コラーゲン合成

骨コラーゲン合成の調節

げっ歯類カルバリアおよび細胞培養物の臓器培養におけるコラーゲン合成は、いくつかの異なるアッセイを用いて評価されている。 最も広く使用されているアッセイでは、カルバリアおよび細胞は、培養の終了前に数時間放射性標識プロリンとインキュベートされる。 高度に精製された細菌コラゲナーゼを用いて培養物の抽出物中で，コラゲナーゼ消化性蛋白質（ＣＤＰ標識）および非コラゲンプロテイン（ＮＣＰ標識）への放射性標識プロリンの取り込みを測定した。 パーセントのコラーゲンの統合はNONCOLLAGEN蛋白質に関連してコラーゲンのプロリンのより大きい豊富のために訂正した後CDPおよびNCPの価値から計算されます。 コラーゲンの生産はまたhydroxyprolineがcollagensに事実上独特であるので細胞または器官文化のhydroxyprolineの内容の測定によって定めることができます。 これらの方法は、異なるタイプの原線維コラーゲンを区別しない。 しかし、骨器官培養およびほとんどの骨芽細胞培養によって合成されるコラーゲンは、主にI型（>95％）であり、CDP標識値は通常I型コラーゲン合成を反映する。 必要に応じて、異なるコラーゲンタイプの産生は、細胞または器官培養物の放射性標識抽出物のイオン交換クロマトグラフィーおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動によって区別することができる。 ヒト細胞培養におけるI型コラーゲンの発現は、procollagen I C末端プロペプチドの分泌を測定することによっても評価されている。 最後に、ノーザンブロッティングにおける特定のcDNAプローブと逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応アッセイにおける対立遺伝子特異的プライマーは、骨モデル コラーゲンの統合およびmRNAのレベルに対する1,25(OH)2D3の効果の測定はこれらの異なった試金を使用して対等な結果を与えました。

1,25(OH)2D3は、21日の胎児ラットcalvariaeと新生児マウスcalvariaeの臓器培養におけるコラーゲン合成を阻害し、非コラーゲンタンパク質合成にほとんど、あるいは全く効果 1,25(OH)2D3ラットcalvariae(約50%)によるコラーゲン合成の最大阻害は10nMで発生します。 1,24R、25-（オハイオ州）3D3はまたコラーゲンの統合を禁じますが、1,25（オハイオ州）2D3よりより少なく有効です。 25-(OH)D3および24R、25(OH)2D3は100nMの下でコラーゲンの統合を変えません。 ビタミンDの代謝物質はコラーゲンの統合を禁じ、骨格Vdrのための代謝物質の類縁と相関する同じような相対的な効力の胎児のラットの長い骨の コラーゲン合成の1,25（OH）2D3阻害の細胞選択性を決定するために、胎児ラットcalvariaeの臓器培養は1,25（OH）2D3 22時間で処理し、その後、培養の最後の2時間 中心骨（成熟した骨芽細胞）は骨膜（成熟していない骨形成細胞および線維芽細胞）から遊離して解剖され、両方のコンパートメントは、トリチウム化プロリンの取 1,25(OH)2D3成熟した骨芽細胞のための1,25(OH)2D3効果の選択性を示す、中央の骨ではなく、骨膜におけるコラーゲン合成を減少させます。 新生児ラットは、新たに合成された骨マトリックスを放射性標識にトリチウム化プロリンの複数の注射を与えられたin vivoプロトコルを使用して、25ngの1,25(OH)2D3日1、3、および5日に与えられた脛骨とcalvariaeのオートラジオグラフの組織形態測定によって評価されるように骨マトリックス合成を阻害した。

1,25(OH)2D3はまた、ラット骨芽細胞骨肉腫ROS17/2.8細胞、一次ラットおよびマウス骨芽細胞、および不死化マウス骨芽細胞株（MMB-1）におけるコラーゲン産生 1,25(OH)2D3は、おそらく増殖細胞がより多くのVdrを含んでいたので、合流時よりも一次マウス骨芽細胞の対数相成長中のI型コラーゲン合成に大き 同様に、コラーゲン合成の１，２ ５（Ｏ Ｈ）２Ｄ３阻害は、合流したＭＭＢ−１細胞よりも高いＶＤＲレベルを有するｍｍｂ−１細胞の疎な培養においてより大きい。 コラーゲン合成の1,25（OH）2D3阻害は、スパースと合流ラット一次骨芽細胞で同等であるが、VDR数は細胞の成長中に変化しませんでした。 まとめると、これらのデータは、1,25（OH）2D3によるコラーゲン合成の阻害の程度は、主にVdrの細胞量によって決定されることを示しています。 1,25(OH)2D3は、ラット一次骨芽細胞の長期培養の増殖期中にコラーゲンmRNAレベルを阻害し、これらの培養による鉱化骨結節の形成を防止します。 これらの研究は、1,25（OH）2D3は、プライマリラット骨芽細胞培養における鉱化結節を形成するosteoprogenitorsの分化を阻害することを示しています。 しかし、1,25(OH)2D3による結節形成の阻害は、培養におけるI型コラーゲン合成の抑制に続発している可能性があります。

上記の阻害効果とは対照的に、1,25(OH)2D3は、不死化マウス骨芽細胞株MC3t3-E1において、コラーゲンおよび非コラーゲンタンパク質合成（約2倍）を一時的に刺激し、12と24時間の間でピークを迎える。 この研究では、培養によって合成されたコラーゲンの割合（全タンパク質合成に対するコラーゲン）は報告されていない; その結果、コラーゲン合成に対する1,25(OH)2D3効果の選択性を決定することはできなかった。 1,25(OH)2D3はまた、ヒト骨芽細胞骨肉腫細胞株MG-63およびヒト骨芽細胞の初代培養におけるコラーゲン発現を増加させる。 興味深いことに、MG63細胞における1,25（OH）2D3によるコラーゲン合成の増加は、vdrに直接相互作用し、レチノイドX受容体RXRとのヘテロ二量体化を防止す 但し、他の調査でMC3T3-E1細胞のパーセントのコラーゲンの統合を減らすために、1,25（OH）2D3は示されていました。 MC3T3E1とMG63アスコルビン酸とin vitro骨形成分化を受ける前骨芽細胞を表す;1,25(OH)2D3細胞の成長を阻害し、オステオカルシンの発現とアルカリホスファターゼ活性の両方の細胞株を増加させます。 MC3T3E1細胞は、ほとんどの不死化骨芽細胞株のように、有意な表現型の変化を表示します。 したがって、これらの矛盾した結果のいくつかは、実験に使用される細胞の変化に起因する可能性がある。 総称して、これらのデータは、1,25（OH）2D3が増加したI型コラーゲン発現の結果、骨芽細胞系統の初期の細胞における分化ホルモンとして作用することを 対照的に、1,25(OH)2D3は、成熟した骨芽細胞におけるI型コラーゲン発現を阻害する。