クロドロネート含有リポソームによるマクロファージの枯渇は、ラットおよびウサギにおけるバルーン損傷後の新内膜形成を減少させる

炎症性細胞は、損傷直後に募集される血管修復に大きな役割を果たす。アテローム切除組織における1,2マクロファージ浸潤および血液単球の活性化状態は、再狭窄の増加率と相関する。3,4再狭窄におけるマクロファージの影響は、おそらく再狭窄の発症に寄与する多数の成長因子、サイトカイン、および酵素を発現する能力によっ5したがって、我々は単球とマクロファージの全身不活性化は、新内膜形成の減衰につながる可能性があり、マクロファージが再狭窄の病因に極めて重要な役割を果たしていることを仮定しました。

クロドロネートを含むリポソームの全身注射でマクロファージの枯渇を達成することができます。6Clodronateはbisphosphonates(BPs)の家族、破骨細胞の有効な抑制剤である骨追求の代理店に属します。 他のBPsのように、クロドロネートに悪い細胞膜の透磁率があります。7リポソームは、細網内皮系の細胞、特にマクロファージによって容易に取り込まれる。 クロドロネートのリポソーム仲介された配達は有効なphagocytosis8の後で大食細胞を不活性にし、殺しますが、nonphagocytic細胞に有毒ではないです。6

方法

リポソーム

クロドロネート（Sifavitor）とローダミンRE（Avanti極性脂質）は、50μ mol/Lジステアロイル-ホスファチジルグリセロール（DSPG）（Avanti）、100μ mol/Lコレステロール（Sigma Chemicals）、および150μ mol/Lの1,2-ジステアロイル-ホスファチジルグリセロール（Dspg）（Avanti）、1,2-ジステアロイル-ホスファチジルグリセロール（Sigma Chemicals）で構成されるリポソームにカプセル化された。-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(Dspc)(Avanti)逆相蒸発技術による,他の場所に記載されています。.リポソームの平均サイズは、それぞれ190±18nm、24.5mmol/L、および20mmol/L、クロドロネートおよび脂質であった。

マクロファージ様の生の264細胞でLCの生物活性の検証を決定しました。 LCではなく、遊離クロドロネートが有意に用量依存的に生存細胞の数と増殖を減少させ、平滑筋細胞（SMCs）または内皮細胞（EC）生存率と500μ mol/Lまでの濃度で増殖（データ8,10

ウサギモデル

ニュージーランド白ウサギ（Harlan Laboratories,Jerusalem,Israel）体重2.5-3。重量5キログラムに使用されたガイドラインに基づく動物のヘブライ大学のエルサレム(イーストエルサレム国立衛生研究所（米国） 動物は、血管形成術の30日前に開始し、2％のコレステロールと6％のピーナッツ油のアテローム性食を与えられました。 高コレステロール血症が確認された（血漿コレステロール>1200mg/dL）。 動物をキシラジン（7mg/kg）およびケタミン（40mg/kg）によって麻酔した。 ヘパリン（200U/kg）、アトロピン（0.05mg）、およびニコチン酸ノルフロキサシン（70mg）が与えられた。 バルーン損傷は、3ミリメートル血管形成術バルーンカテーテル（Cordis、2×1分インフレーション8気圧）で左総頸動脈に行われました。 動物は、静脈内リポソームまたは遊離クロドロネート（15mg/kg）、空のリポソーム、または緩衝液にランダムに割り当てられた。 実験グループのタイプに盲目の研究者が実験を行った。 ペントタールによる安楽死の後、動脈を150mLの4％ホルムアルデヒド溶液（pH7。4)、形態分析のために処理され、Verhoeffのエラスチンの汚損、Mayerのヘマトキシリンおよびeosin、および変更されたMovatのpentachromeと汚される。

ラットモデル

雄Sabraラット（Harlan Laboratories）、体重350〜420gを使用した。 ラット頸動脈損傷モデルは、前述のようにして実施した。11,12リポソームクロドロネート（15mg/kg）は、日-1と+6に注入されました。 器官を１ ４日目に収穫し、上記のように処理した。

形態素解析

各スライドの八から10のセクションは、実験グループのタイプに盲目の研究者によってコンピュータ化された形態素解析（NIH画像）によっ Ｎｅｏｉｎｔｉｍａによる最大管腔狭窄を有する切片を前述のように分析した。図１ １に示すように、残留ルーメン、内部弾性層によって囲まれた面積（元のルーメン）、および外部弾性層によって囲まれた面積（総動脈面積）を直接測定した。 新内膜肥厚の程度は、新内膜の面積と元の内腔との比（％狭窄）として、および新内膜面積と培地の面積との比（N/M）として表された。 バルーン損傷セグメントの総動脈面積と隣接する非損傷参照セグメントの総動脈面積の比を比較することにより，リモデリングの程度，収縮性（陰性）および膨張性（陽性）およびリモデリング比（Ｒ ｒ）を推定した。

フローサイトメトリー

抗凝固血（200μ l）をマウス抗ヒトRPE共役抗CD14（DAKO）で30分間（4℃、暗所で）インキュベートした。 ＦＡＣＳ溶解溶液（１：２ ０希釈）を１ ５分間添加した。 残留細胞をFACS培地（PBS、1％BSA、0.02％アジ化ナトリウム）中で洗浄し（×1500RPM、5分間、4℃）、フローサイトメトリーのために1mLのFACS培地中に懸濁した。 単球は、それらの相対的な大きさ、側方散乱、および蛍光に従って同定された。

リポソームの分布

ウサギにローダミン標識リポソーム（0.4mg/kg）とLCまたは緩衝液を-1日目に注射し、+1日目および+6日目に安楽死させた。 血液単球を、Ｆｉｃｏｌｌ勾配（Ｓｉｇｍａ）および遠心分離（×１ ５ ０ ０ＲＰＭ、５分）を用いて分離した。 採取した組織を生理食塩水ですすぎ、切片をスライド上に取り付け、共焦点顕微鏡で観察した（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ４ １ ０）。

免疫組織化学

外植標本を短時間の生理食塩水灌流後に切除し、直ちにOCT compoundで凍結して凍結選別した（Ted Pella,Inc）。 スライドを脱脂し、内因性ペルオキシダーゼを遮断するためにメタノール中で1％H2O2とインキュベートし（10分）、次いで10％馬血清PBSと（20分）した。 ウサギＲＡＭ−１ １（ＤＡＫＯ）またはＰＣＮＡ（ＰＣ１ ０、ＤＡＫＯ）に対する一次抗体を３ ７℃で１時間適用した。 次いで、切片をＰＢＳで洗浄し、続いてビオチン化二次抗体（馬抗マウスＩｇｇ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）およびａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ複合体（ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ ｋｉｔ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）をそれぞれ３ ０分間洗浄した。 色の開発は、ペルオキシダーゼ基質（Sigma）の存在下で5分間露光3,3′-ジアミノベンジジン四塩酸塩（DABペルオキシダーゼ基質、Sigma Chemical Co）によって達成された。 スライドはギルNo.3ヘマトキシリン（Sigma）でわずかにカウンターステインされた。 陽性染色を顕微鏡（Olympus、BX40）下で2×/0.25 10×/0で評価した。25拡大およびデジタル化されたビデオフレーム。 マクロファージの有病率は、5-6高出力フィールドで陽性染色細胞によって占有される平均パーセンテージ面積として評価された。

IL-1β産生および転写

これらの研究には別々の動物群を使用した。 動脈および肝臓をコラゲナーゼ緩衝液中で均質化し、抽出したＩＬ−１βを市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＜１ ２ ４＞Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。＜1498＞＜3772＞逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT–PCR）解析のため、rna isolation kit（Life Technologies）を用いて頸動脈からRNAを抽出した。 ＲＮＡの品質，サイズ，および量を調べ，バンドの値をβ-アクチンｍｒｎａ発現に対して正規化した。13

マトリックスメタロプロテイナーゼ-2活性

コラゲナーゼ緩衝液中の動脈ホモジネートの上清をコラゲナーゼ活性について分析した。 試料をゼラチン含浸（１ｍｇ／ｍｌ）上で分離した。: ５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１ ０ ０（ＢＤ Ｈ）中で３ ０分間振とうし、コラゲナーゼ緩衝液（１ ６時間、３ ７℃）中でインキュベートし、メタノール／酢酸／Ｈ２Ｏ中（３ ０：１ ０：６ ０）で０． バンド強度は、コンピュータ化された濃度測定（分子動力学タイプ300A）によって決定された。

統計

データは平均±SDで表されます。 対照群と治療群間の組織学的所見を不対スチューデントｔテストにより比較した。 時間の経過とともに血液単球とサイトカインの比較は、2-way ANOVA分析で行われました。 差は、P<0.05で統計的に有意と呼ばれた。

結果

血管形成後過形成の予防

バルーン損傷後の対照動物では、SMCsの大量増殖および細胞外マトリックス形成が見られた（図1、aおよびb）。 溶液中の空のリポソーム、生理食塩水、または遊離クロドロネートによる処理の間に有意差は認められなかった（結果は対照としてプールされた）。 N/M比は1.4±0.44（図1e）であり、管腔狭窄は75±8％であった。 LC（15mg/kg、-1日目および+6日目）は、N/M比を0.66±0.2（図1、c、d、およびe）に減少させ、管腔狭窄を41±8％に減少させた。 軽度の膨張リモデリングは、両方のコントロールで発生した（RR=1。 22±0.24)およびLC処理動物(RR=1.29±0.25)。 内側領域、骨形態、および鉱物組成は、ＬＣ処理によって影響されなかった（データは示されていない）。 明らかな感染はなく、検出可能な全身性副作用は観察されなかった。

非高コレステロール血症動物モデル（泡細胞なし）におけるマクロファージ枯渇の効果を確認するために、ラット頸動脈損傷モデルを使用した。11マークされた新内膜はLC治療によって抑制され、内側および総動脈面積に有意な変化はなかった（表）。

作用機序

血液単球および組織マクロファージの減少

ベースライン単球レベルは白血球（WBC）の2.8±0.5％であった。 手術前、LC注射の24時間後、単球は総WBCの<0.2％に急激に減少した（図2、aおよびb）が、WBC数は変化しなかった。 手術の三日後、血液単球は、対照動物では3.5±0.4％、LC処理動物では0.7±0.7％まで軽度に増加し、6日後にベースラインレベルに戻った（図2c）。

肝臓および脾臓のマクロファージは、傷害の6日後にLC（RAM11染色）によって減少した（図3）。 肝臓における陽性染色領域は、それぞれ、対照およびLC処理ウサギにおいて21.5±4％から14.7±2.9％および脾臓において33.3±1.5％から11.4±3％に有意に減 同様に、マクロファージの動脈RAM-11染色の減少は、損傷の3日後および6日後のLC処理ウサギで観察された（図4）。

単球およびマクロファージの減少も蛍光リポソーム（Ｆ ｌ）の注入によって検出された。 蛍光シグナルの顕著な減少が、ＬＣ処理動物の血液単球（ならびに減少した数）および肝臓および脾臓において観察された（図５）。 ＦＬは損傷した動脈では検出されたが無傷の動脈では検出されなかった。 LCと共投与されたFLは、損傷した動脈壁の蛍光信号を有意に減少させた（図5）。

PCNA、IL-1β、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ-2

傷害後6日でPCNAについて陽性に染色された面積は、対照動物の5.6±2.6％からLC処理ウサギの1.7±1.3％に有意に減少した（図6、aおよびb）。 ＮＥＯＩＮＴＩＭＡはＳＭＣ増殖が最大であるこの初期の時点ではほとんど観察されなかった。

損傷後の動脈組織におけるIL-1βレベルの分析は、損傷後6日でピークに達し、30日後に基底レベルに戻るベル状のパターンを明らかにし（図7a）、LC処理動物 対照動物では、IL-1β mRNA転写は、損傷後1日目の弱い発現よりも3日目に強かったが、両方ともLC処理によって有意に減少した（図7b）。 肝臓中のＩＬ−１βレベルもまた、−１日目のＬＣの単回注射後に減少し、３ ０日目の基礎レベルに傾斜した（データは示さない）。

動脈マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP-2）活性は、6日（292±46）でピークにベル状のパターンを示し、14日（図7c）で基礎レベルに戻って、傷害後に増加した。 LCはMMP-2活性を有意に軽減し、6日目にはわずか52±17であった。

ディスカッション

本研究では、リポソーム封入クロドロネートの全身投与によるマクロファージの不活性化は、ラットと高コレステロール血症ウサギの両方でバルーン傷害後の管腔損失を阻害することを初めて示している。 これらの結果は、マクロファージが加速動脈障害の病因に極めて重要な役割を果たしているという我々の仮説を検証します。 管腔領域の観察された増加は主に新内膜過形成の減少によって達成された。 拡張リモデリングの軽度の増加も示されたが、管腔領域の差への寄与は最小限であった。

クロドロネートはbpsの家族、骨粗しょう症を含む骨関連の無秩序で臨床的に使用される薬剤に属します。 高度に親水性で負に帯電しているため、遊離BPsは細胞膜を横切ることがほとんどできません。7骨吸収破骨細胞（血液単球からのマクロファージとして由来する）によるBPの取り込みは、細胞が薬物被覆骨を巻き込むときに起こる。7遊離クロドロネートもLCもSMCまたはEC増殖または新内膜形成を阻害しなかった。 マクロファージにおけるクロドロネートの有効かつ選択的エンドサイトーシスは、リポソームにクロドロネートをカプセル化することによっ食作用の後の9,10,14、lysosomal行為はliposomeの脂肪質のbilayersを破壊し、自由なclodronateは不可逆機能損傷およびapoptosisを引き起こす細胞に解放されます。8,15

LC投与は、おそらくMCP-1発現に応答してマクロファージの移動によって媒介される傷害に対する初期段階の応答を中止した。16傷害前のLCの注射は、血液単球を急激に枯渇させ（図2）、肝臓、脾臓、および損傷した動脈壁におけるマクロファージの数および活性（図3、4、および5）。 損傷時に利用可能な単球の減少は、おそらくIL-10.17による血液単球の不活性化で見られる効果と同様に、内腔および/または外膜から損傷した血管への単球/マクロファージの移動を遮断する（図5）SMCの移動および増殖に対するこれらの細胞の影響を防止した。

IL-1βおよびMMP-2レベルは、LC治療後に損傷した動脈セグメントで減少した。 動脈損傷後に分泌される活性化マクロファージのこれらの主要産物は、新内膜増殖のプロセスに寄与する。18-20Smc増殖の減少は、IL-1βおよびMMP-2.21の減少にも寄与し得るが、LCはSMCsおよびECsに影響を及ぼさず、線維芽細胞に影響を及ぼさないため、9マクロファージはおそらくLCの主な標的である。 動脈に泡細胞がないラットモデルにおける内膜過形成の阻害は、さらに減少したSMC増殖と新内膜形成を駆動するメカニズムとしてマクロファージの全身枯渇をサポートしています。 一緒に取られて、この一過性の全身の免疫調節および炎症抑制の効果はSMCの移動および拡散および幹線再狭窄を減らしました。

私たちの発見は、様々なモダリティによるマクロファージ機能の変調後に観察された有益な効果と並行しています。 損傷後の減少した新内膜形成は、mac-122の遮断によってウサギおよびMac-1欠損マウスで達成された。23このように、最近の報告によれば、9,17,22,23炎症過程は、新内膜形成のカスケードにおいて極めて重要な役割を果たす。 大食細胞の枯渇はまた静脈の接木の増殖を減らします。24トリガー、影響を受けた血管、angioplastied動脈の基礎となるプラーク、狭窄組織の組成、およびプロセスの持続時間の面で異なる病理にもかかわらず、静脈グラフトモデ

含意と制限

遊離クロドロネートは細胞に浸透せず、全身循環における半減期が短い。6死んだマクロファージおよびリポソームから漏出するクロドロネートは、骨以外の組織に有意な程度まで蓄積しない。 リポソーム製剤の結果は、他のほとんどのリポソームおよび粒子状薬物送達系と同様に、細網内皮系にあったので、LC処理後の体細胞増殖または血清ミネラル さらに、15mg/kgの自由なクロドロネートの2つの注入は正常な骨に対する効果をもたらすべきではないです。25

マクロファージの不活性化は、免疫抑制および感染の危険性を伴う。 しかし、Mac-1欠損mice26とラットの研究のように、24は明白な感染は、一時的なマクロファージ枯渇と我々の研究で観察されませんでした。 この研究では、注射後6日で血液単球が完全に回復し、IL-1β濃度は基礎レベルに戻った。 他はマクロファージ機能の回復がLC誘発の枯渇の後の4から6日長期毒性作用を引き起こさないことを示しました。6,14全身LCを伴う肝臓および脾臓マクロファージの一過性、部分的枯渇の臨床的意義は、ヒト試験でさらに検討されるべきである。

動物における内膜過形成を阻害しようとする薬理学的試みの多数の報告は、ヒトにおける再狭窄のその後の阻害には翻訳されなかった。 現在の研究では、血管修復における炎症の役割とpostinjury内膜過形成の減少における自然免疫の調節の可能な値を解明するための調査ツールとしてLCを使 異なる損傷および異なる程度の炎症を有するラットおよび高コレステロール血症ウサギの二つの動物モデルで利益が観察されたことは、血管修復における単球およびマクロファージの主要な役割を支持し、ヒトにおける再狭窄の阻害の予測値を増加させる。

マクロファージが豊富な領域は、不安定狭心症および急性心筋梗塞の患者のアテローム性動脈硬化病変に流行しており、3およびマクロファージはおそらくアテローム性動脈硬化プラークの破裂および急性冠症候群の突然の発症を仲介する。27さらなる研究は、リポソームビスホスホネートによるマクロファージの枯渇は、急性冠症候群を含む他の炎症性媒介血管障害および心筋症を安定化するための戦略を与える可能性があるかどうかを調べるために保証されています。

結論として、LCの投与は、ラットおよび高コレステロール血症ウサギモデルにおけるバルーン損傷後の新内膜増殖を阻害した。 提案されたメカニズムは、単球/マクロファージ活性の全身選択的、一過性の変調である。 マクロファージは、新内膜組織では比較的貧弱であるが、新内膜増殖の過程において主要な役割を果たす。 したがって、損傷後1週間のマクロファージの早期調節および不活性化は、後の時点で血管形成術後の動脈狭窄を有意に減少させる。

脚注