シュードモナス-ビブリオにおける不飽和脂肪酸のシス-トランスイソメラーゼ: 生化学、分子生物学、および独特のストレス適応メカニズムの生理機能

概要

cisからtrans不飽和脂肪酸への異性化は、シュードモナス属およびビブリオ属に属するグラム陰性細菌がいくつかの形態の環境ストレスに適応するメカニズムである。 異性化の程度は，温度の上昇または膜毒性有機化合物の蓄積によって引き起こされる流動性効果と明らかに相関した。 トランス脂肪酸は、その位置のシフトなしに二重結合のそれぞれのシス配置の直接異性化によって生成される。 Ｃｉｓ不飽和脂肪酸のｔｒａｎｓへの変換は，細胞環境の化学的または物理的パラメータの変化に対する膜流動性の適応に明らかに関与している。 このような適応機構は、例えば高濃度の有毒物質によって成長が阻害されるときに膜流動性を調節する代替方法であると思われる。 Ｃｉｓ-ｔｒａｎｓイソメラーゼ（Ｃｔｉ）活性は構成的に存在し，ペリプラズマに位置し，ＡＴＰもＮＡＤ（Ｐ）Ｈやグルタチオンなどの他の補因子も必要とせず，脂質のde novo合成がない場合に作動する。 ATPからの独立性は、反応の負の自由エネルギーと一致する。 ｃｔｉは、酵素が細胞質膜を横切ってペリプラズム空間に輸送される間または直後に切断されるＮ末端疎水性シグナル配列を有するポリペプチドをコード シトクロムｃ型の機能的ヘム結合部位が予測Ｃｔｉポリペプチドで同定され，最近，異性化には二重結合の一時的な飽和が含まれないという直接的な証拠が得られた。

1はじめに—歴史

すべての生きている細胞では、環境の厳しい変化によるストレスが膜に影響を与えます。 その結果、膜の完全性の障害が起こり、したがって、バリアとして、酵素のマトリックスとして、およびエネルギー変換器としての機能が損なわれる。 対策が取られていない場合は、成長阻害またはさらには細胞死が発生する可能性があります。 細胞の主な適応応答は、実際の環境条件に関係なく、それらの膜の流動性を一定の値に保つことである。 このような膜流動性の安定化は、膜脂質の脂肪酸組成の変化によってもたらされ、膜活性物質や環境条件の変化に対する細菌の優勢な応答を構成 この基本的なメカニズムは、過去世紀の70年代後半にIngramの有名な研究で調査され、報告されました。 しかし、80年代後半まで、二重結合のシス配置は依然として細菌の脂肪酸で自然に起こる唯一のものであると考えられていました。 特にガスクロマトグラフィーにキャピラリーカラムを導入することによる分析切断技術の改善は、関連する脂肪酸メチルエステルの明確な分化を促進し、脂肪酸の新しいクラス、すなわちトランス構成不飽和脂肪酸は、いくつかの原核生物で発見された。 不飽和脂肪酸のトランス異性体の最初の報告は、わずか10年前にビブリオとシュードモナスのためでした。 トランス不飽和脂肪酸はｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｔｌａｎｔｉｃａの酢酸からｉｎｖｉｖｏで合成されたが，不飽和脂肪酸の既知の生合成経路に基づいて，そのような脂肪酸がどのように形成されるかについての説明はなかった。

cisのトランス不飽和脂肪酸への変換が、細菌が二つの種の膜流動性を変化させることを可能にする新しい適応機構を構成することが実証された 好酸性細菌Ｖｉｂｒｉｏ属に含まれる。 温度の上昇およびフェノールのような有毒な有機化合物への適応としてPseudomonas putida P8の応答してABE-1を緊張させて下さい。

私たちのミニレビューは、膜の流動性に影響を与える環境変化に細菌が適応することを可能にするかなり効率的で優雅なメカニズムに重点を置いて、被験者の状態に関する現在の知識と進歩を要約しています。

2不飽和脂肪酸のcis–transイソメラーゼ（Cti）の生理と機能

両方、Vibrio sp. 株ABE-1とP. putida P8は、細胞が高温または有毒なフェノール濃度に曝されると、通常は低い量のトランス不飽和脂肪酸の明確な増加が観察される。 Ｐ．ｐｕｔｉｄａの成長細胞は濃度依存的にフェノールに反応し，ｔｒａｎｓの増加とそれぞれのシス不飽和脂肪酸の同時減少は膜中に蓄積されたフェノールの量と相関する。 このような変換は、脂質生合成の欠如のために飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸との間の比および不飽和脂肪酸の総量を変更することができない非生 一貫して、反応はセルレニンによって脂肪酸生合成が阻害される細胞で起こる。 シス-トランス変換は、酵素様の速度論を有し、膜毒性剤の添加後30分で最終トランス対シス比に達する。 変換速度はクロラムフェニコールの影響を受けないので，この系は構成的に存在し，ｄｅｎｏｖｏ蛋白質生合成を必要としないと結論した。

オレイン酸(C18:1δ9cis)は、通常、P.putida P8によって合成されていないが、補足培養物中の膜脂質に組み込まれている。 毒性4-クロロフェノール濃度のオレイン酸を添加した後、そのトランス異性体、すなわちエライジン酸（C18：1δ9trans）に変換された。 このような知見から，ｔｒａｎｓ脂肪酸は二重結合の位置をずらすことなくｃｉｓをｔｒａｎｓ不飽和脂肪酸に直接異性化することによって合成されることが証明された。 Ｔｒａｎｓ不飽和脂肪酸の増加はそれぞれのｃｉｓ不飽和脂肪酸の減少を伴ったが，両方の総量は添加された毒素のいずれの濃度でも一定に保たれた。 このシステムは、ATPまたはNAD（P）Hまたはグルタチオンなどの他の補因子を必要としない。 ATPを提供するエネルギーからのその独立性はtransの反作用にシス形の否定的な自由エネルギーに従ってあります。

これらすべてのデータは、cis–trans異性化が細菌における新しい適応応答であり、温度の上昇や膜を乱す化合物の毒性濃度の上昇に対処することを可能にするという命題につながった。

変換の利点は、シス不飽和脂肪酸とトランス不飽和脂肪酸によって示される立体的な違いに由来します。 膜中の飽和脂肪酸の含有量が高いと、脂肪酸のアシル鎖が互いに最適な疎水性相互作用を形成することができ、最終的にはしっかりと充填された剛 一般に、飽和脂肪酸は、シス不飽和脂肪酸と比較した場合、はるかに高い転移温度または融点を有する。 16:0の飽和脂肪酸を含むリン脂質は、16:1のシス不飽和脂肪酸を含むものよりも約63℃高い転移温度を有する。 膜の相転移温度は飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の比の増加とともに増加した。 シス不飽和脂肪酸の二重結合は、アシル鎖に30°の角度を有する可動性のない屈曲を引き起こす。 したがって、膜中のアシル鎖の高度に秩序化されたパッケージが乱され、その結果、そのような膜の相転移温度が低下する。 したがって、曲がった立体構造（すなわちアシル鎖のキンク）を有するシス配置の不飽和脂肪酸は、比較的高い流動性を有する膜をもたらす。 顕著な対照では、trans配置の長い拡張立体構造はキンクを欠いており、飽和脂肪酸と同様に膜に挿入することができます。

細菌は、リン脂質脂肪酸の飽和度を増加させ、場合によっては不飽和脂肪酸のシスからトランス配置を変化させることにより、膜流動性の増加に適応 . ストレス応答としての飽和度の変化の一つの主要な欠点は、細胞増殖および脂肪酸生合成への厳密な依存性に起因する。 その結果、この機構を用いた細菌は、それらの膜流動性の生合成後の改変を行うことができない。 実際に、溶媒は、成長を完全に阻害する濃度までの飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の比率のシフトを引き起こすことが観察されている。 より高い、すなわち毒性の濃度の存在下では、細胞は反応することができず、したがってそのような状態に適応することができず、またはそれらは死 Cisからtrans不飽和脂肪酸への異性化は、これまでのところ、主要な代表者Pを含むPseudomonas属の株でのみ見出されていた。 putidaとp.aeruginosa、およびVibrioは、成長していない細胞でも機能するため、成長依存性の問題に対する解決策を表しています。 Ｃｉｓからｔｒａｎｓ不飽和二重結合への変化は，膜流動性に対する飽和脂肪酸への変換と同じ減少効果を持たないが，膜の剛性に実質的な影響を及ぼす。

主にフェノール化合物に基づく最初の観察の後、一連の有機溶媒がCtiを定性的および定量的に活性化する能力について試験した。 したがって、異性化の程度は、明らかに毒性および膜中の有機化合物の濃度と相関する。 溶媒の抗菌作用は、n-オクタノールと水（logPow）の混合物中の化合物の分配係数の対数で表される方法で、その疎水性と相関する。 LogPowが1と5の有機溶媒は、膜中で優先的に分配され、膜流動性が増加し、最終的に非特異的透過性につながるため、微生物にとって非常に毒性が高い。 化合物のＬＯＧＰ値とその毒性との間の関係を表１に示し、ここで、１ １の調査された化合物は、それらの増加するＬＯＧＰ値に従って列挙されている。 である。 ＬＯＧＰ値は、５ ０％の増殖阻害（ＥＣ５ ０）を引き起こす測定された推定濃度と、同時に、細菌のｔｒａｎｓ／ｃｉｓ（ＴＣ５ ０）比の最大半分の増加を引き起こす化合物の濃度とに対してプロ したがって、有機溶媒の毒性とCtiに対する活性化効果との間には直接的な関係があるが、これは化合物の化学構造とは完全に独立している。

1989年以来、一般的に毒性の高いトルエン、スチレン、またはキシレンの第二相を含む培地で成長したP.putida株が発見されたとき、いくつかの他のP.putida株が発見された。 putida株は同様の特性を有することが見出されており、多くの研究グループは、溶媒耐性の根底にあるメカニズムを明らかにしようとしている。 これらの細菌の大部分では、Ｃｔｉは溶媒耐性に関与している。

有機溶媒や温度上昇だけでなく、他のいくつかのストレスエリシターもCtiへの影響を試験しました。 要約すると、有機溶媒、浸透圧ストレス（NaClとショ糖によって引き起こされる）、重金属、熱ショック、膜活性抗生物質などの刺激に影響を与えるすべての膜は、系を活性化することが示された。 しかし、グリセロール、コールドショック、高pHによって引き起こされる浸透圧ストレスなどのストレス条件は、細胞K+取り込みの活性化剤ではないことが知られている-透過性の増加につながる膜損傷に対する最初の細胞反応—Ctiの活性化を引き起こさなかった。 このような知見は，ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ比が微生物の一般的なストレス応答機構の一部であることを明らかに示している。

3Ctiの生化学と分子生物学

異なるストレスに適応するための細菌におけるCtiの全体的な機能の生理学的記述に続いて、このユニークな適応応答システ

細胞区画におけるCti活性の試験に基づいて、細胞質膜は、その基質であるリン脂質脂肪酸も存在する酵素の位置と考えられた。 しかし，驚くべきことに，ＣｔｉはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｏｌｅｏｖｏｒａｎｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐのペリプラズム画分から精製された。 ひずみE-3。 酵素のクローニングは、異種大腸菌で発現するHisタグ付きP.putida P8タンパク質としての単離を可能にした。 Ctiは87kDaの中立蛋白質で、monocistronically転写され、constitutively表現されるために示されていました。 P.putida P8、P.putida DOT-T1EおよびPからのcti遺伝子の塩基配列。 oleovorans Gpo12は最終的にイソメラーゼがペリプラズム空間に酵素を標的とした後に切断されるN末端疎水性シグナル配列を有することを明らかにした。

cis不飽和脂肪酸を異性化することができないP.putida DOT-T1Eのctiノックアウト変異体が構築されています。 この変異体は、ショックを受けたときの生存率が0である。08%(vol/vol)トルエンは野生型株よりも低く、気相に供給されたトルエンで増殖させたときに親株よりも長い遅れ相も表示し、この株ではトルエン応答にCtiを明らかに関与させる結果となった。 しかし、シス-トランス異性化は、異性化を行うことができ、まだ溶媒感受性である株が知られているので、有機溶媒への唯一の必要な適応機構ではな

Holtwick et al. 彼らは予測Ctiポリペプチド中のヘム結合部位を見つけることができるように酵素がシトクロムc型タンパク質であるという証拠を提供した。 Pseudomonas sp.からの酵素の準備のため。 おそらくP.putida P8のcti遺伝子産物に相同である株E-3は、鉄（おそらくFe3+）が触媒反応において重要な役割を果たしていることが示唆された。 Ｃｉｓ-ｔｒａｎｓ異性化はカルジオリピンシンターゼとは無関係であり，カルジオリピン合成の増強により膜の長期適応を促進する酵素であった。

ごく最近、異性化反応の分子機構が解明されました。 二重重水素化オレイン酸を用いた補充実験では，Ｃｔｉの活性化後にオレイン酸が専ら二重重水素化エライジン酸に変換されることが示された。 異性化中の二重結合の一時的な飽和は、結合水和–脱水反応と同様に除外されなければならない。 このように、酵素機構が提案されている: 酵素-基質複合体が形成され、酵素中に存在するヘムドメインによって提供される求電子性鉄（おそらくFe3+）がcis二重結合から電子を除去し、sp2をsp3に移動させる。 その後、二重結合は、ｔｒａｎｓ配置への回転後に再構成される。 この提案された酵素機構のスキームを図１に示す。 2. このような機構は、P.putida P8のCtiにおけるヘム結合モチーフを破壊するために実施された部位特異的変異誘発実験に従う。 これらの突然変異は酵素の機能の損失で起因し、従って、酵素の触媒作用の中心のシトクロムcそしてヘムの存在に証拠を提供します。 酵素の反応は補因子Ｃｔｉ活性に依存しないので、基質として脂肪酸に作用する他の全ての既知のヘム含有酵素とは異なる。 しかし、正味の電子パワーが消費されないため、補因子は必要ありません。

その一意性のための別の指標は、類似性検索に由来する：Ctiは、予測されたアミノ酸配列が他のタンパク質と比較されたときに相同ペプチドと有意な相 しかし，驚くことではないが，現在知られているＣｔｉ蛋白質までの七つのアミノ酸配列の比較により，それらはすべてシトクロムｃ型のヘム含有ポリペプチドであることが同定された。 分類群に関係なく，シトクロムｃ型のヘム基は高度に保存されたモチーフとして存在し，すべての酵素において機能的ドメインとして存在し，特にＣｙｔｃ蛋白質のヘム結合部位はヘム-ビニル基と保存されたヘム結合モチーフＣＸＸＣＨに見られる二つのシステインの間に位置する。

これまでに調査した六つのシュードモナス株のすべてのCti配列にN末端シグナル配列が存在し、Ctiのペリプラズム局在を示す。 このような局在化は、P.oleovoransおよびP.putida DOT-T1Eについて既に証明されている。 しかし，ｓｅｃ依存性分泌に特徴的なシグナルペプチドはｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのＣｔｉ蛋白質には存在しない。 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株とＶｉｂｒｉｏ株からの蛋白質は三つの主要な枝からなる系統樹を形成し，酵素の共通の祖先を示唆している。 興味深いことに、v.choleraeからの予測されたポリペプチドは明らかに別のグループを構成するのではなく、p.aeruginosaとP.spからのタンパク質の多様なグループから発 E-3 非常に最近、アライメント研究は、ctiに精通している遺伝子が属MethylococcusとNitrosomonasに属する細菌のゲノムにも存在する可能性があることを明らかにした。 これらの生物はまたtransの不飽和脂肪酸を含むために知られています。 しかし、これらの細菌におけるCtiの存在についての直接的な生理学的または生化学的証拠は依然として欠落している。

4Ctiの調節

不飽和脂肪酸のCtiに関する主要な未解決の質問の一つは、この構成的に発現したペリプラズム酵素の活性がどのように調節されている 一つの可能性は、酵素の基質であるシス不飽和脂肪酸が膜リン脂質のペリプラズム相から切断される複雑なモデルであろう。 得られた遊離不飽和脂肪酸は、次いで、Ｃｔｉ作用によって異性化され、続いてリゾリン脂質に再付着し、トランス不飽和脂肪酸を含むリン脂質を生じる。 しかし、このような複雑なモデルは、少なくとも、修飾された脂肪酸の膜への再付着はエネルギーを必要とするので、休止細胞およびエネルギー源の完全な不在でのCti活性を確認するデータと一致していない。

しかし、酵素活性の調節は、単に酵素の活性中心に基質である二重結合に到達する能力を与えることによってもたらされる可能性があり、これは膜の流動性状態に依存する。 したがって、酵素の観察された位置特異性は、イソメラーゼの活性部位の膜内の特定の深さへの浸透を反映する。 Ctiの親水性構造とそのペリプラズム位置は、酵素がその標的にのみ到達することができるという推定を支持する。 膜が膜の崩壊を引き起こす環境条件によって”開かれた”ときに、膜の特定の深さに位置する不飽和脂肪酸の二重結合。 アシル鎖の順序の減少は膜の蛋白質の高められた浸透そして転座で起因できることが前に示されていました。 特定のホスホリパーゼとの類推により、アシル鎖の秩序が減少し、リン脂質ヘッド基の間隔が増加すると、Ctiは膜へのより深い浸透を示すと考えられる。 また、膜の充填を減少させることは、二重結合が膜表面により頻繁に接近し、最終的にはイソメラーゼとの相互作用を促進することを可能にすること 不飽和脂肪酸のｃｉｓからｔｒａｎｓへの異性化によってアシル鎖パッキングが増加するにつれて，蛋白質の浸透は相殺され，同時にｃｉｓからｔｒａｎｓへの異性化は阻害され，最終的には間接的なシグナル伝達機構または経路の関与なしにアシル鎖パッキングのタイトな調節をもたらす。 膜活性化合物の除去後、逆（transからcis）プロセスはエネルギー入力を必要とするので、規則的に低いtrans-cis比の回復は、すべてのcis脂肪酸の通常のde novo合成によ

Cti活性の調節のためのこのようなモデルは、cis–trans異性化の程度と環境ストレス因子の特定の濃度によって引き起こされる毒性との間の頻繁に報告されている関係も十分に説明している。 酵素によって触媒される反作用の別の結果として膜の流動率の減少は起こり、膜の流動率が正常なレベルに達したとき酵素がターゲットに達することができないので酵素は二重層から強制されます。

5おわりに

不飽和脂肪酸のシス–トランス異性化は完全には理解されていないが、シュードモナスおよびビブリオ細胞における一般的なストレス応答系の一部であることが明らかになった。 Ctiの一般的な機能のための別の指標はまた、他のストレス応答機構の誘導/活性化にその多くの場合、記載されている依存性である。

明らかに、それは新たな環境ストレスに対処するための膜の迅速な修正を可能にする緊急の適応メカニズムを構成しています。 このような迅速な応答は、分の面で作用し、即時反応は様々なストレス条件下での生存を保証するように、適応応答におけるそれらの役割を容易にす 溶剤耐性に関しては、急速（緊急）、中期および長期のメカニズムのカスケードの一種が明らかに環境ストレスに完全に適応するために協力しています。 Ctiは間違いなく、最終的には最終的に完全な適応を誘発するさらなる適応メカニズムの活性化と誘導を可能にする、最初のトルエンショックに耐えるために細胞を助ける主要な緊急のシステムの一つを表しています。

その簡単な機能と有効性のために、そして複雑な規制なしで働くので、そのようなシス-トランス異性化機構がグラム陰性菌に遍在的に存在しないことは驚くべきことである。 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属とＶｉｂｒｉｏ属の広範な発生から可能な説明が得られた。 非特異的な細菌の中で、シュードモナス属のメンバーは、土壌、人間の皮膚、海水からなる多数の生態系のすべてのニッチを征服した、適応性の高い微生物であることが知られている。 ビブリオ属のメンバーは、同様に土壌や深海を含む幅広い生態系を征服しました。 これらすべてのニッチを植民地化できるようにするには、環境条件の変化に非常に柔軟で適応可能である必要があります。 Ｃｔｉは、このような適応性を達成するための有効な機構を細胞に提供する。 これは、このような緊急の膜適応機構なしで幸せに暮らすことができる哺乳類の消化管における生活に関する専門的な大腸菌のような他のグラム

膜脂質は、微生物集団変化の分析のためのバイオマーカーとして有望なツールを提供します。 実際には、Guckert et al. 飢餓またはストレスの指標として、0.1より大きいtrans/cis比（ほとんどの環境試料について報告された正常指数）を使用することが示唆されている。 脂肪酸のプロフィールの測定が多くの実験室の定期的な方法になったのでこれは毒性作用の査定のための有望なアプローチのように聞こえる。 したがって、trans/cis指数の決定は、特に成長依存性試験を自然の生息地などで行うことができない場合に、天然試料の毒性状態を研究する上で貴重なオプ このような指標の主要な応用分野は，脂肪酸プロファイルが土壌微生物叢の生態学的調査のマーカーとして重要であるｉｎｓｉｔｕバイオレメディエーション過程における毒性と環境ストレスの測定であると思われる。 例えば、汚染された部位のバイオレメディエーションの間、トランス不飽和脂肪酸のレベルは、生分解プロセスを監視するための一般的なストレスおよ 有機化合物の一般的な毒性の評価ツールとしてのシス–トランス異性化の適用は、芳香族カルボニル化合物のために既に記載されている。 ストレスの指標としてのcisのトランス不飽和脂肪酸への異性化の使用を目指し、改善するさらなる研究は不可欠であり、最終的には環境モニタリングに適用可能な技術をもたらす可能性がある。