クラミジア形質転換の選択マーカーとしてのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
Wangらによって構築されたシャトルベクター pGFP::SW2には、選択マーカーとしてβ-ラクタマーゼ遺伝子が含まれていた。 それはまた、ＧＦＰ遺伝子に融合されたＣＡＴ遺伝子を運ぶ。 我々は、pGFP::SW2プラスミドで形質転換された大腸菌は、クロラムフェニコール（最終濃度）を含む培地中で成長することができたことがわかった: 170μ g/ml）、CAT遺伝子はまた、クラミジア形質転換実験のための選択マーカーとして使用することができることを示唆している。 Wangらによって警告されたように。 Ｌｉ ｅ ｔ ａ ｌ．，ｎａｔｕｒｅ，２ ０ ０ ４． クラミジアの変換のためのこの抗生物質の有用性に影響を与える可能性があります。 Li et al.報告書では、クロラムフェニコールの最小毒性濃度は10μ g/mlであり、ATP産生の軽度の20％減少を引き起こした。 我々は、完全にプラスミドフリー Cにおける包接形成を阻害し、見かけの最低クロラムフェニコール濃度を決定しました。 Ｌ２Ｒと命名されたｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ Ｌ２株は、わずか0.05μ g/ml（データは示さず）であり、これは宿主細胞に毒性のある濃度をはるかに下回っていた。 したがって、我々は、この抗生物質は、宿主細胞を有意に強調することなく、猫発現形質転換体を選択するために使用することができると推論した。
我々は、pGFP::SW2でL2Rを形質転換し、形質転換細胞の半分をアンピシリンで、残りの半分をクロラムフェニコールで選択した。 抗生物質（2μ g/mlアンピシリンまたは0.1μ g/mlクロラムフェニコール）を形質転換後10時間で培養物に添加した。 継代2から開始して、それらの濃度をそれぞれ5および0.2μ g/mlに増加させ、接種時に添加した。 通路間の分割比は、通路1から通路4まで1:1のままであった。 感染の低多重度（細胞あたり-0.1包接形成単位）で決定されたクロラムフェニコールのMICは0.05μ g/mlであったにもかかわらず、未変換クラミジアのいくつかは0.1-0の存在下で包接を形成すると予想された。2μ g/mlの抗生物質は、形質転換に高いEB対細胞比を用いたため、抗生物質によるクラミジア増殖阻害の有効性は感染の多重度によって影響される。 上記の選択プロトコルでは、アンピシリンで選択された培養では、位相コントラスト顕微鏡下で、ほぼ100％の細胞は、最初の継代で異常なRBsとの包含を含 異常なRB含有介在物は、通路2で細胞の小さな割合でまだ存在していたが、ほとんどが通路3で明らかに正常な介在物に置き換えられました。 正常な介在物は約20％の細胞で発見され、異常な介在物はめったに通路4で観察されなかった。 通路5では、通路4から10％の収穫を接種した結果、封入物は80％の細胞で発見された;明らかに、これらの封入物のいずれも異常なRBsを含んでいなかった。
クロラムフェニコールはクラミジアに異常なRBsを形成させないため、介在物の大きさによって抗生物質に対する耐性を判断した。 通常よりも小さいサイズの介在物は、通路1でほぼすべての細胞で検出された。 いくつかの、しかし非常に小さな、介在物は、通路2で発見され、それらの介在物のほとんどは、通路3によって通常のサイズの介在物に置き換えられました。 正常サイズの介在物は、通路4で20％以上の細胞で発見されました。 継代5では、10％継代4収穫、およびクロラムフェニコール濃度の増加（0.2μ g/mlから0.5μ g/mlへ）を接種した後に誘導され、正常サイズの封入体はほぼ100％の細胞0000000に見出された。
選択剤に対する見かけの耐性に加えて、形質転換に成功するための追加マーカーとしてGFPの発現とグリコーゲン合成の回復を使用しました。 継代５から採取したＥＢＳを使用して、Ｇｆｐ発現およびグリコーゲン合成を決定する実験のために、１：１ ０ ０希釈率（細胞数の等価性）でＭｃｃｏｙ細胞を感染させた（図２）。 予想されるように、野生型プラスミドが豊富なC.trachomatis L2（434/bu）（図2A）も、非形質転換プラスミドl2R（図2B）もGFPを発現しなかった。 Cにおけるグリコーゲン合成という確立された知見と一致する。 trachomatisはそのプラスミドを必要とし、ヨウ素染色は、グリコーゲンが野生型L2（図2A）の介在物に蓄積されたが、L2R（図2B）の介在物には蓄積されなかったことを示した。 RB分裂を阻害する5μ g/mlのアンピシリンの存在下では、非形質転換L2R（図2C）はグリコーゲンを産生せずに巨大なRBsを含む介在物を形成したが、クロラムフェニコール（最終濃度：0.5μ g/ml）はL2R感染細胞における目に見える介在物の形成を完全に阻害した（図2D）。 Wang et al.によって発表されたデータと一致しています。 、pGFP::アンピシリンで選択されたSW2形質転換L2Rは、グリコーゲンでGFP陽性介在物を形成した（図2E）。 クロラムフェニコールで選択されたpGFP::SW2形質転換L2Rもグリコーゲンを含むGFP陽性介在物を形成した（図2F）。 予想通り、アンピシリン選択形質転換体はクロラムフェニコールの存在下で正常サイズのGFP陽性グリコーゲン含有介在物を形成することができた(図2G)。同様に、クロラムフェニコール選択形質転換体は、アンピシリンに対して完全に耐性を示し、GFPを発現し、グリコーゲンを産生した(図2H)。 これらの結果から，ｐｇｆｐにおけるＣＡＴ遺伝子が示唆された::SW2プラスミドはクラミジアで機能的であり、クロラムフェニコール耐性はクラミジア形質転換の選択マーカーとして使用することができる。
ＣのｐＧＦＰ：：ＳＷ２形質転換体の包含、ＧＦＰ発現およびグリコーゲン合成。 トラコマチスL2 形質転換されていないプラスミド豊富な株434/bu（A）、形質転換されていないプラスミドフリー株L2R（B-D）、およびアンピシリン（E、G）またはクロラムフェニコール（F、H） 染色されていないおよびヨウ素染色培養における介在物の画像は、相コントラスト顕微鏡または蛍光顕微鏡48時間接種後に取得した。 すべてのパネルでは、段階の対照およびGFPのイメージは重ね合わせ可能である。
次に、pGFPからβ-ラクタマーゼ遺伝子を除去した。::ＰＧＦＰ−ＣＡＴ：：ＳＷ２プラスミドを用いてＬ２Ｒを形質転換し、形質転換されたクラミジアを、上記と同じレジメンを用いてクロラムフェニコールで選択に供した。 クロラムフェニコール耐性介在物は、通路4の培養中に感染した細胞の約20％に出現した。 蛍光顕微鏡およびヨウ素染色は、通路5から採取したEBsに感染し、クロラムフェニコールの存在下で培養した細胞におけるGFP陽性およびグリコーゲン陽性包 しかし、pGFP-CAT::SW2プラスミドにおけるβ-ラクタマーゼの欠如の結果として、形質転換体は、アンピシリンの存在下で正常な介在物を形成することができ 不規則な介在物は依然としてGFPに対して陽性であったが、グリコーゲンをほとんど含まなかった（図3、下のパネル）。 継代5の後、pGFP-CAT::SW2形質転換体を、0.5μ g/mlクロラムフェニコールと共に、各継代について1:100分割比で、追加の4継代のために培養した。 継代９の全ての封入物は、プラスミドが豊富なクラミジアの封入物と同じ外観を有し、プラスミドを含まないＬ２Ｒの封入物とは異なり、全てがＧＦＰを発現することが見出された（データは示されていない）。 これらの結果は、pGFP::SW2プラスミドに類似したpGFP-CAT::SW2プラスミドにおけるCAT遺伝子が、C.trachomatis形質転換の選択マーカーとして機能することを証明している。
pGFP-CAT::SW2で形質転換されたL2Rにおける包含、GFP発現およびグリコーゲン合成。 クロラムフェニコール選択形質転換体に感染した細胞は、クロラムフェニコールまたはアンピシリンのいずれかに曝された。 染色されていないおよびヨウ素染色培養における介在物の画像は、相コントラスト顕微鏡または蛍光顕微鏡48時間接種後に取得した。 段階の対照およびGFPのイメージは重ね合わせることができます。
なお、Ｔａｍ ｅ ｔ ａ ｌ． これまでにCAT遺伝子を選択的マーカーとして形質転換系の開発を試みてきた。 その研究では，ＣＡＴ遺伝子を含むシャトルベクターをＣのＥｂｓに電気穿孔した。 ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ Ｅ（ｕｗ−５／Ｃ Ｘ株）およびＬ２（４ ３ ４／Ｂｕ株）。 形質転換クラミジアの初期培養ではCAT mRNAと酵素活性の両方が検出されたが、著者らは4継代のクロラムフェニコールで選択した後、安定な形質転換体を得ることができなかった。 電気穿孔化された両方の株が、形質転換に使用される組換えプラスミドと同じ複製起源を共有する天然プラスミドを含むことに注意することが重 Wangら以来。 プラスミドを含まないCであるL2Rからのみ安定なペニシリン耐性形質転換体を得ることができた。 ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ ｌ２変異体であるが、野生型プラスミドがいっぱいの４ ３ ４／Ｂｕではないが、他の点で同一の実験設定下では、遡及的に、Ｔａｍ ｅ ｔ ａ ｌ． 安定なクロラムフェニコール耐性クラミジアを導出できなかった。
