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Coltura di successo delle cellule:

*Leggere le importanti informazioni tecniche che seguono prima di maneggiare le linee cellulari fornite da ECACC*. Queste informazioni sono disponibili anche in formato PDF dal nostro menu principale, sotto ‘Assistenza clienti’ (clicca qui).

Stoccaggio di celle congelate

Al ricevimento, le fiale congelate devono essere trasferite direttamente all’azoto liquido in fase gassosa senza indugio, a meno che non debbano essere utilizzate immediatamente. NON utilizzare un congelatore a -80°C come alternativa; ciò comporterà una perdita di vitalità.

Come gestire le celle congelate al ricevimento

Dopo aver ricevuto una spedizione di linee cellulari congelate fornite da ECACC, è importante che l’utente finale presti immediatamente attenzione alla spedizione. La consulenza tecnica che accompagna le linee cellulari deve essere consultata prima di rimuovere le fiale dal ghiaccio secco. La corretta manipolazione immediatamente dopo il ricevimento è fondamentale per stabilire con successo la linea cellulare nel laboratorio dell’utente finale.

Nel momento in cui viene ordinata una linea cellulare, gli utenti finali dovrebbero anche considerare le condizioni di coltura per la nuova linea cellulare e assicurarsi che il mezzo appropriato sia disponibile quando le cellule arrivano.

Importanza del conteggio delle cellule

Esegui un conteggio delle cellule vitali quando rianimi e raccogli le colture cellulari. Uno dei motivi più comuni per l’incapacità di stabilire le cellule in coltura è dovuto all’utilizzo di una densità di semina di cellule vitali non corretta al momento della rianimazione, ovvero la semina di cellule troppo basse o troppo alte. Questo può essere evitato eseguendo un conteggio delle cellule vitali e seguendo la densità di semina raccomandata.

Per la linea cellulare specifica con cui stai lavorando, leggi le informazioni fornite nella scheda “Descrizione” sulla pagina del nostro sito web. Tali informazioni possono anche essere trovate nella scheda tecnica della linea cellulare, che verrà fornita come copia cartacea con la spedizione della linea cellulare. La densità di semina è mostrata nelle informazioni di routine della sottocultura. Quando le cellule di semina immediatamente post rianimazione, utilizzare la metà alla fine superiore della gamma di densità di semina dato.

Rianimazione di cellule congelate

È importante maneggiare con cura le fiale congelate; indossare un cappotto da laboratorio,una maschera protettiva completa e guanti. In rare occasioni le fiale possono esplodere al riscaldamento a causa dell’espansione dell’azoto liquido residuo intrappolato.

1. In un armadietto di sicurezza microbiologica, tenere un tessuto imbevuto di alcool al 70% intorno al cappuccio della fiala congelata. Girare il tappo un quarto di giro per rilasciare qualsiasi azoto liquido residuo che può essere intrappolato. Serrare il tappo. Trasferire rapidamente l’ampolla in un bagno d’acqua a 37 ° C fino a quando rimangono solo uno o due piccoli cristalli di ghiaccio, se presenti (1-2 minuti). È importante scongelare rapidamente per ridurre al minimo eventuali danni alle membrane cellulari.
Nota: non immergere completamente la fiala in quanto ciò potrebbe aumentare il rischio di contaminazione.

2. Pulire la fiala con un tessuto imbevuto di alcool al 70% prima dell’apertura.

3. Pipettare l’intero contenuto della fiala in un tubo sterile (ad es. capacità di 15 ml). Quindi aggiungere lentamente 5 ml di terreno pre-riscaldato che è già stato integrato con i costituenti appropriati. Determinare la densità delle cellule vitali utilizzando la macchia blu di tripano, un emocitometro e un microscopio invertito per contare le cellule o il metodo di conteggio delle cellule equivalente. Trasferire il volume appropriato di sospensione cellulare per ottenere la densità di semina delle cellule raccomandata nell’immissione dei dati della linea cellulare.

Per linee cellulari aderenti: regolare il volume del mezzo e, se necessario, la dimensione del pallone, per ottenere la densità di semina delle cellule raccomandata nella scheda tecnica della linea cellulare. Una fase di pre-centrifugazione per rimuovere il crioprotettore non è normalmente necessaria in quanto la prima modifica del supporto rimuoverà il crioprotettore residuo. Se lo è, questo verrà specificato nella scheda tecnica. Se le cellule devono essere utilizzate immediatamente (ad esempio per un test basato su cellule), piuttosto che sottoculturate, può essere consigliabile eseguire una fase di pre-centrifugazione per rimuovere il crioprotettore.

Per le linee cellulari in sospensione*: si raccomanda una fase di pre-centrifugazione per rimuovere il crioprotettore. pellet le cellule mediante centrifugazione a 150 x g per 5 minuti e risospendere il pellet cella in mezzo fresco utilizzando il volume appropriato per ottenere la corretta densità di semina.

1. Incubare i flaconi alla temperatura e al livello di CO2 raccomandati nella scheda tecnica. Se si utilizza un incubatore alimentato a CO2, il pallone deve avere un tappo ventilato per consentire lo scambio gassoso.

Colture di ibridoma da congelati

Quando si recuperano colture di ibridoma da congelate, non è insolito che la crescita sia inizialmente più lenta del previsto e potrebbe esserci una diminuzione osservata della vitalità. La creazione di una cultura attivamente proliferante può richiedere fino a 2 settimane.

In rianimazione è essenziale una fase di centrifugazione per rimuovere il crioprotettore. Scongelare rapidamente l’ampolla congelata a bagnomaria a 37°C per 1-2 minuti. Trasferire il contenuto in una provetta da centrifuga e aggiungere lentamente 5-10 ml di terreno di crescita pre-riscaldato+. Rimuovere un campione per il conteggio. Centrifugare a 100 x g per 2-3 minuti a pellet cellule e seme ad una densità relativamente elevata di 5-7 x 105 cellule / ml. Posizionare la fiaschetta di coltura piatta e osservare regolarmente fino a quando non si vedono cellule proliferanti vitali.

+Spesso le colture di ibridoma possono trarre beneficio dall’essere risospese con supporti integrati con 20% FBS nella fase critica iniziale dello stabilimento di coltura immediatamente dopo la rianimazione.

Procedura per il congelamento delle cellule

ECACC consiglia di congelare uno stock della linea cellulare subito dopo il ricevimento(tra 2-4 x 106 celle / ml) come precauzione.

La seguente guida è offerta per la preparazione e la crioconservazione delle linee cellulari.

1. Raccogli le cellule nella fase di crescita del registro nello stesso modo utilizzato per la sottocultura di routine. Per le linee cellulari aderenti, raccogliere il più vicino possibile alla confluenza 80-90%.

2. La procedura standard consiste nell’utilizzare il 90% di siero + il 10% di crioprotettore per tutte le linee cellulari se non diversamente specificato nella scheda tecnica. Lasciare 1 ml per ogni fiala. La maggior parte delle linee cellulari può essere congelata nel mezzo di coltura appropriato integrato con siero 20% e crioprotettore 10%. Questo è di solito DMSO, ma in alcuni casi si raccomanda glicerolo. Se DMSO non è adatto, verrà specificata un’alternativa nella scheda tecnica della linea cellulare.

3. Celle a pellet mediante centrifugazione ad es. 150 x g per 5 minuti. Risospendere il pellet cellulare nel mezzo di congelamento appropriato per dare una concentrazione cellulare finale tra 2 – 4 x 106 cellule/ml e pipettare 1 ml in ogni fiala.

4. Congelare le celle a una velocità di raffreddamento compresa tra 1-3oC / min utilizzando un congelatore programmabile a velocità controllata o un’alternativa adatta1. Quando la temperatura raggiunge almeno-130oC, trasferire l’ampolla in un recipiente di stoccaggio di azoto liquido in fase gassosa.