クロチアニジン種子処理でミツバチのコロニーとその病原体に負の影響が検出されなかった

Study design

2013年には、スウェーデン南部の16畑(8.9±5.4ha;mean±s.d.)が、春に播種された油糧種子菜種(アブラナ科)を対象としています。napus l.）は、地理的近接性（ただし、>4kmで区切られている）と土地利用（図。 1、上記参照）。 周囲の風景は、開花作物の不在のために検査された。 しかし、2013年には、近くに別の油糧種子菜の花畑が存在していたにもかかわらず、できるだけ多くの農場ペアを保持するために、二つの畑が研究に残っていた34。 各農場のペアでは、一方のフィールドは、無作為にクロチアニジンで処理された油糧種子菜種で播種されるように割り当てられ、他方のフィールドは、クロチアニジンで処理されていない種子で播種された（処理された：8;対照：8）。 同じペアの農場が2014年に使用されたが、処理が逆転した、すなわち、2013年に処理された畑を持つ場所は2014年に制御畑を持ち、その逆も同様である（処理：6、制御：4）。 輪作のため、2013年と2014年には各農場内の異なる畑が使用されました（図。 1、上記参照）。 図を作成するために。 1、世界の国境データベースから地図をダウンロードしました（ここでダウンロード可能：http://thematicmapping.org/downloads/world_borders.php）。

2014年の各農場の周辺景観変数に関する情報を補足表7に示す。 2014年には、焦点場の半分が半径2km以内に追加の春に播種された油糧種子（1-13ha）を持っていた。 焦点場のためのclothianidin扱われた種はElado、二つの有効成分の商標のブレンドで塗られました: クロチアニジン（400g l−1）およびβ-シフルスリン（+80g l−1）は、スウェーデンおよびヨーロッパの他の地域での油糧種子菜種における優勢な種子殺虫剤処理であったため、この研究のために選択された63。 クロチアニジンは植物に取り込まれ、昆虫からの保護のためにそのすべての部分に全身的に分配される64。 β-シフルスリンは全身性であるとは考えられておらず、この研究で収集されたサンプルでは残基は検出されなかった34。 クロチアニジン処理種子と対照種子の両方が2013年に殺菌剤thiramでコーティングされました。

参加農家は、研究中に他のネオニコチノイドを畑で使用しないように指示されたが、他の殺虫剤の葉面散布、主にプレナム（pymetrozine）、Avaunt/Steward（indoxacarb）およびMavrik（tau-fluvalinate、養蜂のバロアシドとしても使用されている）が害虫駆除に使用された（補足表8）。 しかし、ネオニコチノイド−チアクロプリドを含むスプレー製剤の商号であるビスカヤは、2013年に一つのコントロールフィールドに適用され、1週間後にMavrikスプレーが適用され、2014年には0.3L ha-1で処理された。 Thiaclopridにclothianidin65より蜂のためのかなり低い激しい毒性があり、thiaclopridの微量だけ2013年に花粉、蜜および蜂のサンプルおよび2014年にどれもで検出されませんでした。 Rundlöfらがいる間。34結果の変化は観察されなかったビスカヤが適用されたフィールドを分析から除外したとき、我々はいくつかの質的変化を検出した（補足表9）。 これらの変化は、2014年に検出されたチアクロプリド残基が高いことによるものである可能性があるが、ビスカヤに関連するのではなく、ビスカヤ/Mavrikと使用される代替殺虫剤スプレーの組み合わせ34との違いによるものであるか、統計的パワーの低下によるものである可能性がある。

ミツバチのコロニー

百十六ミツバチのコロニーは、2013年末にプロの養蜂家によって、主に密封されたひな（蜂付き）、二つの完全なハニカム（蜂付き）、空の櫛、ワックスファンデーション付きの櫛、二つの櫛から振盪された蜂および1歳（84の実験コロニー）または2歳のいずれかを含む単一のフルサイズのLangstroth蕁麻疹で調製された。（12の実験コロニープラス20予備コロニー）比較的小さく、同じサイズ（3418±123大人のミツバチを生成するために知られている降下の女王;平均±s.e.m。; n=96コロニー）来る冬を生き残るのに十分な強さになる可能性があるが、夏の間に彼らのスペースを超えて成長しない成長の余地が十分にあるコロニー。 六つの実験コロニーは、油糧種子菜の花の開花の開始時に16油糧種子菜の花フィールド（合計で96コロニー）のそれぞれにフィールドエッジに沿って14と28June2013の間に配置されました（補足図。 1). 女王の系統と年齢は農場のペアの間で一致したが、コロニーはランダムに分布していた。 コロニーは、満開の60haの有機的に管理された冬の油糧種子菜の花畑に保管され、16の実験畑に配置されました（補足図）。 1）実験前のコロニーの成長を確実にするために、農薬を含まない採餌にできるだけ基づいていました。

実験場での油糧種子菜の花の開花が中止されたとき、コロニーは2月31日の間に移動した（補足図。 1）越冬する共通の養蜂場に。 10月、コロニーは、フレームの上に内側のカバーの下に置かれた平らな家庭用スポンジに浸した20ml60％のギ酸からなる、Varroaダニに対するギ酸蒸気処理を与えられた。 コロニーには、コロニーあたり合計20kgの砂糖を55–60％v/vスクロース溶液の形で供給し、2013年の八月から九月の間に三回にわたって供給ボックスに提供した。 追加の光Varroa処理は、4月に30ml2.6％シュウ酸をフレームの間に60％ショ糖に振りかけることによって、蜂のクラスターに直接行われました。 2014年春、コロニーは有機的に管理された油糧種子菜の花畑に移され、10の春に播種された油糧種子菜の花畑に配置されました（補足図）。 1). コロニーは、2014年に2歳の卵を産む女王がいた場合（2014年に死亡したコロニー、再女王、または3歳の女王がいたコロニーを除く）、2014年の初めまでに群がっていなかった場合、研究の2014部分に含めることが検討された。 これらの制限は、実験の両方の年のためにコロニーがクロチアニジンに暴露/未暴露されるという要件に加えて、2014年には各フィールドに4つのコロニーのみを割り振ることができることを意味した。 2013年に処理されたフィールドによって配置されたコロニーは、複数年のクロチアニジン暴露の累積的な影響を評価するために、2014年に再び処理されたフィー それでも、2013年から2つのコントロールコロニーは、2014年にクロチアニジン処理されたフィールドのための不十分な予選露出コロニーのために、クロチアニジン処理されたフィールドによって配置されなければならなかった。 四つのコントロールフィールドには十分なコロニーが用意されていた。 コロニーの強さは、2013年に記載されているように均等化されましたが、各治療群内でのみでした。 2014年（平成26年）6月8日、一部のコロニーが大きくなりすぎて群れを作ろうとしたため、コロニーは縮小され、再び均等化された（補足図1）。 1). それぞれの減少したコロニーは、1つの完全な蜂蜜の櫛（蜂と）、主に密封されたひな（蜂と）を持つ3つの櫛、および2013年からの元の女王とワックスの基礎を持つ6つの櫛を含んでいた。 コロニーは16と25June2014の間に春の油糧種子菜の花畑に移動され、14と22July2014の間に共通の越冬場所に戻されました（補足図。 1).

残渣分析

クロチアニジンへの曝露を確認するために、ハイブ入り口で捕獲されたフィールドあたり24匹の成体ミツバチ、油糧種子菜種畑で採餌された5匹のミツバチから採取された花粉ペレット、油糧種子菜種畑で採餌された5匹の蜜蜂の胃から除去された蜜を、各サイトからクロチアニジン残渣について分析した。 花粉（>25ml）は、サイトごとに三つのコロニーに1日のためにインストールされ、植物種の起源を分析した花粉トラップを使用して収集されました。 試料を処理し、Ｒｕｎｄｌｏｆ ｅ ｔ ａ ｌ．34および両方の年のピークブルーム評価の間に収集された（補足図。 1)、スウェーデンで使用されているクロチアニジンおよび他の四つのネオニコチノイドの濃度(補足表2)は、タンデム質量分析(LC-MS/MS)と結合された液体クロマトグラフィーを用いて定量化され、光学顕微鏡および花粉参照ライブラリを用いて油糧種子レイプ型に同定された花粉である(検出および定量の限界については補足表2を参照)。 別のサイトでミツバチのネオニコチノイド暴露の変化のさらなる分析のために、我々はハイブの入り口からサイトごとに12ミツバチを収集しました。 このサンプリングは、2013年に三つのクロチアニジン処理されたサイトで行われました。 蜜は、収集されたミツバチの蜂蜜の胃から抽出された。 クロチアニジンの濃度は、その後、各蜂個体の蜜および蜂組織の両方において定量化された。 異なったマトリックスのためのサンプル処置、LC-MS/MS方法および質制御のより多くの細部は補足方法で与えられる。

コロニー開発、再クィーン化、蜂蜜生産

ミツバチのコロニー開発は、同じ訓練を受けた観察者と一人の助手によって評価されました。 女王の存在だけでなく、女王の細胞の存在も確立されました。 再クィーンの出来事が成体の蜂の大きな損失を伴っていた場合、それは群がっていたとみなされました。 成体の蜂の損失が観察されなかった場合、コロニーはsupersedureによって再queenedたとみなされました。 コロニー蜂蜜の生産と開発は、コロニーを計量し、Liebefeld法66を用いてコロニーの強度を評価することによって、成体ミツバチの総数とすべてのフレーム上のキャッ 成体ミツバチの数は、10フレームの両側にミツバチを数えることによって推定された。 キャップされたひなの細胞の数（ひなの量）は、使用されたフレームの片側の細胞の数である2700によって閉じたひなの被覆率の割合を乗算することによっ コロニーを曝露前および曝露後の評価（1gの精度で最大32kgの重量を量ることができるMettler Toledoベンチスケールを使用）中に秤量し、蜂蜜の生産を推定した。 完全な蜂蜜のフレームは、コロニーが成長し、群れを減らすことを可能にするために、油糧種子の菜の花の開花の間に空のフレームに置き換えられました。 蜂蜜生産の計算に含めるために、完全なフレームと空のフレームの両方を秤量した。 曝露後の評価の間に、養蜂家の蜂蜜の収穫をシミュレートするために、できるだけ多くの蜂蜜フレーム（覆われたひなで覆われた領域の最大10％）を除去した。 6-17June2013および9-11June2014に有機的に管理された冬に播種された油糧種子菜の花畑での曝露前評価が行われ、29July-9August2013および28-31July2014に共通の越冬養蜂場での曝露後評価が行われた（補足図）。 1). さらに、2014年には、成体ミツバチの総数とキャップされたひなの数を推定することによって、春のコロニー強度評価が行われました（補足図。 1). コロニー評価者とアシスタントは、フィールドの治療レジメンに関するデータ収集中に盲目にされました。

病原体および寄生虫サンプル収集および処理

約100匹の成体ミツバチのサンプルは、2013年と2014年の両方でクロチアニジン処理および対照実験油糧種子菜種分野での曝露前および曝露後の評価中に各コロニーから採取された（補足図。 1). ミツバチは各コロニーの外側の櫛から採取され、したがってハウスミツバチと飼料用ミツバチの混合物67で構成されていた。 実験室での作業が行われるまで、すべての蜂のサンプルを-20℃で保存しました。 V. 各コロニーのデストラクタ侵入率は、大人の蜂のサンプルを石鹸水で洗浄してmites68を除去し、カウントすることによって決定された。 コロニーあたり60匹の成体ミツバチ（個々のコロニー分析の場合）または養蜂場あたり（2013プールコロニー分析の場合、コロニーあたり10匹のミツバチ）の腹部を除去し、内メッシュ（BioReba）を備えたポリエチレンバッグに入れた。 腹を乳棒を使用して袋中で粉砕し、30mlのヌクレアーゼフリー（ミリQ）水（蜂あたり0.5ml）をサンプルと完全に混合して均質な懸濁液を作成した。 この懸濁液のいくつかの1mlのアリコートを除去し、DNAおよびRNA抽出のために、および将来の参照材料として直ちに-80℃で凍結した。

寄生虫、病原体、共生微生物および免疫遺伝子

収集された蜂のサンプルは、クロチアニジン処理された畑でのコロニーの配置がその有病率および 生物にはユビキタスな外部寄生虫Varroaデストラクタ、13のウイルスが含まれていました: ウイルス（ＢＱＣＶ）、慢性蜂麻痺ウイルス（ＣＢＰＶ）、変形翼ウイルス型−ａ（ＤＷＶ−Ａ）、変形翼ウイルス型−Ｂ（ＤＷＶ−Ｂ）、イスラエル急性麻痺ウイルス（ＩＡＰＶ）、カシミールビーウイルス（ＫＢＶ）、シナイ湖ウイルsbv）、遅い蜂のまひ状態のウイルス（sbpv）;二つの共通のミツバチのmicrosporidian腸寄生虫（nosema APISおよびnosema ceranae）および二つの共生の腸の細菌（gammaproteobacterium:gilliamella apicolaおよびBETAPROTEOBACTERIUM: Snodgrassella alvi）。 2013年のサンプルでは、ミツバチの発現が以前に農薬、病原体および/または寄生虫暴露19、44およびミツバチの（社会的）免疫にリンクされていた8つのミツバチ遺伝子（Amel/LRR、アピダエシン、csp33、Dorsal-1A、Eater-like、Nimc2、PGRP-S2およびSPH51）のmRNAレベルも養蜂場レベルで分析した45。

核酸抽出

dnaは、Nosema spores69からDNAを抽出するためのプロトコルを使用して、蜂ホモジネートからDNAを抽出しました。 合計500μ lの一次蜂ホモジネートを、13,000rpmでマイクロフージ中で5分間遠心分離した。 ペレットを液体窒素で繰り返し凍結融解し，粉砕するまで滅菌テフロンマイクロペストルで粉砕した。 粉砕したペレットを、４μ ｌのＲｎａｓｅ−Ａ（１ ０ｍｇ ｍｌ−１）を含有するＱｉａｇｅｎ植物組織Ｄｎｅａｓｙ ＡＰ１溶解緩衝液（４ ０ ０μ ｌ）に再懸濁し、インキュベートし、６ ５℃で１ ０分間振盪した後、１ ３ ０μ ｌのＰ３中和5)を加え、続いて氷上で5分間インキュベーションし、14,000rpmで5分間遠心分離して溶解破片を除去した。 ＤＮＡは、植物Ｄｎｅａｓｙプロトコルに従って、ｑｉａｇｅｎ自動Ｑｉａｃｕｂｅ抽出ロボットにより５ ０ ０μ ｌの上清から精製し、１ ０ ０μ ｌのヌクレアーゼフリー水にＤＮＡを溶出した。 RNAはQiacubeロボットによってqiagen植物RNeasyプロトコル（追加の均質化のためのQia-シュレッダーを含む70）を使用して100μ lの一次ミツバチのホモジネートから直接抽出され、RNAは50μ lのヌクレアーゼフリー水に溶出された。 サンプルをヌクレアーゼフリー水で均一な10ng μ l-1（DNAおよびLSV−1（RNA））または20ng μ l-1（他のすべてのRNAサンプル）に希釈し、−80℃で保存した。

RT-qPCRおよびqPCR

様々な微生物Rnaゲノムおよび免疫および内部参照遺伝子mrna標的を有する病原体の場合はqpcr）、またはDNAゲノムを有する生物の場合は定量的pcr（qpcr）によるものである。 アッセイの詳細は、補足表１ ０、補足表１ １および補足表１ ２に示される。 Ａｍｅｌ／ＬＲＲのための逆プライマーは、Ｄｉ Ｐｒｉｓｃｏらからわずかに再設計された。19元の順方向プライマーと逆方向プライマーの間の非常に高い相補性は、定量的なシグナルを支配するPCR人工物の高レベルをもたらしたため。 反応は、2μ l(DNA)または1.5μ l(RNA)鋳型、0.4μ m(DNA)または0を含む20μ l(DNA)または10μ l(RNA)反応容積中で、重複して実施した。順方向および逆方向プライマーの２μ Ｍ（ＲＮＡ）、ならびにＢｉｏ−Ｒａｄ Ｅｖａ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ混合物（ＤＮＡ）またはＢｉｏ−Ｒａｄ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ｉＴａｑ ＲＴ−ｑＰＣＲ混合物（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＲＮＡ））のいずれかである。 反応は、以下の増幅サイクリングプロファイルを使用して、Bio-Rad CFX connect thermocyclerの96ウェル光学qPCRプレート中でインキュベートした：相補的なDNA（cDNA）合成のために50℃で10分（RT-qPCRのみ）: 95℃で5分（逆転写酵素を不活性化し、Taqポリメラーゼを活性化するため）、その後、変性のために95℃で10秒、プライマーアニーリング、伸長およびデータ収集のために30秒の40サイクルが続く。 DNAの試金のために次の拡大周期のプロフィールは使用された:最初の変性のための98°cの2分は変性のための98°Cの5sの40周期に先行して、10s60°cのプライマーのアニーリング、延長およびデータ収集のため。 増幅サイクルに続いて、65℃から95℃までの0.5℃増分での蛍光を読み取ることによって増幅の特異性を決定するための溶融曲線分析が行われた。 各タイプのアッセイ（補足表10、補足表11および補足表12）について、定量的データ変換のために、10倍希釈シリーズの既知の濃度の正の制御を介して6桁の検量線を調製し、アンプリコンの参照溶融曲線プロファイルを確立し、反応性能統計を推定した。

データ変換と正規化

個々の反応の融解曲線を視覚的に評価し、真の標的cDNA/DNAアンプリコンとの融解温度プロファイルが異なる非特異的増幅を分離した。 非特異的増幅は、データセットから削除された。 すべてのアッセイを重複して実行し、これら二つの重複の平均値をさらなる計算に使用した。 両方の重複は、正の定量値を生成し、データセットに含まれるデータの融解曲線分析を通過する必要がありました。 全ての確認された増幅の生のＲＴ−ｑＰＣＲデータを、その後、アッセイのための対応する検量線を使用して、各標的ＲＮＡの推定コピー数に変換した。 これらのデータに、bee69あたりの各標的の推定コピーを計算するために、手順全体を通して様々な希釈係数を掛けた。 RNAは容易に分解されるため、RNAの品質における個々のサンプル間の違い（すなわち、分解）が結果に影響を与える可能性がある70。 これを補正するために、共通のミツバチ内部参照遺伝子（ＲＰ４ ９）のｍＲＮＡに対するＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを、すべての試料で実行した。 次に、目的のＲＮＡ標的のデータを、ＲＰ４ ９ｍＲＮＡの平均値に正規化し、したがって、ＲＴ−ｑＰＣＲ性能に関するＲＮＡ品質のサンプル特異的差異に関するデータを補正した７ ０。

統計解析

油糧種子菜の花型植物由来のミツバチ収集花粉の割合は、二項分布を仮定し、過剰分散を補正する一般化線形モデルを用いて処理（クロチアニジン種子処理/未処理）の間で比較した。 ミツバチによって収集された蜜および花粉およびミツバチ組織中のクロチアニジン濃度をＷｉｌｃｏｘｏｎ–Ｍａｎｎ–Ｈｈｉｔｎｅｙ試験を用いた処理の間で比較した。 フィールド間の個々のミツバチの蜂組織と蜜中のクロチアニジンの濃度を比較するために、我々は予測因子としてフィールドアイデンティティと、分散分析（ANOVA） さらに，個々のミツバチの組織中のクロチアニジン濃度と蜜胃content有量は，フィールド同一性と蜜中のクロチアニジン濃度を説明変数として，ミツバチ組織中のクロチアニジン濃度を応答変数として多重線形回帰を用いて関連づけた。

この研究は、一般的に、コロニー開発に関するデータだけでなく、寄生虫、病原体、腸内細菌の有病率と豊富さについて、コロニーレベルで二年連続して繰り返 年、2013年と2014年は、固定要因として種子処理、ブルーム、年とその相互作用で、一つの完全なモデルで一緒に分析されました。 クロチアニジン処理の効果は、この用語は、油糧種子菜の花ブルーム（複数可）上の処理間の変化の違いを反映しているように、ブルームと種子処理との間の 三元相互作用（ブルーム×種子処理×年）が有意であった場合（すなわち、変数がクロチアニジン処理に異なる応答をした場合）、データセットは年ごとに分割され、年は固定因子として削除された。 さらに、データが微生物叢の有病率と豊富さの両方について1年に10ドルのサンプルサイズで構成されている場合、データセットは1年間のみ分析され 群がったコロニー（コントロールフィールドで8、クロチアニジン処理フィールドで10、2013年にコントロールフィールドで1、2014年にクロチアニジン処理フィールドで2）は、群がったコロニーの開発に大きな影響を与えるため、分析から除外された。 また、2013年のフィールド配置前に輸送中に女王を失った単一のコロニー（処理されたフィールド）も除外されています。 分析から群がったコロニーを除くと、定性的にいくつかの結果が変化した（補足表13参照）。 有意水準の変化は、統計的検出力の低下、ランダムな確率、または生物学的影響によるものである可能性があります。

線形混合効果モデル（LMM）を使用して、クロチアニジン処理がコロニー発達に及ぼす影響を試験し、キャップされたひな細胞の数（ひなの量）および成体蜂の数とし 種子処理（クロチアニジンまたはコントロール）、ブルーム（油糧種子菜の花ブルームの前または後）、年（2013または2014）およびそれらの相互作用は固定因子であった。 農場の対の同一性、農場の同一性およびコロニーの同一性を変量因子として含めた。 農場対同一性を有するＬＭＭと農場同一性をランダム因子として用いた処理の間で蜂蜜生産を比較した。 一般化線形混合モデル（GLMMs）は、ランダム因子として農場のアイデンティティを持つコロニーの再queeningと死亡率にクロチアニジン処理の影響をテストするた

クロチアニジン処理が春のコロニー発達に及ぼす影響を、成体ミツバチの数とひなの量として測定し、それぞれLMMとGLMMを用いて、種子処理を固定因子とし、農場対同一性と農場同一性をランダム因子として試験した。 キャップされたひなの細胞の数については、負の二項誤差分布と対数リンク関数を使用しました。

ミクロバイオームとVarroaダニのデータは、それぞれGLMMs（二項誤差分布とロジットリンク関数を持つ）とLMMs（通常の誤差分布を持つ）を使用して、それらの二項（存在/不在）と定量的（存在量）特性の両方で分析された。 微生物またはVarroaダニ有病率のGLMMsは、有効サンプルサイズ（すなわち、存在/不在データの頻度の低い結果）がより多くのランダム因子の包含を可能にしなかった 有病率と豊富さの両方のデータについて、（有効な）サンプルサイズ>10を持つ生物と年のみが分析されました。 さらに、特定の微生物について少なくとも一度は陽性を試験しなかったコロニーは、存在量の分析から除外された。 彼らは一般的に指数関数的に分布しているように、蜂の病原体と細菌の存在量は、対数（log10）変換されました。 標的生物の存在量に関するｌｍｍｓは，ランダム因子として農場対同一性，農場同一性およびコロニー同一性を含んでいた。 100ミツバチとコロニー重量あたりのVarroaダニ数は、非正規分布残差を避けるために平方根変換されました。 信頼区間は、プロファイル尤度に基づいて計算した。 平方根変換されたデータの場合、推定値はグラフィカルなイラストのために元のスケールに逆変換されました。

免疫遺伝子転写産物は2013年および養蜂場レベルでのみ利用可能であったが、BACIの設計にも従った。 遺伝子発現に関するｌｍｍｓは，固定因子として種子処理とブルームを含み，ランダム因子として農場同一性を含んでいた。

統計データ分析は、クロチアニジン暴露および土地利用の検証に対処する分析を除いて、Rを用いて行われ、SAS9.4for Windows（SAS Institute Inc.）が用いられた。 ＬＭＭは、ｌｍｅ４パッケージのｌｍｅｒ関数を使用して適合され、Ｇｌｍｍは、Ｒにおいて、ＧＬＭＭＴＭＢパッケージのＧＬＭＭＴＭＢ関数を使用して適合された。ＧｌｍｍｓからのＰ値は、尤度比検定によって計算された。 Ｌｍｍからのｐ値は、ｃａｒパッケージのＡｎｏｖａ関数を使用して計算され、これにより、相互作用を含むモデルにはタイプＩＩＩ Ｆ検定を使用し、相互作用のないモデルには ネオニコチノイド残基に対するものを除くすべてのモデルにおいて，和からゼロへのコントラストを用いて固定因子の効果を推定した。 和からゼロへの対比は、主効果/相互作用の決定（すなわち、他の独立変数とは無関係の推定）を可能にし、因子の効果を大平均からの偏差（切片）として表 2つの水準を持つ因子の場合、各水準の総平均からの偏差の大きさは同じですが、方向は異なります。 要因（種子処理、開花、年）の影響を、壮大な平均からの第二レベル（clothianidin、after、2014）の逸脱として表します。 これは相互作用の場合でも同様であり、例えば種子処理×ブルーム相互作用は、クロチアニジン曝露コロニーが油糧種子菜の花のブルームに対する変化が両処理の平均変化とどの程度異なっていたかを示している。

パワー分析

私たちは、デザイン、複製、モデルの選択を考えると、潜在的に検出できる効果サイズを調査するために、成体ミツバチの数とキャップされたひな細胞の数と蜂蜜の生産のパワー分析を行いました。 SimrパッケージのpowerSim関数を使用して、効果サイズごとに1000モンテカルロシミュレーションにより、α=0.05の公称信頼水準で効果サイズの範囲について検出力 パワーは、成体ミツバチの数、キャップされたひな細胞の数または蜂蜜の生産の変化として表される効果サイズの範囲について計算された。 効果サイズを平均ミツバチ数、平均ひな細胞数、またはすべての対照コロニーの蜂蜜生産で除算することにより、それらのマトリックスの変化率として表 3). このパワー解析により、我々の効果サイズとRundlöfらによって提示された効果サイズとを比較することが可能になった。34. 完全なモデルを使用して、Rundlöfらによって提示された20％未満の効果サイズと比較して、5％未満の成虫ミツバチの数の効果サイズを80％の検出力で検出でき34. これは、EFSA32によって設定された効果サイズ<7%の要件よりもさらに低くなります。 種子処理、開花および年の有意な相互作用の結果として、キャップされたひな細胞の数のデータセットは、毎年別々に分析された。 したがって、ここでは、各年の電力分析を提示します。 80%に達した効果の大きさは、10%以下の2013年から11%以下の2014年にわずかに増加した（補足図。 3）、おそらく2014年に減少した複製に起因します。 また、両方の年のデータセットを用いて蜂蜜生産量（コロニーあたりの蜂蜜の量（kg単位））のパワー分析を行い、20％以下の効果サイズが80％のパワーで検出できることを示した（補足図）。 3).

報告概要

実験設計に関する詳細は、この記事にリンクされているNature Research Reporting Summaryを参照してください。