárás 90% szérum + 10% krioprotektáns alkalmazása minden sejtvonalra, hacsak az adatlap másként nem rendelkezik. Minden ampullához hagyjon 1 ml-t. A legtöbb sejtvonal lefagyasztható a megfelelő táptalajban, kiegészítve 20% szérummal és 10% krioprotektánssal. Ez általában DMSO, de bizonyos esetekben glicerin ajánlott. Ha a DMSO nem megfelelő, egy alternatíva kerül meghatározásra a Cellavonal adatlapján.

3. Pellet sejtek centrifugálással pl. 150 x g 5 percig. Reszuszpendáljuk a sejtpelleteket a megfelelő fagyasztóközegbe, hogy a végső sejtkoncentráció 2 – 4 x 106 sejt/ml között legyen, és minden ampullába 1 ml-t pipettázzunk.

4. Fagyasztja le a cellákat 1-3oC/perc közötti hűtési sebességgel programozható sebességvezérelt fagyasztóval vagy megfelelő alternatívával1. Amikor a hőmérséklet eléri a legalább-130oC értéket, vigye az ampullát egy gázfázisú folyékony nitrogén tároló edénybe.