シストロン

PTXの生合成

5つのPTXサブユニットは、bvga/Sシステムによって発現が調節される単一のポリシストロニックオペロン内の連続したシストロンによってコードされている。 この2成分系を介して、毒素産生は、Mgso4またはニコチン酸の存在によって、または低温での成長中に調節することができる（レビューについては、参照）。 BvgSは、複数のキナーゼ活性を発現する内膜スパニングタンパク質である。 活性状態では、リン酸化を介してBvgAを活性化する。 細胞質転写調節因子であるリン酸化BvgAは、PTX遺伝子プロモーター領域のオペレーター部位に結合し、RNAポリメラーゼと相互作用して転写を活性化する。 BvgSシグナル伝達を妨害する変調器が同定されているが、シグナリングをトリガするために必要なBvgSリガンドは知られていない、BvgSがデフォルトで活性化されていることを示唆している。

転写後、個々のサブユニットは切断可能なシグナルペプチドを含むプリプロテインとして生成される。 内膜を介して（最も可能性の高いSec依存性経路を介して）転座すると、シグナルペプチドが除去される。 シグナルペプチドはリーダーペプチダーゼｉの基質の典型的な特徴を示すが，大腸菌リーダーペプチダーゼｉによるそれらの切断は非常に非効率的である。 大腸菌における百日咳lep遺伝子の同時発現は、実質的にPTXサブユニットの成熟を増加させる。 ペリプラズム空間内では、サブユニット内ジスルフィド結合が形成され、ホロトキシンは外膜を介して分泌する前に組み立てられる。 PTXには合計11個のサブユニットジスルフィド結合が含まれており、S1には一つ、s4とS5には二つ、s2とS3には三つが含まれている。 PTXに存在するすべてのシステインは、鎖内ジスルフィド結合に関与している。 S1のいずれかのシステインの変化は、Bオリゴマーと組み立てるから、このサブユニットを防ぐようにジスルフィド形成は、毒素の生物形成のために重要 適切なジスルフィド形成は、PTXの組み立てと分泌のために不可欠であることが判明したDsbA/DsbCシステムに依存しています。 しかし，三つのジスルフィドイソメラーゼの一つをコードするｄｓｂｃの変異は，毒素の集合体には明らかに影響を及ぼさないが，その分泌を損なうことから，ＤｓｂｃはＰＴＸ分泌に特異的に必要な成分に作用することを示唆している。

分泌はPTXの生物学的活性には必要ではないが、s1のみまたはBオリゴマーのみを産生するように設計された株は分泌に欠陥を示すため、ホロトキシンの完全なアセンブリは効率的な分泌のために重要である。 しかし、完全に機能的なＢオリゴマーは、Ｓ１の非存在下である程度まで分泌され得、Ｓ１の存在がＢオリゴマー分泌の絶対的要件ではないことを示す。 対照的に、S1単独では、s1の存在は確かに分泌効率を向上させることができるが、分泌決定基は、Bオリゴマー内に位置していることを示唆し、Bオリゴ S1遺伝子の特定の突然変異は、特にArg-57の周りの領域で、分泌に強い有害な効果を有し、S1のこの領域がPTXの分泌に役割を果たすことを示唆している。 Bオリゴマーの非存在下では、S1はおそらくそのC末端、疎水性ドメインを介して、外膜に最も可能性の高いパーティション。 これは、外膜を介して分泌される前のＢオリゴマーとの集合部位であり得る。

ホロトキシン集合体の分子段階はまだ理解されていない。 他のサブユニットを産生しない変異株の単一サブユニットは急速に分解される。 サブユニットの特定の組み合わせは、相互に安定化するように見えます。 例えば、s2サブユニットの安定性が大幅にホロトキシンの結晶構造によって明らかにされたS2–S4二量体形成と一致しているS4およびその逆の存在によって強化されています。 また、S2–S4二量体とS1サブユニットとのサブアセンブリが、S3およびS5の非存在下で形成される可能性もある。 S2-S4二量体はBで分泌されるために見つけられませんでした。 この二量体へのS1の付加は分泌のレベルで起因できますが、百日咳、一方。

百日咳菌の外膜を介したPTXの輸送は、PTLIを介したPtlAという9つの異なるタンパク質からなるIV型分泌系（T4SS）に依存する。 これらのタンパク質は、Agrobacterium tumefaciens、Bartonella tribocorum、Brucella suis、Helicobacter pylori、Legionella pneumophila、およびRickettsia prowasekiiを含む他の細菌からのT4Sssのものと相同である。 Ｐｔｌ遺伝子は、５つの構造的ＰＴＸ遺伝子の直接下流に位置し、ｐｔｘプロモーターの制御下にある。 しかし，ｐｔｌ蛋白質は，ｐｔｘサブユニットよりも低いレベルで産生されるようであり，ｐｈｏａ遺伝子と種々のｐｔｘおよびｐｔｌ遺伝子との翻訳融合によって証明される。 特定のPtlタンパク質の産生は、PTXの分泌における制限段階であると思われる。 指数関数的な成長の間に、細菌は三つの毒素分子/分/細菌細胞を分泌すると推定されており、サブユニットは、個々のサブユニットとして、両方のホロトキシンに組み立て、ペリプラズム空間内に蓄積することが見出されている。 サブユニットの蓄積は、特定のPtlタンパク質のレベルが細胞あたり30と1,000分子の間に増加しても、指数関数的な成長を通じて発生します。 したがって、毒素の産生または集合体ではなく分泌物が律速的であり得る。 興味深いことに、Ptlタンパク質の非存在下では、s2–S4二量体のようないくつかのサブユニットの組み合わせは、s1の存在下で、分泌することがで

Ptlタンパク質は内膜と外膜の両方にまたがる複合体を形成すると考えられており、個々のptl遺伝子の変異によって調査されたように、それらのすべ 野生型ｐｔｌ＋株にｔｒａｎｓで導入された変異のいくつかは、支配的な陰性分泌表現型をもたらし、少なくともＰｔｌｈに対するＰｔｌｃが多量体複合体の一部であることを確 PTXの分泌の主ステップは明らかにpeptidogycanの層を交差させる機能でありPtlEはpeptidogycanaseの活動を表現するために示されていました。 この276残基の長いタンパク質は、他のグリコヒドロラーゼとの活性部位の類似性が含まれており、このサイトでのアラニン置換は、組換えPtlEのペプチドグリカナーゼ活性を大幅に減少させることが示されている。 天然PtlEにおける同じ置換はまた、Pertussis B.によるPTXの分泌を廃止し、PtlEが毒素がペプチドグリカン層を通過するために必要なペプチドグリカナーゼであることを強く示唆している。

PTX分泌もエネルギーを必要とする可能性が最も高い。 Ｐｔｌ蛋白質の二つ，ＰｔｌｃとＰｔｌｈは推定アデノシン三りん酸（ＡＴＰ）結合部位を含み，毒素分泌に必要なエネルギーを提供する可能性がある。 両方のタンパク質は分泌に必要であることが示されており、両方の場合において、推定されるATP結合部位は機能に不可欠である。 両方について、変異対立遺伝子が野生型対立遺伝子と共発現される場合、優性陰性表現型が観察され、両方が多量体として機能するか、または分泌複合体の一部であることが示唆される。 PtlHは内膜と関連していることが示され、PtlHのATP結合部位の変異はその細胞位置に影響を与え、他のPtlタンパク質との相互作用を廃止する。 PtlCの正確な役割はまだ知られていません。 PtlDはまた、内膜タンパク質であり、5つの膜貫通ドメインを含む。 それは、そのＣ末端７ ２残基を介したＰｔｌｅ、Ｐｔｌｆ、およびＰｔｌｈの安定性のために必要とされる。 しかし、このＣ末端領域は、毒素分泌には十分ではない。 PtlFは外膜タンパク質（OMPs）の特徴を示すが、それはまた、内膜と関連している可能性があります。 非還元条件下では，ＰｔｌｆとＰｔｌｉはドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動中に複合体として移動し，Ｐｔｌｉはジスルフィド結合形成によってＰｔｌｆに結合することを示した。 ＰｔｌｉとＰｔｌｆの間の適切なジスルフィド結合形成は，ｄｓｂｃ遺伝子の変異が毒素アセンブリに影響を与えずに分泌に影響を与えるため，Ｄｓｂｃに依存すると考えられた。