ペントースリン酸および芳香族経路から選択された遺伝子の構成発現は、PTSおよびpykFを欠いている大腸菌株の高グルコースバッチ培養におけるシキミ酸収率を増加させる
PB12aroK-aroL含有株の構築使用される合成オペロンの構成的発現 シキミ酸
の生産において、私たちの研究室からの未発表の証拠は、実験室で進化した株PB12における芳香族化合物の生産は、発酵の開始時にAAA経路への炭素フラックスのカナ化に関与する遺伝子の転写誘導が起こると、より高いレベルを達成することができることを示している。 この観察を考慮して、不活性なaroKおよびaroL遺伝子を有するPB12におけるSAの産生を最適化するための新しい戦略が開発されました(図1)。 この戦略には、単一のTrcプロモーターによって排他的に制御される合成オペロンの形で配置された六つの重要な遺伝子の強力かつ安定した発現のためのプラスミドの設計と構築が含まれていた。 代謝負荷を低減するために、ptrc99aからプロモーター、ポリリンカー、および転写ターミネーターを含む断片を組み込んだ後、プラスミド安定性を高めるためのpar遺伝子座を運ぶpbr327由来の単一のプラスミドをベクターとして利用した(図2)。
オペロンの最初の部分は、クローニング足場として使用されるプラスミドpBRINT-Ts Cmのポリリンカーへの最初の4つのコード配列(aroB、tktA、aroGfbr、およびaroE)のシーケンシャル増幅およびライゲーションによって構築された(方法を参照)。 その後、4遺伝子の構築がハイブリッドプラスミドptrc327parに2つの遺伝子(aroDとzwf)とともに移され、8kbのオペロンが12kbのプラスミドに含まれるようになった(図2)。 得られたプラスミドptrcaro6を、lacIq遺伝子を欠いたPB12aroK-aroL-株に形質転換し、目的の遺伝子の構成的発現を可能にした(表1)。PTRCARO6は、lacIq遺伝子を欠いたPB12aroK-aroL-株に形質転換した(表1)。 簡単にするために、生成されたPB1 2Arok−Arol−Laci−株をAR2と命名した。 PYKF遺伝子をAR2で不活性化した後、得られた株をAR3と命名した。 プラスミドptrcaro6を担持するAR2およびAR3から誘導された株をそれぞれAR26およびAR36と命名した(表1)。
Ptrcaro6の合成オペロンを構成するコード配列の空間的配置は、Trcプロモーターと転写ターミネーターに隣接しており、図2に示されています。 いくつかの証拠は、その低発現が芳香族化合物の生産における制限段階の一つであることを示しているので、aroBはオペロンの最初の遺伝子である。 プラスミドptrcaro6はまた、tktAおよびaroGfbr遺伝子を運び、その生成物はE4P合成およびPEPとの縮合に関与し、最初の芳香族化合物であるDAHPを形成する(図1)。 AROD遺伝子およびAROE遺伝子も、DHQのSAへの効率的な変換を促進するために含まれた。 さらに、このプラスミドはPPPの最初の酵素をコードするzwf遺伝子を運びます(図1)。 この遺伝子を含める決定は、以下の観察に基づいていた: 1)zwfの過剰発現は、実質的に炭素源のみとしてグルコース上で成長している株JM101におけるプラスミド代謝負荷による成長速度の損失を回復した;2)株PB12は、ppp(親株JM101で消費されたG6Pの5%と比較して22%)に向かってグルコース6-リン酸(G6P)ノードで特に低炭素フラックスパーティションを表示することが報告されている。 したがって、この遺伝子の過剰発現は、酵素shikimateデヒドロゲナーゼ(AroE)によって触媒量で必要なNADPHの可用性を増加させる必要があり、PB12から派生した株のヌクレオチドおよびアミノ酸生合成に向かってより多くのG6Pをリダイレクトすることによって潜在的な成長の影響を軽減することができる。 しかし、この報告書で提示された実験は、利用された遺伝子の特定の効果を解剖することを目的としたのではなく、オペロンとしてそれらのすべてを表現することの結果を特徴付けるように努めた。
すべての遺伝子の効率的な翻訳を促進するために、各コード配列は、翻訳開始部位の8bp上流に位置するコンセンサスShine-Dalgarno配列を導入した指定された 構築されたオペロンの塩基配列は、追加のファイル1に提示されています。
Aro6オペロンを発現する株におけるpykF不活性化による影響の評価
PYKF不活性化によるSAの産生に対する影響を評価するために、AR26(pykF+)およびAR36(pykF-)の産生株の性能を、Glc15g/LおよびYE5g/Lを含むシェイクフラスコを用いて比較した。 対照として、空のpTRC3 2 7PARプラスミド(Ar6オペロンなし)、Ar2EおよびAr3Eを含む同じ株もまた含まれた。
AROKおよびaroLの変異体について予想されるように、すべての場合にSAが蓄積されたにもかかわらず、ptrcaro6を含む株は空のプラスミドを有する株よりも高いSA濃度に達した(図3b)。 さらに、SA力価は、AR36ではAR26よりもほぼ二倍高かった(6.1g/L対3.3g/L)。 Glc消費量の減少は、高酢酸濃度とSAの生産における停止と相関し、培養の約18時間後の株AR26で観察された。 対照的に、ひずみAR36は一定のGlc消費を示し、酢酸の無視できる量が生成された(図3c、3d)。 これらの結果は,人工オペロン中に存在する遺伝子が機能的であり,培養開始以来S Aの産生を促進することを示した。 それらの構成的発現は、pykF+バックグラウンドで比増殖速度(γ)を25%減少させ、わずかにpykF変異体でそれを増加させたが、空のプラスミドを有する株と比較 これらの増殖条件下でのオペロン発現株では,pykf遺伝子の不活性化はS aの産生を増加させ,酢酸の蓄積を排除し,安定したGlc消費を可能にした。
AR36と比較してAR26の高い酢酸生産と低いSA生産が本質的に低酸素可用性とシェイクフラスコ培養における培地の酸性化の結果であるかどうかを決定するために、両方の株は、pHと溶存酸素張力(DOT)の制御された条件下で1Lバッチ発酵槽で培養した。 SA力価を増加させるためのアプローチとして、これらの実験におけるGlcの初期濃度を1 0 0g/Lに上昇させ、YE濃度を同時に1 5g/Lに上昇させて、より高
これらの条件下で、AR36株は42g/LのSAを60時間で生成し、すべてのGlcを消費し、12g/Lの酢酸を蓄積した。 対照的に、47時間のひずみの後、AR26は最大13g/LのSAを生成し、Glcを排出せず、29g/Lの酢酸を蓄積した(図3eおよび表2)。 PHが7に保たれ、ドットが常に20%よりも高かった発酵槽の制御された条件にかかわらず、両方の株の生産プロファイルは、AR26がより多くの酢酸 両方の株によって達成されたグローバル容積Glc消費率(Qsglobal)、γおよびXmaxが類似していた場合でも、生産性、収率および力価は、AR36でAR26よりも二倍以上高かった(図3eおよび表2)。
このような酢酸産生とS a産生の大きな違いは,一つの遺伝子のみを破壊することによって観察され,進化した大腸菌株における構成的発現系を用いた場合のPTSとpykfの組み合わせ不活性化の利点を示している。 S a産生の観察された改善を説明するために,オペロンにコードされる酵素の早期かつ一定の発現は,細胞内濃度の高い変動を防止し,培養中の解糖中間体の安定した消費を維持することができることを示唆した。 我々は、pykF遺伝子の不活性化によって引き起こされるpepからピルビン酸への減少したフラックスとこの定常代謝状態の組み合わせは、Glc消費率を減少させずにSA産生のためのPEPと他の解糖前駆体の可用性を増加させる可能性があることを仮定します。 しかし、我々は、測定された細胞内代謝産物濃度が存在しない場合、これらの発言は投機的であることを認めている。
バッチ培養におけるAR36の発酵プロファイル
以前の結果を考慮して、AR36は1L発酵槽における速度論的および化学量論的性能のさらなる特性 このような目的を達成するために、SAの産生を3つの異なる高基質培養条件で試験した。 成長、Glcおよび副生成物をそれぞれの場合について測定し、これにより生産性および収率の比較が可能になった。
まず、50g/LのGlcと15g/LのYEを利用しました(図4a)。 成長は最初の10時間の間に起こり、6.3g/lの乾燥細胞重量を0.53h-1のγで生成した。 この条件下では、24g/LのSAが32時間で生産された。Glc消費とSA生産は発酵の開始以来発生し、Glc枯渇まで続いたが、特定のGlc消費率(qs)と特定のSA生産性(qp)は指数相で高かった(表3)。 得られたGlc上のSAの収率(YSA/Glc)は0.47mol/molであり、全球体積SA生産性(Qpglobal)は0であった。74gSA/L*h(表3)。 SA経路における副生成物の蓄積に関しては、発酵の終了時に上清中に2.4g/LのDAHP、2.1g/LのDHS、1.4g/LのQA、0.4g/LのGA、および0.3g/LのDHQの濃度が存在していた(図5a)。 これらの条件下では、発酵の過程で実質的に酢酸は生成されず、32時間後に1.5g/Lの最大濃度に達した(図4a)。
5 0g/LのGlcが完全に消費されたことを考慮して、1 0 0g/LのGlcおよび1 5g/LのYEを用いて第2のバッチ実験を開始した。 前のセクションのAR26との比較で述べたように、これらの条件下で成長したAR36は、約42g/LのSAを60時間で生成しました(図4b)。 この場合、約100g/Lのグルコースを消費し、SAの最大濃度を達成した後、株は12g/Lの酢酸を生成した。 YS A/Glc、Qpglobal、Qsglobal、Xmax、およびγについて得られた値は、5 0g/LのGlcおよび1 5g/LのYEで得られた値と同様であった(表3)。 これらの実験は、同じYE濃度を使用する場合、Glcの量の2倍がほぼ2倍の時間で消費されることを示し、平均グルコース消費速度が両方の培養条件の間 4.8g/LのDAHP、2.8g/LのDHS、3.4g/LのQA、0の濃度。7g/LのGAおよび0.9g/LのDHQが、60時間後に上清中に存在した(図5b)。 興味深いことに、Glc濃度を倍増させると、AAA経路の中間生成物は、Glcの100g/Lの消費が明らかに新しい炭素フラックスボトルネックを生成しなかったこ その結果、生成された全芳香族化合物に対して形成されたSAの量は、両方の実験において80%に近いものであった(図6)。
SA生産性に対するYEの増加の効果を、1 0 0g/LのGlcおよび3 0g/LのYEを用いて、第3の一連の実験で調べた。 YEの濃度を2倍にした場合、バイオマスは2倍になったが、SA力価、γおよびYSA/Glcは、100g/LのGlcおよび15g/LのYEを用いた培養で得られたものと非常に類似していた(図4bおよび図4c)。 他の2つの条件から得られたデータと併せて、これらの知見は、YEの量が主に達成可能な最大バイオマスを決定することを示唆している。 さらに,初期Y E濃度の増加はS a力価を変化させず,SAは主にグルコースから産生されているという観察を支持した。 これらの成長条件で試験した初期Glc濃度にかかわらず,初期Y E濃度と生成された最大バイオマスとの間の直接の関係は,一つ以上の制限栄養素がY Eによって供給されていることを示唆した。 また、そのような栄養素はGlcから合成することができないため、GLCが枯渇するずっと前にYEからの枯渇が成長を制限するように見えるでしょう。 AR36栄養要求症に対抗するために必要とされるYE中に存在する芳香族アミノ酸およびビタミンは制限的になると予想されるが、この複雑な培地中の他の化合物もまた、時間の経過とともに成長制限に役割を果たす可能性がある。
30g/Lの開始YE濃度では、合計106g/LのGlcと43g/LのSAが、それぞれ15g/LのYEによる発酵よりも約半分の時間で消費され、生産された。 30g/LのYEでは、SA力価は変化しなかったにもかかわらず、QSGLOBALおよびQpglobalは、15g/LのYEでの発酵と比較して二重に増加した(表3)。 バイオマスも二重に増加したので、計算されたqpとqsは、テストされた条件下で設計された株の代謝ロバスト性を示す、指数相と静止相の両方で、三つの実験の間で類似していた。
さらに、YE濃度の増加はSA経路中間体の濃度を大幅に増加させなかったことを示した(図5c)。 この点で、大量の経路中間体の存在は、発酵ブロスからのSAの回収に悪影響を及ぼし得ることが認められている。 この懸念は、副生成物の生成を最小限に抑えるための試みとして、培養条件、遺伝的背景、および非代謝性グルコース類似体の使用のテストにつながる、件名にいくつかの努力を指示しています。
これらの実験では、ひずみまたはプロセスにさらなる修正を加えることなく、副生成物に対するSAの割合が高いことが検出されました。 各経路中間体の濃度を、すべての芳香族中間体の合計に対して比較し、それらの百分率を使用して、発酵の終了時の各副生成物に対するSAのモル比を計算した(図6)。 SAの比率はDHS、QA、またはDAHPのための10より高く、テストされるすべての基質の集中のためのGAまたはDHQのための40より高いことが判明しました。 驚くべきことに、すべての条件で得られたSA収率は理論最大値の50%に近く、全芳香族化合物(TAC)の収率は理論最大値の60%を超えており、0と推定された。86molTAC/molGlc(方法および図6を参照)。 これは、高グルコースバッチ培養を使用する場合でも、株AR36におけるAAA経路へのグルコースの効率的なリダイレクトを反映しています。 副生成物に対するS aの比,ならびに得られたS aおよびTAC収率は評価されたすべての条件に対してかなり一定であり,SA生産発酵プロセスについて報告された最高の値を我々の知る限りでは表している。 これらの改善は、設計された株に存在するプラットフォームが効率的な遺伝的背景に必要な酵素のより均質な発現を可能にすることを考慮するこ これは、必要な遺伝子が別々のプラスミドから、異なるプロモーター下で、または高レベルのGlcの効率的な使用のために最適化されていない株で発現される他の発現系とは対照的である。 遺伝子発現の動態に関する利点に加えて、IptgがAro6オペロンを誘導するために必要でないという事実は、IPTGの高価格が大規模発酵におけるその使用を制限するので、製造プロセスにとって重要な経済的利益を表す。
RT-qPCRによるAR36株の解糖および酢酸代謝に関する洞察
ar36株におけるAr6合成オペロンの構成的発現によって誘導される代謝変化のより深い洞察を得るために、いくつかの遺伝子の転写レベルは、Glcの50g/LとYEの15g/Lを有する培養における三つの異なる成長段階で測定した。 方法で詳述されているように、初期指数相(E E)、後期指数相(L E)、および静止相(S t)から得られたデータは、同じ培養条件下で成長したEEでのひずみAr3Eから測定された値に対して正規化された。
この結果は、AR36株におけるオペロンの存在および発現が、EEおよびLE相の間に解糖酵素をコードするいくつかの遺伝子の転写レベルを増加させるこ 遺伝子galPおよびglkの発現の上昇は、それらの製品がAR36の親株であるPB12におけるグルコースの輸入およびリン酸化を制御することが報告されている さらに、pgiおよびenoの転写レベルは有意に増加するが、PYKAは増加しない。 これらの変化は、芳香族化合物の収率を増加させる、PEPとフルクトース6-P(プラスミドコードトランスケトラーゼによって直接E4Pに変換することがで 我々は、株AR36における解糖遺伝子の観察されたアップレギュレーションは、これらの代謝産物を消費するオペロンコードされた酵素の強力かつ構成的
一方、アセテート生合成に関与する酵素をコードする遺伝子(poxB、ackA、pta)の転写レベルは合成オペロンの存在によって修飾されず、アセテート同化に関与する酵素をコードするactPおよびacsはEE相およびLE相で強くアップレギュレートされた(図7b)。 ActPおよびacs遺伝子のアップレギュレーションはまた、最小培地中でGlcと酢酸を共利用することができる親株PB12の指数関数的成長期に検出されています。 これらの知見は、アッセイされた成長条件における低レベルの酢酸塩と相関する(図4a)。 重要なことに、酢酸同化に関与するこれらの遺伝子の転写値は、ST期では低かった(図7b)。 この応答が使用された他の成長条件を代表するものであれば、100g/LのGlcを用いた発酵で観察された酢酸蓄積を部分的に説明することができます(図4bと図4c)。 これらの結果は、人工的にその親株PB12に存在するGlcと酢酸を同時に利用する株AR36の期待される能力を利用して、後期培養段階での発現を増加させる
合成オペロンに存在する遺伝子は、プロモーターの構成的性質とプラスミドの高いコピー数を反映して、(静止期であっても)非常に強い発現レベルを示した(図7c)。 これらの結果は、全体の発酵中に観察された中断のないGlc消費とSA生産と相関し(図4a)、オペロン中の遺伝子によってコードされた酵素が培養時間中に存在していることを示唆している。 図7cでは、aroDとzwfの転写レベルがオペロン内の他の四つの遺伝子よりもそれぞれ比較的高く、低いことがわかります。 オペロン中の六つの遺伝子は、参照株Ar3Eの染色体に存在するものと比較されているので、この観察は注意して行う必要があります。 6つの遺伝子について得られた値は、それらの間で正規化されないので、株Ar3Eにおけるそれらの染色体発現の間の変動は、株AR3 6との相対比較を変 それにもかかわらず、転写データは、オペロン内のすべての遺伝子が適切に発現された場合に予想される試験条件で得られた芳香族中間体に対するSAの高い比率と一致している。 一緒に速度論的および化学量論的データと、これらの結果は、PTSとpykFを欠いている進化株でGlcからSAの収量を増加させるための代替戦略として構成的に表