アルファ-セッツァ-ナレッジベース
- CETSA®
- ターゲット/サンプルタイプ
- Cetsa®アッセイ条件
- アルファCETSA®イムノアッセイ
- CETSA®データ分析および解釈
免責事項:研究用のみ。 CETSA®はPelago Bioscience ABの登録商標です。 キットを使用するには、有効なCETSA®サブスクリプションが必要です。
CETSA®メソッド自体
Q:CETSA®とは何ですか？
: 細胞熱シフトアッセイは、生きている細胞内または破壊された細胞内での化合物の標的係合（TE）の定量を可能にする方法である。 CETSA®の試金の主義は混合物の結合の後で起こるターゲット蛋白質の熱変性のプロフィールの変更に基づいている。 ＣＥＴＳＡ（登録商標）アッセイは、細胞を試験化合物とインキュベートし、続いて化合物処理細胞を加熱し、次いで残りの可溶性標的タンパク質を測定することに
Q:サーマルシフトとは何ですか
A: 加熱すると、タンパク質は変性する温度（融点と呼ばれることもあります）に遭遇します。 この融解温度は、物理的性質であり、任意の所与の条件（ｐＨ、圧力、塩）に対して一定である。 タンパク質と相互作用する化合物は、融解温度（熱シフト）を変化させる。 蛋白質内のある特定の結合場所のために熱転位のサイズは異なった混合物の集中（線量応答）で測定することができそのようなカーブから得られるEC50値は混合物の類縁のランクの順序に直接相関する一連の混合物の潜在的能力のランクの順序を確立するのに使用することができる。 Ｉｎｖｉｔｒｏ熱シフトアッセイにはいくつかのバリエーションがあるが，重要な技術はＳｅｍｉｓｏｔｎｏｖらによって最初に記述された。 (1991). この方法では、融解して展開するタンパク質は、SYPRO orangeが結合することを可能にする疎水性表面を露出させる。 この染料の蛍光は水中で急冷されるので、これらの疎水性表面への結合はこれを逆転させ、タンパク質が完全に展開されると蛍光をピークにする。 このタイプの熱転位の試金は非常に浄化された蛋白質にだけ適用することができ、低い豊富種のためにこれは十分な量を発生させるために過剰発
Thermofluor-温度感受性色素システム(Sypro Orangeを使用)
示差走査蛍光測定(DSF)–代替色素ベースの方法
定量PCRシステム(Eg Roche Light cycler) : これらは、加熱イベントを提供するために使用され、蛍光変化を測定することができます
Nanotemper–サンプルを加熱し、蛍光を測定する専用の機器を製造する それは合わせられたPCRシステムよりよい性能を提供する。
Q:ターゲットのエンゲージメントを測定することが重要なのはなぜですか？
A:化合物が実際に所望の標的と相互作用するという確認がない場合、薬物開発者は間違った方向に移動する貴重な時間とリソースを失う可能性があ そのため、化合物の標的関与の確認は、長い間、創薬において不可欠であると考えられてきた。 このようなアッセイは、その標的に対する化合物の親和性を直接比較することを可能にし、そのため、リード生成および最適化のすべての段階でどの化合物を前進させるかを選択することが不可欠な尺度である。 標的関与は親和性に相関させることができるので、研究者は最も親和性の高い値を有する化合物を選択することを可能にする。 このように、創薬プロセスの各段階で正しい化合物の優先順位付けを確実にすることは非常に有用な手段です。
Q:CETSA®は他のサーマルシフトアッセイ技術とどのように違いますか？
A:CETSA®の他にも、ターゲットのエンゲージメントを評価するための多くの方法があります（表面プラズモン共鳴、蛍光偏光、熱シフトなど）。 しかし、これらの方法はすべて、精製されたタンパク質が利用可能であることに依存しており、in vitroでのみ適用することができ、誘導された親和性値は、生 タンパク質がその天然のパートナータンパク質の存在下で、その補因子および基質の生理学的濃度で、その天然の環境にある関連する細胞文脈で熱シフトアッセイを実行することができることは、より良い動物モデルおよび臨床試験に翻訳されるはるかに関連性の高いデータをもたらす。
細胞熱シフトアッセイは、標準的な熱シフトアッセイと同じ生物物理学的原理に基づく方法ですが(すなわち、特定のタンパク質が設定温度で変性すること)、展開の特定の温度を直接測定するのではなく、タンパク質上の化合物の存在が設定温度に加熱した後に存在する可溶性タンパク質の量に影響を与えるという事実に依存しています。 従って、CETSA®は本質的に特定の暖房のでき事の後で行なわれる総蛋白質の試金である。 異なる標的結合効力を有する化合物は、加熱イベントを生存するタンパク質の相対量を変化させる。 このアッセイは、実際の融解事象ではなく、この残留タンパク質を測定するため、細胞および溶解物（および一部のCETSA（登録商標）形式では固形組織）などのよ さらに、CETSA®は蛋白質を不安定にする（すなわち溶ける温度を減らす）混合物を識別できる、これは他の熱転位方法とより少なく簡単である。
: アルファCETSA®は他の細胞熱転位の試金の技術または他の細胞ターゲット約束の試金といかに異なるか。
A:上記のように、CETSA®は基本的に熱ショック後に行われる総タンパク質アッセイです。 アルファCETSA®は二重抗体の近さによって基づく検出システムを使用する。 他の方法はターゲット蛋白質の変更によって抗体によって基づかせているシステムの使用を避けます:
- Promega nanoluciferase thermal shift assay(NaLTSA):ターゲットタンパク質（組換え発現タンパク質）に融合したNanolucルシフェラーゼ; Nanolucの酵素の札が付いている蛋白質ターゲットが総計する場合、ルシフェラーゼシグナルは減ります。
- Promega NanoBRET Target Engagement Assay:ルシフェラーゼ融合タグと標識されたトレーサー化合物を組み合わせたもので、ルシフェラーゼに近接すると生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）につなが 同じポケットの混合の結合はトレーサーを転置し、BRET信号は減ります。 これは熱衝撃法ではありません。
- DiscoverX InCELL Pulse:酵素フラグメント相補性(EFC)技術に基づく : 標的タンパク質はβ-ガラクトシダーゼ（β-gal）の小さな酵素ドナー断片と融合している。 加えられたレポーター蛋白質は基質を加水分解し、化学発光シグナルを発生させる活動的な酵素を再構成するためにこの片に結合し蛋白質の存在量の 熱変性の後で、蛋白質は蛋白質ターゲットのパートナーへのより大きいルシフェラーゼの部品のアクセスを集め、限る。
これらの”組換えCETSA®”または”組換え標的エンゲージメント”システムとAlpha CETSA®の主な違いは、天然および未修飾細胞に適用できないことです。 これには多くの否定的な結果があります:
- 新規抗体ペアを開発するコストとその後のウェル当たりのコストは、単一の細胞株をトランスフェクトするよりも高いかもしれませんが、ディスカバリープログラムは様々なモデル細胞株でテストしたいと考えている可能性がありますが、各トランスフェクションには独自のコストがかかり、後続の細胞株をクローニングするにはさらに数週間かかります。
- タグ付きタンパク質を生成すると、常に細胞に生理学的影響があり、タグ付きタンパク質は（i）過剰発現する可能性があります（化学量論対間違った ていないか、または（ｉｉｉ）主要なパートナータンパク質と関連しておらず、および（ｉ ｖ）天然タンパク質とは異なる融解挙動を有し得る。 化合物の見かけの効果は、患者の組織におけるその実際の行動を反映していない可能性があることを意味する。 これらの問題は、任意の一時的なトランスフェクションシステムで拡大される可能性があります。
- ルシフェラーゼ阻害剤は、偽陽性のヒットをもたらす可能性があります。
- リード最適化の後期段階では、より複雑で生理学的により関連性の高い細胞モデル（一次、天然細胞株および組織）が必要とされる場合、タグ付きプロテ
Q:CETSA®アッセイはどのような情報を提供しますか？
A:CETSA®は、”標的存在時”の化合物のユニークな尺度を提供し、標的占有率と考えることができます。 この占有率は、標的に係合する化合物の能力および化合物が適切な位置に存在する能力（すなわち、標的に係合する化合物の能力）の両方に影響される。 それは右の細胞コンパートメントで右の容解性、透磁率、新陳代謝の安定性および利用可能性を有するか）。 非細胞ターゲットエンゲージアッセイは、多くの場合、精製組換え発現標的タンパク質を使用して、高度に人工的な環境でのタンパク質の挙動とのみ相関する親和性の尺度を提供します。
Q:CETSA®はSAR分析研究に使用できますか？
A:CETSA®が複合最適化に使用されている例はまだ公開されていません。 しかしながら、ＳＡＲ分析およびｈｉｔ確認に使用されるＣＥＴＳＡ（登録商標）の可能性および適用性は、Ｓｈａｗらによって明確に実証された。 ＣＥＴＳＡ（登録商標）アッセイからのデータを、一般的に使用される生化学的および細胞ベースのアッセイデータと比較することによって（Ｓｈａｗ ｅ ｔ ａ ｌ．，２ ０ ０ ２）、ＣＥＴＳＡ（登録商標）アッ 2018SLASディスカバリー1-12DOI:10.1177/2472555218813332). この出版物は、B-RafとPARP1の二つのタンパク質標的のスクリーニング、ヒット確認、およびSAR生成のためのCETSA®の付加価値を実証しています。
ターゲット/サンプルタイプ
Q:これまでにCETSA®で検証されたターゲットはいくつですか？
: CETSA®HT（ほとんどはAlpha CETSA®であり、HTRFを使用するものもある）では、核、ミトコンドリア、細胞質および原形質膜局在化を有する標的を含む30以上の標的が成功裏に検証されている。
CETSA®Classic(Western Blot based detection)では、これまでに100以上のターゲットが検証されています。
CETSA®M/Sは、6000から7000のターゲットの情報を一度に生成しています。
Q:すべての標的タンパク質をCETSA®で試験することはできますか？
R:CETSA®ではいくつかのターゲットが”盲目”です。 化合物の結合は、それらの熱安定性を変化させない。 これは、タンパク質が複数のドメインを有し、化合物が一つのドメインのみに結合している場合、およびこの単一ドメインの安定化がタンパク質全体の熱安定性に大域的に影響を与えていない場合に起こる可能性がある。 CETSA®の実験で適用される典型的な温度較差で溶けない少数の蛋白質がある。
pelagoは、質量分析読み出し（CETSA®MS）を持つプロジェクトからの熱安定性データを含む大規模なデータベースにアクセスでき、この情報は、PelagoがΑ Cetsa®アッセイを開発する前にタンパク質標的の”CETSA®bility”を評価する際に考慮される。 そのような情報を要求するためにPelagoに連絡してください。
Q:GpcrはCETSA®に適していますか？
A:Gpcrのいくつかの例がCETSA®で試験されています。 Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａからの最近の刊行物（Ｋａｗａｔｋａｒ ｅ ｔ ａ ｌ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌｏｇｙ２ ０ １ ９）において、ＣＥＴＳＡ（登録商標）Ｃｌａｓｓｉｃｓアッセイが、ＧＰＣＲタンパク質標的を含む一組の膜結合タンパク質のために確立された。 Gpcr上のCETSA®の潜在的な課題の一つは、検出のための抗体の利用可能性が限られている可能性があります。 さらに、GPRCsの一体的な膜局在は、予測不可能な溶融挙動につながる可能性があります。
Q:CETSA®ではどのような種類のサンプルを試験できますか？
: 不死化細胞株、初代細胞、iPS細胞、患者由来PBMCs、スフェロイド、培養細胞からの核画分、ex vivoで処理された組織、in vivo動物研究からの組織、細菌、酵母、ゼブラフィッシュおよび昆虫を含む多くの異なるタイプのマトリックスを用いたCETSA（登録商標）アッセイの例がある。
Q:サンプルは暖房のステップの後で凍らせることができますか。
A:これは可能ですが、凍結プロセスはいくつかのタンパク質を変性させる可能性があるため、ケースバイケースの検証が必要です。
Q:私の細胞はいくつかのタンパク質で培養プレートコーティングが必要です(例: コラーゲンかMatrigel）;特別な心配はサンプル準備を避けるために必要とされますか。
A:コーティングされたプレート上で培養された細胞には問題は発生していません。
CETSA®アッセイ条件
Q:典型的なAlpha CETSA®アッセイの最適化ポイントは何ですか？
A:ゼロから始める場合は、最初にイムノアッセイを開発し、最適化する必要があります。 それはCETSA®の試金で必要とされる井戸ごとの細胞数を減らすことを割り当てるので、非常に敏感なアルファ試金の開発の重要、価値がある投資である。 CETSA®アッセイは、検出する必要があるタンパク質の一部を破壊しているため、通常、CETSA®アッセイでは、他の細胞ベースのアッセイと比較して、より多くの細胞/ウェルが必要とされる。 進行方法と有用なヒントについては、アルファアッセイ開発のPerkinElmerガイドを参照し、toolbox(anti mouse Ig X anti rabbit Ig beads)アプローチを使用する場合は、CETSA®toolboxマニュアルを参照してください。
次に、CETSA®アッセイ最適化ポイントには次のものが含まれます:
- 細胞密度滴定
- 細胞溶解緩衝液の選択
- 試験化合物との細胞のインキュベーション時間
- 試験化合物との細胞のインキュベーションのための温度
- 溶融およびシフト曲線の確立
- 等温用量応答実験のための温度の選択
- ワークフローと自動化設定
q:異なるcetsa®細胞溶解バッファーが用意されている理由と、異なる細胞溶解バッファーを使用することの影響は何ですか?
: 溶解緩衝液は、アッセイのいくつかの態様に関して重要である。 その役割は多数である:抗体によって検出のためにターゲットを利用できるようにするために抗体の認識と干渉するかもしれないパートナー蛋白質から; イムノアッセイに適切な物理化学的条件（pH、塩のイオン強度と性質、洗剤の種類と濃度など）を提供すること、…異なるイムノアッセイには異なる最適条件があり、異なるタンパク質ターゲット、および異なる細胞タイプには最適なアッセイ性能のための異なる要件がある可能性があるため、5つの異なる細胞溶解バッファーを利用できるようにしています。 これらは、種々の細胞溶解条件を提供する。 しかしながら、これは、さらなるアッセイ性能を改善するために、追加の洗剤タイプのような特定の場合に、追加の成分を添加してもよいことを意味
Q:cetsa®細胞溶解バッファーにプロテアーゼ阻害剤はありますか？
A:CETSA®Cell Lysis buffers1、4および5には、その活性のためにそのような二価の陽イオンを必要とするプロテアーゼを阻害することが期待されるいくつかの二価の陽イオンキレート剤が含まれている(Matrix Metalloproteinasesなど)。 これに加えて、他のプロテアーゼ阻害剤は、Ｃｅｔｓａ（登録商標）細胞溶解緩衝液には含まれておらず、これは、一般に、Α ＣＥＴＳＡ（登録商標）アッセイの実施のために必要とされ ただし、特定の細胞タイプまたは組織サンプルの場合は、ロイペプチンなどの典型的なプロテイナーゼ阻害剤を追加することができます。
Q：典型的な融解温度は何ですか？
A:融解温度(Tm)は、標的タンパク質集団の半分が変性された温度として定義されます(すなわち、アルファシグナルの半分が失われたAlpha CETSA®で)。 ターゲットによって、溶ける温度は52°c.の平均溶ける温度の40°Cと60°Cの間に最も頻繁に、ある蛋白質は、膜準蛋白質のような、通常より安定して、より高い溶ける温度があることができます。 65°cの上の溶ける温度を持っている蛋白質のためのCETSA®の試金データは細胞が熱されるとき膜の透磁率および細胞の完全性が摂動されるという事
私たちの経験では、溶融温度は標的特異的であり、アッセイ行列と使用される溶解緩衝液に依存する。
Q:無傷の細胞と破壊された細胞を扱うとき、Tmは同じであることが期待されていますか？
A:必ずしも、細胞を破壊するときのように、タンパク質を安定化させるタンパク質-タンパク質相互作用が失われる可能性があり、無傷の細胞と比較して融解温度が変化する可能性があります。 例については、Alpha CETSA®MEK1アッセイデータを参照してください。
Q：化合物試験にはどのような加熱温度を選択する必要がありますか？
: 化合物を安定化するためには、最も感度の高いアッセイ（より低いEC50値）を与えることが期待されるので、最大のアッセイ窓で最低温度を選択するこ 化合物を不安定化させるためには、最大のアッセイ窓で最高温度を選択することが推奨される。 65℃を超える温度は、細胞の透過性に影響を与え、データの重要性を低下させる可能性があります。
Q:CETSA®Classic(Western Blot)とAlpha CETSA®では同じ融解温度を期待する必要がありますか？
A:必ずしもそうではありません: 検出方法が異なるため、見かけの溶融温度は両方の方法の間で変化する可能性があります。
Q：サンプルの加熱時間を厳密に制御することが重要ですか？
A:はい、これは加熱時間が長くなると線量-応答曲線が右シフトする可能性があるため、制御することが非常に重要です（滞留時間に関するコメントの下 標準的な加熱時間は3分です。
滞留時間が短い化合物（すなわち、高い解離速度定数koff; 滞留時間Ｔが１／ｋｏｆｆに等しい）は、長い滞留時間を有する化合物と比較して、それが加熱されるときに標的からより速く解離する。 そのため、EC50またはITDRF50の値は、加熱時間の増加とともに増加すると予想されます。 ＣＥＴＳＡ（登録商標）理論のさらなる説明については、Ｓｅａｓｈｏｒｅ−Ｌｕｄｌｏｗ Ｂ，Ａｃｃｅｌｓｓｏｎ Ｈ，Ａｌｍｑｖｉｓｔ Ｈ，Ｄａｈｌｇｒｅｎ Ｂ，Ｊｏｎｓｓｏｎ Ｍ，Ｌｕｎｄｂａｃｋ Ｔ．（２ ０ １ ８）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｉｎｔｅｒｐｒｅａｔａｔｉｏｎ ｏ ｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｒｕｇ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙを参照のこと。 生化学57：6715-6725。 https://dx.doi.org/10.1021/acs.biochem.8b01057. 理論的には、加熱時間を変化させることにより、標的における異なる化合物の滞留時間の検出が可能であり得るが、これについてはまだ公表されていない報告が行われている。
Q:マニュアルでは、氷上で冷却するか、ヒートショック後に3分間25℃で冷却するように指示しています。 この冷却ステップは重要であり、冷却時間を厳密に制御することが重要ですか？
A:サンプルを急速に冷却することは熱衝撃段階がよく制御されることを保障します。 温度が単独で冷却するように単に許可することは確かに異なった井戸の異なった冷却率を作り出し、システムに提供される熱衝撃の量に影響を与 冷却段階は暖房段階程に重大ではないが、すぐにそして一貫して行なわれるべきである。
Q:PerkinElmer”Biomarker”と”SureFire”(NON-CETSA®)キットを使用してCETSA®アッセイを行うことはできますか？
A:理論的には、CETSA®プロトコルでの使用には任意の総タンパク質アッセイが適している可能性がありますが、各システムを最適化して検証する必要が 但し、CETSA®方法は特許を取られ、許可はPelagoの生物科学から必要とされる。 さらに、指定されたターゲットキットの使用のみがPerkinElmerによってサポートされています。 ツールボックスキットの使用はPelago Bioscienceによってサポートされており、ライセンス保有者のみが利用できます。
Q:サンプルを加熱するために使用されるPCRプレートから直接アルファ信号を読み取ることは可能ですか？
: これは、ピペッティング工程の数、サンプル消費量および自動化の容易さの点で利点を提供するが、サンプル処理から検出までの完全なプロセスにPCRプレートを使用する可能性はまだ実証されていない。 PCRの版は頻繁に非常に適用範囲が広く、版上の不均一信号をもたらすか、またはそれらが版の読者によって扱われるようにする右の次元を持たない。 このようなPCRプレートでは、well-to-wellクロストークも問題になる可能性があります。
Q:熱の代わりに化学変性（尿素やグアニジンなどを使用）を使用することはできますか？
: 熱衝撃を伝えるために温度を使用する利点は、サンプル間で一定である可能性が高く、十分に制御された時間枠にわたって制限された高度に制御された方法で行われることである。 化学変性プロセスは精製されたタンパク質抽出物で働くかもしれないが、複雑な細胞環境では、細胞容積、緩衝能力、脂質含量などの変化はすべて、異な
変性（加熱時間）が重要であるため、化学変性を使用する場合、これを制御することは非常に困難である可能性があります。 さらに熱は細胞を中断しないで適用することができ実質の細胞文脈でテストすることを割り当てる。 これは、変性剤への標的アクセスを可能にするために細胞を破壊しなければならず、したがって細胞内濃度、タンパク質会合などを失うので、化学変性. 従って私達は化学変性によって熱衝撃を取り替えることを推薦しません。
アルファCETSA®イムノアッセイ
Q: CETSA®アッセイを開発する際には、モノクローナル抗体が必要ですか、ポリクローナル抗体も使用できますか？
A：もちろん抗体の品質に応じて、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の両方を使用することができます。 モノクローナル抗体は、抗体を用いた他の任意の検出方法と同様に、安定した試薬供給の点で利点を提示する。
Q:ポリクローナル抗体を使用する場合、次のロットはCETSA®アッセイで同じように機能しますか？
: 私たちの経験では、cetsa®アッセイでは、ポリクローナル抗体の次のロットが以前のロットと比較して異なる挙動を示す状況に直面したことはありません。 しかし、CETSA®アッセイは、ポリクローナル抗体の次のロットで再検証する必要があります。
Q:抗体選択のための他の推薦がありますか。
A:利用可能な場合、抗体は、Alpha CETSA®アッセイで機能する適切な抗体ペアを見つける機会を最大化するために、標的タンパク質の異なるエピトープをカバーするように選択する必要があります。
抗体ペアは、通常、より特異的な信号を提供するため、より急な曲線（より高い丘の傾き）およびより少ない背景をもたらすことが好ましい。 低い丘の傾きは、再折り畳まれたタンパク質を認識する抗体対の能力の徴候であり得る。
Q:Α CETSA®抗体は内因性標的タンパク質のみに対するものですか、または内因性標的タンパク質プラス結合小分子に対するものですか？
A:これまでに開発されたキットに基づいて、抗体はタンパク質標的に対してのみです。
: 標的タンパク質に対する結合した小分子と非結合した小分子の間で、検出抗体親和性が異なることを期待できますか？
A:エピトープ部位でのタンパク質の折り畳みに影響を与える小分子は、実際に抗体結合を変化させる危険性があります。 この現象は”エピターバンス”と呼ばれ、抗体ベースのCETSA®の制限である可能性があります。 この場合、抗体検出ステップの前にタンパク質が完全に変性されるので、エピターバンスは一般にCETSA(登録商標)Classic assay format(Western Blotting)では観察されない。
Q:Cetsa®toolboxキットではIgGのみを使用できますか？
: 実際、抗ウサギおよび抗マウスビーズ上の抗体はＩｇｇに特異的であり、他の抗体クラスを認識しない（すなわち、Ｉｇａ、Ｉｇｍなどは選択されるべきではない）。
Q:Cetsa®Classic(Western Blotting)と比較して、Alpha CETSA®を使用する利点はありますか？
A:Alpha CETSA®アッセイの感度とスループットと自動化の考慮事項のほかに、Cetsa®Classic法では膜タンパク質を分析することが困難である可能性があるため、alpha CETSA®は分離ステップを必要としないため、そのようなターゲットに対してより優れた性能を発揮する可能性がある。
CETSA®データ分析と解釈
Q:cetsa®ではどのような偽陽性ヒットが得られますか？
A:いくつかのタンパク質の熱安定性は、試験化合物に直接結合していないにもかかわらず、化合物処理後に影響を受ける可能性があります。 これらの間接的な効果は、例えばタンパク質のリン酸化、パートナータンパク質によるタンパク質動員、または細胞の酸化還元状態の一般的な変化の結 Cetsa®アッセイを無傷の細胞と破壊された細胞で並行して実行すると、細胞が破壊され、代謝プロセスが停止されたときにそのような間接的な効果が予想されないため、直接的および間接的な効果を区別することができる。
化合物アッセイは、化合物が比較的高濃度で検出ステップに存在するため、Alpha CETSA®で相互に遭遇する可能性があります。 これは誤解を招く結果を与えることができ、これらの混合物を識別するために反対スクリーンを行うことは重要です。
Q:目標の不安定化はどのように解釈できますか？
: 不安定化は、標的タンパク質を安定化させていたタンパク質複合体の化合物結合による破壊に起因する可能性がある。 我々の経験では、膜タンパク質は通常、より高い融解温度を有し、化合物結合によって安定化されるよりもむしろ不安定化される。 キナーゼの場合、それはATPの変位にも起因する可能性がある。 そのような場合、無傷の細胞（生理学的ATP濃度）および破壊された細胞（ATPの損失）に対して行われた場合のCETSA（登録商標）アッセイの結果を比較することは有 いくつかの標的（Erbb2Alpha CETSA®kit manualを参照）について、不可逆的阻害剤が標的を不安定化させ、可逆的阻害剤が標的を安定化させていることが観察された。
Q:エピターバンス効果を回避する方法はありますか？
A:0.01%SDSのような少量の洗剤を加えることは、epiturbance現象を防ぐかもしれません。 説明は、ＳＤＳが化合物の存在下でさえ抗体へのアクセスを提供しているということであり得る。 CETSA(登録商標)細胞溶解緩衝液の中には少量のSDSが含まれているため、他の溶解緩衝液よりもエピターバンスを避けることができます。 場合によっては、より多くのSDSを追加する必要がある可能性があることを除外することはできません。
このようなエピターバンス効果は、CETSA(登録商標)アッセイに限定されるものではなく、任意の免疫測定法においても遭遇することができることに留意すべきである。
Q:カウンタースクリーン/私のCETSA®ヒットが偽陽性であるかどうかを確認するにはどうすればよいですか？
A:CETSA®では、化合物が標的タンパク質（de）安定化自体に作用しているのか、検出方法に干渉しているのかを判断するための簡単な方法があります: （１）細胞への化合物の添加、次いでインキュベートして熱処理を行うこと、および（２）細胞を最初に加熱し、その後にのみ化合物を添加することとの間で比較 化合物の活性が試験１でのみ見出される場合、それは標的で真に活性である。 化合物の活性が1と2で見つかった場合、それは検出技術に何らかの形で干渉することを示しています（潜在的なα干渉のリストについては、PerkinElmer Protein-Protein interaction guideを参照してください）。
Q:CETSA®ではどのような偽陰性ヒットが得られますか？
: 化合物が細胞の状況で標的に到達していない場合、それは生化学的アッセイで陽性として現れ、CETSA®では依然として陰性である可能性がある。 これは偽陰性ではなく、化合物が実際の細胞条件下で標的にアクセスすることができないという事実を反映しているだけであり、これは方法の強
Q:CETSA®値は機能アッセイとどのように比較されますか/thermoshift振幅の意味はありますか？
: CETSA®データを分析する際には、タンパク質のリン酸化、イオン濃度、cAMPなどのシグナル伝達マーカー、高content有量スクリーニングにおける表現型分析など、典型的な機能的アッセイとは原理が全く異なるため、データをそれに応じて解釈する必要があることに留意する必要があります。
サーモシフトの振幅は、化合物の親和性の尺度ではありません。
EC50、またはITDRF50値は、特定のアッセイ条件（温度、加熱時間、…）に固有です。 これは、ＥＣ５ ０値が例えば刺激時間に特異的である機能的アッセイと異ならない。
Q:cetsa®アッセイで拮抗薬とアゴニストを区別することは可能ですか？
A:通常、これはCETSA(登録商標)アッセイから抽出された情報ではなく、Shaw et al. (2018)Scientific REPORTS|(2018)8:163|DOI:10.1038|s41598-017-18650-x. 開発したCETSA®アッセイではアゴニストのみがアンドロゲン受容体を安定化することができたが、アンタゴニストはCETSA®アッセイでは直接的な効果はなかったが、CETSA®アッセイではアゴニストの効果の競合者として検出することができたと報告されている。 従ってこの特定の場合CETSA®の試金は男性ホルモンの受容器のアゴニストと反対者の間で識別できました。 これは、ＣＥＴＳＡ（登録商標）アッセイが作動薬および拮抗薬の両方を直接検出する多数の例があるので、これが任意の標的に対して可能であることを意味
: CETSA®は化合物の毒性を検出するために使用できますか？
A:細胞に何らかの毒性作用を及ぼす化合物は、一部のタンパク質のレベルの変化（分解および/または転写効果を介して）および一部のタンパク質の熱安定性の変化（翻訳後修飾または細胞の酸化還元状態の一般的な変化を介して）につながることが期待される。 Pelagoは、cetsa®MSデータから、さまざまなタイプの毒性に関連する可能性のある”CETSA®指紋”を生成する可能性を模索しています。 これはまた、そのような毒性を避けるために薬物が当たってはならない標的の知識を生成する可能性がある。 特定の標的が毒性に関連しているように見える場合、Alpha CETSA®の使用は製薬業界にとって選択される方法になる可能性があります。
Q:ハウスキーピングタンパク質はCETSA®アッセイの正規化に使用できますか？
A:通常、cetsa®アッセイでは、アッセイの重要な出力はEC50値であるため、正規化は必要ありません。 しかしながら、いくつかの場合において、例えば、組織試料を用いて作業する場合、データポイントあたりに係合される材料の量は非常に著しく変化し得、 CETSA®の古典（西部のしみが付くこと）では、SOD1は80°Cの融点がそれにあらゆるターゲットのためのよく不変の参照をし、18kDaの分子量が西部のしみで検出 GAPDHは溶融温度（55°C）が低いため推奨されず、溶融温度が高いターゲットでは制御できません。
アルファCETSA®アッセイを正規化したい場合は、コフィリンを試すことができます（予備的なCETSA®データを含む総コフィリン用のAlphaLISA SureFire ultraキットがありますが、完全に検証されたキットはまだありません）
