コメットアッセイ(MIRCA)に関する報告のための最小情報:コメットアッセイの手順と結果を記述するための推奨事項

MIRCAのガイドラインは、コメットアッセイの結果の分析と報告を改善することを目的として、hCOMET COST Actionのメンバーによって作成されている(http://www.hcomet.eu/)。 著者らは、これらのアッセイの経験が最低8年のコメットアッセイの専門家です（著者の15人には、関連する経験が20年以上あります）。 私たちは、インターネットベースのアンケートを使用して、詳細を報告することの重要性に関する著者からの意見をサンプリングしました（表1;補足データ）。 情報の各部分は、”必須”、”望ましい”または”重要ではない”として著者によって等級付けされ、≥75％の合同のしきい値が分類に使用されました。 “必須情報”の回答の数が75％の合意の閾値に達しなかった場合、”必須情報”と”望ましい情報”の回答が組み合わされ、75％の著者が”必須”または”望ましい”のいずれかであることに同意した場合、情報の一部は”望ましい情報”に分類された。 表1には、各推奨事項の説明文を含めます。

コメットアッセイの各ステップに対する特定のMIRCA推奨

ステップ1A: 細胞の単離および単細胞懸濁液の調製

cometアッセイでは単細胞の懸濁液を使用するため、単細胞として得られない標本は、細胞外マトリックスまたは互いに結合するために機械的または酵素的に処理しなければならない。 機械的破壊による組織の均質化は、それ自体がDNA損傷を引き起こす可能性があるが、組織の酵素消化は、内因性DNA修復酵素の活性によるDNA病変の除去 均質化緩衝液の組成は、特にDNA完全性を維持するために必要な成分（例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸）24,25に関して、”望ましい”情報である。 組織の均質化を含む単細胞懸濁液の単離のための手順の説明は、記事で報告するための「望ましい」情報であると考えられる。

血液サンプルは、ヒトのバイオモニタリング研究でよく使用されています。 血液は細胞の不均一な集団を表すため、細胞集団に関する詳細な情報は出版物では「不可欠」である。 テキストは、標本が全血（赤血球を含む）、白血球、単核血球または細胞のサブセット（例えば、リンパ球）であるかどうかを正確に記述する必要があります。 また、実験を繰り返す人のための静脈穿刺の手順、抗凝固剤の種類、およびその後の細胞単離方法（すなわち、遠心分離および洗浄ステップ）に関する情報を 細胞や組織が凍結保存されている場合の保存条件、凍結方法（ドライアイスや液体窒素でのスナップ凍結、遅い凍結手順など）や解凍手順に関する情報は、これらのプロセスがDNA移行の基礎レベルに影響を与えることが示されているため、報告するための”不可欠な”情報と考えられている26。

ステップ1B: In vitro DNA repair assayのための基質細胞の調製

in vitro DNA repair assayのための基質細胞としては、任意の真核細胞型を使用することができ、細胞型および密度は報告す 基質細胞にDNA病変を誘導するために使用される遺伝毒性化合物の方法およびタイプおよびその後の細胞貯蔵条件を報告することが”必須”であり、、Ro19-8022プラスライトと扱われる細胞のformamidopyrimidine DNAのグリコシラーゼ敏感な場所の数）は”望ましい”情報だけであると考慮されます。

Step1C:Assay controls

この記事では、assay controlsはすべてのcomet assay実験に含まれるサンプルを指します。 アッセイ対照は、典型的には、ＤＮＡ鎖切断剤（例えば、ＤＮＡ鎖切断剤）に曝露された細胞の単一バッチからの凍結保存されたアリコート（例えば、ＤＮＡ鎖切断剤）であ または、特定のタイプのＤＮＡ病変を引き起こす処理（例えば、光増感剤Ｒｏ１ ９−８ ０ ２ ２プラス光、または臭素酸カリウム処理により、ＤＮＡ酸化を誘導する）である。 標準的なアルカリ彗星の試金および酵素変更された彗星の試金のための異なった試金制御がある。 酵素修飾アッセイに使用される化合物は、これらが酵素感受性部位のダイナミックレンジを減少させるので、DNA鎖切断を生成すべきではない。 生体モニタリング研究、ならびに横断的、介入的および臨床研究において、未露光の細胞をアッセイ対照として使用することができる。 標準および酵素修飾された彗星の試金の試金制御そして試金の変化（標準偏差）の損傷のレベルを報告することは”必要”である。

in vitro DNA repair assayは、アッセイ対照自体ではなく、修復活性の計算にも使用される内部実験対照を使用します。 これは、（i）反応緩衝液でインキュベートされた非暴露基質細胞からヌクレオイドにおけるDNA修復切開のレベルを報告するために、（ii）反応緩衝液でインキュベートされた暴露された細胞は、損傷剤（すなわち、”治療対照”）での治療に起因する非特異的なDNA鎖切断または塩基性部位のレベルを明らかにするために、（i）反応緩衝液でインキュベートされた非暴露基質細胞からヌクレオチドにおけるDNA修復切開のレベルを報告するために、”不可欠な”情報である。; (iii)試料からのタンパク質抽出物とインキュベートされた非暴露基質細胞、非特異的切開または切断活性（すなわち、”特異性コントロール”）を確認するために、（iv）酵素修飾コメットアッセイのアッセイ対照（すなわち、”インキュベーション反応コントロール”）と同様に、病変特異的酵素とインキュベートされた暴露基質細胞。

ステップ1D：陰性および陽性対照

この記事では、陰性および陽性対照は、動物組織におけるin vivo cometアッセイに関するOECDガイドライン（TG489）に記載されて したがって、負および正の対照は、実験全体に関連する。 陽性対照とは、cometアッセイで検出されたDNA鎖切断または酵素感受性部位を産生する直接的または間接的に作用する遺伝毒性化合物を指す。 酵素修飾cometアッセイの場合、OECDが特定の動物組織におけるアルカリcometアッセイ（DNA鎖切断を誘導するための）の陽性対照としてリストしている化合物に対応する陽性対照のリストは存在しない。 さらに、健康な人は意図的に遺伝毒性物質にさらされることができないため、ヒトのバイオモニタリング研究には陽性対照は存在しません。 陽性対照は、遺伝毒性学における細胞培養実験において既に必須であると考えられており、事実上、cometアッセイを使用する記事における”必須”情報である。 しかし、動物実験では、実用的な目的のために、アッセイ対照に関する彗星データ（すなわち、 上記の「工程１Ｃ、アッセイ対照」と題されたセクションに記載された試料）で十分であるが、真の陰性および陽性対照からの結果は、「望ましい」情報のみであ

ステップ2：アガロースへの細胞の埋め込み

コメットアッセイは、もともとガラススライド上にアガロースの三層を使用して開発されました。 しかしながら、アガロースの最上層は必要ではなく、特定の手順では最下層を使用しない（例えば、ゲルボンドフィルムアッセイ）。 スライドの種類とサイズを報告することが”望ましい”（すなわち ゲルの端に近い細胞の割合がゲルのサイズが小さくなるにつれて増加し、ゲルの端にあるヌクレオイドのDNAは、ゲル22の中心に向かってヌクレオイドのそれとは異なって移動する可能性がある。 DNAの移動はゲルの密度に依存するので、アガロースの最終濃度（細胞がその中に埋め込まれている）は報告するために”不可欠”である。

ステップ3：細胞の溶解

cometアッセイでは、細胞を溶解するためのいくつかの手順があります。 溶解溶液の組成に関する情報は「必須」である。 特定のタイプの細胞には余分な酵素インキュベーション工程（例えば、プロテイナーゼKを用いた）が必要な場合があり、インキュベーションの詳細も”必須”情報とし いくつかの報告は、溶解の持続時間が特定のタイプのDNA病変の安定性に影響を与える可能性があることを示唆している28、29、30、したがって、溶解の持続

ステップ4A: 酵素修飾cometアッセイにおける修復酵素処理

溶解溶液は修復酵素の活性を阻害する可能性があるため、溶解工程と酵素処理の間に洗浄工程を行ったかどうか（すなわち、洗浄緩衝液の組成、洗浄回数および持続時間）を確立することが望ましい。 異なるメーカーの酵素は、核酸塩基病変に対する活性と特異性の両方が異なることが示されているため、修復酵素の源に関する情報を中継することは”不可欠”である16。 ほとんどのcomet研究では、酵素処理の最適条件を特定するために滴定曲線実験が行われています31;しかし、酵素滴定曲線の結果はほとんど報告されておらず、ここでは”望ましい”情報として分類されています(以前の研究を参照する代わりに行うことができます)が、処理の持続時間と温度を報告することは”不可欠”と考えています。 ゲルに適用される酵素の濃度は「必須」の情報であり、タンパク質濃度（mg/ml）も有用であるが、酵素単位（U/ml）の濃度を報告することが好ましい。 孵化の単位のタイプ（例えば、孵化器、スライドの堀または12ゲルシステム）および孵化のモードは報告するべき”好ましい”情報である。 インキュベーションが（i）酵素浴中で、またはスライド上のドロップとカバースリップで、（ii）標準的な2ゲルバージョン、12ゲルまたはマルチウェルシステムで、または（iii）インキュベーター内の加湿ボックスで、加熱プレート上または加熱スライド堀で行われたかどうかを記載する必要があります。

ステップ4B: In vitro DNA repair assayのための抽出物の調製およびインキュベーション

タンパク質抽出物の調製に使用される細胞または組織の質量を報告することは”望ましい”が、基質DNAに添加される細胞または組織抽出物の最終的なタンパク質濃度を報告することは”必須”である。 後者はDNA移行のバックグラウンドレベルに影響を与える可能性があるため、抽出バッファ（”望ましい”情報）の組成は、インキュベーションバッファ（”必須”情報）の組成よりも重要ではありません。 酵素修飾コメットアッセイの情報に沿って、滴定実験からの結果を報告するか、これらが行われた同じ研究室からの以前の研究を参照することが”望 ゲル埋め込まれた基質細胞に添加される抽出物の量は、”望ましい”情報である。 これらが修理切り傷の数に影響を与えるので潜伏期間の持続期間そして温度を報告することは”必要”である。 酵素修飾cometアッセイに関しては、インキュベーションのモードは、in vitro修復アッセイのために報告するための”望ましい”情報である。 インキュベーション反応制御として使用される酵素の同一性（基質細胞内のDNA病変の量を示す）および未露光基質細胞におけるDNA修復切開の背景レベルに使用される緩衝液の組成に関する情報は、DNA修復切開活性の信頼性を実証するための鍵であるため、”不可欠”である。

ステップ5:アルカリ処理

高アルカリpH溶液は、DNA鎖を一緒に保持する水素結合を破壊し、特定の核酸塩基病変をDNA鎖切断に変換する。 したがって、アルカリ処理の持続時間は、その後の電気泳動におけるDNA遊走のレベルに影響を及ぼし得る32,33,34。 従って処置のアルカリ解決、pH、温度および持続期間の構成に関する特定の情報は報告するべき”必要な”情報である。

ステップ6:電気泳動

DNA移行の最も重要な要因は、電気泳動の持続時間と電位（電気泳動タンクプラットフォーム全体の電圧降下）35です。 電気泳動緩衝液の組成，電気泳動の強さ（電気泳動タンクプラットフォーム上の電圧勾配（Ｖ／ｃｍ））および電気泳動の持続時間を報告することが必須である。 電気泳動の間の高温はDNAの移動に影響を与えるかもしれません36;従って、電気泳動の解決の温度についての情報は”必要”であり、これは温度を一定に保

ステップ7: 中和

このステップは、効率的な染色を確実にするために、スライドから過剰なアルカリ溶液を除去することを含む。 中和溶液の組成を記述することが「望ましい」。

ステップ8:染色と可視化

DNA結合色素はDNAとの結合親和性が異なるため、画像解析ソフトウェアの主要なcometアッセイ記述子の計算に異なる影響を与える可能性がある36,37,38。 色素の種類は「必須」情報であるのに対し、濃度は染色と可視化の間の時間と同様に「望ましい」情報である。 異なるタイプの顕微鏡ランプからの光の強度は異なる。 さらに、それはランプの年齢と彗星のスコアリング中に点灯した時間によって異なります。 しかし、光の強度を測定し、それに応じてDNA移行のレベルを補正するための標準的な手順はありません。 さらに、同じ彗星は、異なる顕微鏡倍率で異なるレベルのDNA移動を有するように見えるかもしれない。 したがって、スコアリングに使用される顕微鏡の倍率を報告することが「望ましい」。 彗星の代表的な画像を表示することが”望ましい”（例えば、彗星の代表的な画像を表示することが望ましい）。 DNA移行の報告されたレベルと一緒に、ほとんどまたはまったく移行、中程度および広範なDNA移行を伴う制御）。

ステップ9A:スコアリングとデータ分析

このステップでは、一次彗星アッセイ記述子の”必須”情報の報告が必要です（例：. 尾の長さ、尾モーメントまたは視覚スコアにおける％DNA）、サンプルごとに分析される彗星の数、およびDNA移動の全体的なレベルがどのように表現されるか（例、彗星スコアの中央値または平均値）。 各ゲル内の各彗星の個々の結果を報告することは”重要ではない”; それらは全体的なダメージレベルを計算するために組み合わされます。 異なる画像解析ソフトウェアパッケージは、主要な彗星アッセイ予測因子を計算するための異なる方法を有する可能性があることを排除することはできないので、使用されたソフトウェア（ソフトウェア名、製造業者、バージョン）を報告することは「不可欠」である。 すべての一次記述子は、それらが何を意味するのかを理解するために彗星アッセイの専門知識を持っている必要があるという制限を共有していますが、検量線を作成する場合（既知の周波数でブレークを誘導する電離放射線を使用して）、結果は変更されていないヌクレオチドまたは核酸塩基対と比較して相対的な病変頻度に変換することができます。このようなデータは明確であり、すべての研究者が理解できる情報を伝えています39。 電離放射線を用いて検量線を得、DNA移動レベルを変化していないヌクレオチドまたは核酸塩基対に対する病変頻度に変換する手順は、以前に報告されている40。 したがって、109の変更されていないヌクレオチドまたは106の核酸塩基対あたりの病変のレベルとして結果を報告することは”望ましい”である。

ステップ9B: In vitro DNA修復アッセイのための基質DNA中の酵素感受性部位または正味切開数の計算

DNA修復酵素とのインキュベーションは、DNA鎖切断の基礎レベルと酵素特 DNA損傷の基礎レベルと酵素特異的病変に起因するDNA移動は、遺伝毒性の異なるメカニズムに起因する可能性があるため、酵素処理後のDNA損傷の全レベ 代わりに、遺伝子毒性を酵素感受性部位として報告することが「必須」であり、酵素処理スライド内のDNA移動からDNA移動の基礎レベルが差し引かれてい

in vitro DNA repair assayは、すべての細胞または組織抽出サンプルと同じ基質細胞を使用するため、同じ実験（すなわち、アッセイの実行）において、各サンプルに対 複数の基板が存在する可能性があります（例： 塩基切除修復活性とヌクレオチド切除修復活性の両方を分析する場合）、したがって、DNA修復アッセイの種類ごとに別々のコントロールが必要である。 基質DNA中の修復抽出物による正味の切開を報告することは”不可欠”である。

ステップ9C：結果の統計分析

統計分析は”不可欠”です。 統計分析のタイプは、研究の設計に依存し、遺伝毒性学およびバイオモニタリングにおける統計的試験における一般的な仮定に従う41,42。