保存的変異に関するクリティカルビュー

要約

相同タンパク質の予測された表面組成情報で補完された一連のタンパク質3D構造の表面組成を分析することにより、タンパク質構造の層組成に関する重要な証拠を見出した。 タンパク質の最も内側および最も外側の部分には正味の負電荷があり、中間には正味の正電荷がある。 さらに，保存的変異の概念は，グルタミン酸とアスパラギン酸に対して非常に異なる空間的好みが見出されたなど，実質的な改訂が必要であることを示した。 蛋白質工学プロジェクトで頻繁に使用されるアラニンのスクリーニングはアラニンが”中立”残余であるという仮定に基づいてアラニンへの残余の置 しかし，アラニンは非極性残基を除くすべての残基と高い負の相関を有する。 したがって、例えば、アラニンと負に相関している残基の代替としてセリンの使用を提案します。

はじめに

ペプチド鎖を3Dタンパク質構造に折り畳むと、いくつかの残基が極性環境から折り畳まれたタンパク質の内部のより非極性環境 この移動は、アミノ酸および溶媒の熱力学的特性によって駆動される。 分子進化を通して、自然は得られるタンパク質の適切な機能と安定性のために選択しました。 小型から中型のタンパク質の場合、折り畳まれた構造では、わずかな残基のみが完全に埋め込まれている（Chothia,1976;Miller et al. ら、１ ９ ８ ７；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅ ｔ ａ ｌ．、1998）、一方、ほとんどの残基は部分的にしか埋設されていない。 溶媒の入手可能性の変化は、問題の残基の特性に依存し、タンパク質構造全体のアミノ酸組成に反映される。 溶媒接近性プロファイルにおけるこれらの相違は、種々の構造予測方法において幅広い用途を見出した（Ｈｏｌｂｒｏｏｋ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ０；ＲｏｓｔおよびＳａｎｄｅｒ、１ ９ ９ ４；ＴｈｏｍｐｓｏｎおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ、１ ９ ９ ６）。 また、環境固有の置換行列の使用（Donnelly et al.,1994;Wako and Blundell,1994)は貴重であることが証明されている。 アミノ酸の連続的な近傍が以前に研究されている（Ｖｏｎｄｅｒｖｉｓｚｔ ｅ ｔ ａ ｌ． 例えば、ｌｏｏｐ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ（Ｗｏｊｃｉｋ ｅ ｔ ａ ｌ．，１ ９ ８ ６）にその使用が見出されている（Ｗｏｊｃｉｋ ｅ ｔ ａ ｌ．，１ ９ ８ ６）。 ら、１ ９ ９ ９）および二次構造予測（ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ、１ ９ ７ ８；ＣｈａｎｄｏｎｉａおよびＫａｒｐｌｕｓ、１ ９ ９ ９；Ｊｏｎｅｓ、１ ９ ９ ９）。 残基シーケンシャル隣接選好の間に有意な相関は発見されなかった。

個々の残基の周りの空間的近傍も以前に研究されている（Burley and Petsko,1985;Bryant and Amzel,1987;Miyazawa and Jernigan,1993;Petersen et al., 1999 ). さらに、異なるアミノ酸相互作用のための接触電位を導出するために空間接触が研究されている（ＢｒｏｃｃｈｉｅｒｉおよびＫａｒｌｉｎ、１ ９ ９ ５；ＭｉａｚａｗａおよびＪｅｒｎｉｇａｎ、１ ９ ９ ６、１ ９ ９ ９）。 共通の作戦はある特定の間隔の締切り内の接触の数を調査することである。 しかし、文献には、距離依存性の接触の調査と、関与する残基の溶媒アクセシビリティの埋め込まれた情報を利用した報告が欠けているようである。

疎水性、埋込み接触傾向、および予測ウィンドウ内の位置との間の溶媒アクセシビリティ相関の二状態予測が報告されている（Mucchielli-Giorgi et al., 1999 ). しかし、個々の残基分布間の相関は記述されていません。

正しく折りたたまれたモデル構造と誤った折りたたまれたモデル構造を区別できることが重要です。 ポテンシャルエネルギーに基づく方法は，折り畳まれた構造と誤った折り畳まれた構造をよく区別しないことが指摘されている。 しかしながら、埋設された極性表面のような構造的特徴（Ｏｖｅｒｉｎｇｔｏｎ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ２）および極接触の数（ＢｒｙａｎｔおよびＡｍｚｅｌ、１ ９ ８ ７；Ｇｏｌｏｖａｎｏｖら、１ ９ ９ ８）および極接触の数（ｂｒｙａｎｔおよびＡｍｚｅｌ、,1999)は貴重であることが証明されています。

タンパク質工学では、保存的突然変異の概念が頻繁に使用されている。 一般的な考え方は、アミノ酸を類似の物理化学的性質を有する別のアミノ酸と置換することは、タンパク質の安定性および機能に影響を与えない 本論文では、同様の残基のための空間的な好みは、同様の状況下でタンパク質構造において劇的に異なることができることを示している（この文脈では、溶媒のアクセシビリティ）。

neighbour解析の結果は、構造予測のためのツールとして、特に安定性増強変異の探索のガイドとして、モデル検証において有用である。

方法

使用される配列は、非相同構造の25％配列同一性セットのサブセットである(Hobohm et al., 1992 ; ＨｏｂｏｈｍおよびＳａｎｄｅｒ，１ ９ ９ ４）は、ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄａｔａｂａｎｋ ＰＤＢＲ（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1977 ). 単鎖蛋白質配列のみを使用した。 得られたデータセットは、最大ペアワイズ配列同一性が25％の336個の単鎖配列で構成されていました。 サブセットは、対応するHSSPファイルを使用して拡張されました（Dodge et al., 1998 ). 全データセットは、８ ３ ７ ９個の整列配列および１個の４ １ ５個の９ ８ ６個の残基を含んでいた。 これは、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴのバージョン３ ４中の全残基の６． 配列の長さは64残基と1017残基の間であった。 使用されるX線構造の分解能は1.0から3.0Åの間で変化し、平均は2.0Åであった。 さらに、サブセットは、NMRによって解決された31の構造を含んでいた。 しかし、すべての水素-原子座標は破棄された。 相同配列の使用によって導入された可能性のあるバイアスをチェックするために、完全な分析は、整列された配列の有無にかかわらず行われた。 有意差は認められなかったが，二つのデータセットのうち小さい方のサイズが減少すると，予想通り，より多くのノイズが生じた。

各残基の空間的近傍は、溶媒の接近性および空間距離に基づいて決定された。 溶媒の入手可能性は、それぞれのＨＳＳＰファイルから取得された（Ｄｏｄｇｅ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1998 ). 各表面残基について、隣接する表面残基を、問題の残基までの距離に従ってグループ化した。 二つの残基間の距離は，二つの残基中のすべての可能な原子対の集合の中で最も短い距離として計算した。 ＨＳＳＰファイル中の整列は，主配列中の隣接配列も整列配列中の隣接配列であり，溶媒アクセシビリティが保存されていることを意味すると仮定した（Andrade et al. ら、１ ９ ９ ８；Ｇｏｌｄｍａｎ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1998 ). タイプiとjの残基の間の隣接相互作用の予想数は、次式によって計算されます。

ここで、xiおよびxjは、距離範囲dのデータセット内のアミノ酸iおよびjの割合であり、カットオフACCよりも大きい溶媒接近性であり、N0は観測された隣接接触の総数である。 スコアSij|d、ACCは、以下によって計算されます。

これは、好まれていない隣人ペアのための負のスコアと好まれている相互作用のための正のスコアを与えます。 スコア値Sij|d,ACCは、RTとの乗算によって見かけの熱力学的パラメータに変換することができます。

タンパク質の各層の正味電荷を計算した。 アスパラギン酸とグルタミン酸は負に帯電していると考えられ、アルギニンとリジンは正に帯電していると考えられています。 ヒスチジンは荷電していないか、または正に荷電していると考えられています。 相対正味電荷Δ qrelは、次のように定義されます

ここで、NPositiveは正の残基の数であり、NNegativeは負の残基の数であり、NTotalはその特定の層における残基の総数である。

The PDB identification codes for the structures used are 1ptx, 2bbi, 1hcp, 1iml, 1cdq, 1vcc, 1nkl, 1tiv, 2abd, 2hts, 1tpg, 1fbr, 1pco, 1who, 1beo, 2ncm, 1fim, 1tlk, 1xer, 1onc, 1rga, 1erw, 1fd2, 1put, 1fkj, 1jpc, 1thx, 1jer, 1ccr, 1wad, 2tgi, 1pls, 1neu, 4rhn, 1rmd, 1hce, 1hfh, 1tam, 2pf1, 1bip, 1whi, 1yua, 1bp2, 1zia, 4fgf, 7rsa, 1bw4, 2vil, 1eal, 1rie, 1doi, 3chy, 1cpq, 1msc, 1mut, 1rcb, 1lzr, 1htp, 1lid, 1lis, 1lit, 1kuh, 1nfn, 1irl, 1poc, 2tbd, 1cof, 1pms, 1rsy, 1snc, 1eca, 1jvr, 2end, 1anu, 5nul, 1fil, 1jon, 1lcl, 1itg, 1tfe, 1maz, 1pkp, 1lba, 1vsd, 2fal, 1ash, 1def, 2hbg, 1div, 1gds, 1grj, 1i1b, 1ilk, 1rcy, 1sra, 1ulp, 1mbd, 1aep, 1jcv, 2gdm, 1phr, 1rbu, 1esl, 1hlb, 1mup, 1vhh, 1gpr, 1btv, 1cyw, 1klo, 1l68, 3dfr, 2cpl, 1sfe, 1huw, 5p21, 1ha1, 1wba, 1lki, 2fha, 1prr, 2fcr, 1amm, 1cid, 1hbq, 1cdy, 2stv, 153l, 1rec, 1xnb, 2sas, 1gky, 1knb, 1ryt, 1zxq, 1har, 1cex, 1chd, 2tct, 2ull, 1gen, 1iae, 1nox, 1rnl, 2gsq, 1cfb, 1dyr, 1nsj, 2hft, 1fua, 2eng, 1thv, 1hxn, 2abk, 9pap, 1lbu, 3cla, 1vid, 2ayh, 2dtr, 1gpc, 1dts, 1jud, 1emk, 1ois, 1akz, 1sgt, 1ad2, 1nfp, 1din, 1lrv, 1dhr, 1bec, 1lbd, 1dpb, 1jul, 1mrj, 1fib, 1hcz, 1mml, 1vin, 1dja, 2cba, 3dni, 1lxa, 1arb, 1rgs, 1tys, 3tgl, 1ako, 1eny, 1ndh, 2dri, 1xjo, 1drw, 1kxu, 2prk, 1cnv, 1tfr, 1ytw, 1iol, 2ebn, 1tml, 1han, 1xsm, 1pbn, 1amp, 1ryc, 1bia, 1vpt, 1csn, 2ora, 1ctt, 1bco, 1fnc, 1gym, 1pda, 1cpo, 1esc, 2reb, 1mla, 1sig, 8abp, 1ghr, 1iow, 2ctc, 1gca, 1sbp, 1ede, 1pgs, 2cmd, 1anv, 1gsa, 1tag, 1dsn, 2acq, 1cvl, 1tca, 2abh, 2pia, 1pot, 1vdc, 1axn, 1msk, 1hmy, 2bgu, 1ldm, 1dxy, 1ceo, 1nif, 1arv, 1xel, 1uxy, 1rpa, 2lbp, 3pte, 1uby, 1fkx, 1pax, 3bcl, 1air, 1mpp, 2mnr, 1eur, 1cem, 1fnf, 1pea, 1omp, 2chr, 1pud, 1kaz, 1mxa, 1edg, 2sil, 1ivd, 1pbe, 1svb, 1ars, 1oyc, 1inp, 1oxa, 1eft, 1phg, 1cpt, 1iso, 1qpg, 2amg, 1uae, 1gnd、2dkb、1gpl、1csh、4enl、1pmi、1lgr、1nhp、1gcb、1bp1、1geo、2bnh、3grs、1gln、1gai、2pgd、2cae、2aaa、1byb、1smd、2mir、3cox、1dpe、1pkm、1ayl、1crl、1ctn、1clc、1tyv、1pkm、1pkm、1pkm、1pkm、1pkm、1pkm、1pkm、1pkm、1pkm、1pkm、1pkm、1pkm、1pkm、1pkm、1pkm、1pkm、1pkm、1pkm、1pkm、1pkm、1pkm、1pkm、1pkm、1pkm、2cas、1ecl、1oxy、1vnc、1gal、1dlc、1sly、1dar、1gof、1bgw、1aa6、1vom、8acn、1kit、1taq、1gpb、1qba、1aloおよび1kcw。

結果と考察

タンパク質3D構造の異なる層における荷電残基の分布と総正味電荷を図1に示します。 タンパク質の最も内側および最も外側の部分には正味の負電荷があり、中間には正味の正電荷がある。 負に帯電した最外層を溶媒に露出させる交互電荷を有するこの見かけの三層構造は興味深い。 このような組織は、半径方向電荷の中和のいくつかのレベルを確保し、おそらくタンパク質のタイトなパッキングに貢献することがで 同様に、表面層のこの電荷組織は、折り畳みイベント中に重要な静電ガイダンスを提供する可能性がある。 逆に、phを酸性またはアルカリ性の条件に変更すると、滴定可能な残基のサブセットが荷電しなくなると、タンパク質の表面での残基のパッキングが不安定になります。 埋設された酸性アミノ酸は、いくつかの異なるタンパク質構造中に見出すことができ、これらの残基は、例えば、トリプシンにおいて重要な機能的役割 ら、１ ９ ９ ２）、リボヌクレアーゼＴ１（ＧｉｌｅｔｔｏおよびＰａｃｅ、１ ９ ９ ９）およびチオレドキシン（Ｄｙｓｏｎ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ７；Ｂｈａｖｎａｎｉ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2000 ). 報告された三層構造は、整列した配列の有無の両方で観察され、したがって、タンパク質ファミリー内の埋もれた荷電基の保存によって導入されたバイ

残基の各タイプの周りの空間的な隣人は、溶媒のアクセシビリティのための任意の差別なしに計算されました。 トリプトファンとシステインの顕著な例外を除いて、アミノ酸は同一の残基タイプの空間的隣接として頻繁に観察されなかった。 この傾向は、距離カットオフの選択に依存しなかった（結果は示されていない）。 分布の違いは、8Åの距離カットオフのための異なるアミノ酸間で著しく小さかった8Åは、分布が中心残基の性質に依存しないようになるのに十分 この観測は、詳細に調査された隣人間の最大距離として8Åを使用することにつながった。

図2は、トリプトファン、グリシン、アラニン、プロリン、セリン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸を含むすべてのアミノ酸の隣接ペアのスコア値を示しています。 その他のアミノ酸の結果は、当社のホームページ（http://www.bio.auc.dk/）に掲載されています。 スコアの価値は他の溶媒入手の可能性の締切りのために同様に計算されました。 芳香族残基トリプトファンは、同じ残基タイプ（他はシステインである）との接触のための明確な好みを示す唯一の二つの残基の一つです。 他の芳香族残基との相互作用も好ましい。 興味深いことに、トリプトファンと二つの酸性残基（アスパラギン酸とグルタミン酸）との間の相互作用は異なっているように見える。 トリプトファンとグルタミン酸は予想よりも少ない頻度で観察されるが、トリプトファンとアスパラギン酸については反対が観察される。 グリシンは、同じ残基タイプとの相互作用のための典型的な負のスコアを示しています。 また、グリシンは近接空間近傍（π3.5Å）に隣接していないようである。 近くの隣人のこのアンダー表現は、プロリンのためにさらに明確です。 我々は、プロリン残基が持っているループのための好みの兆候として、このアンダー表現を解釈します。 その近傍にある他のすべてのアミノ酸との相互作用の欠如は、ほとんどの接触が溶媒分子とあることを指している。 しかし、プロリンはより大きな距離（4-5Å）で豊富な接触を有する。 ヒスチジンは、芳香族残基との接触を好み（〜3.5Å）、負に荷電した残基との接触を好み（〜3Å）、その偏光性を示すという点で興味深い。 基本的なアミノ酸のリジンに他のリジンが付いている接触のための明確で否定的なスコアが期待したようにあります。 酸性アミノ酸との良好な静電相互作用は明らかである。

最も興味深いペア相互作用のいくつかを図3に示します。 図3Aは、塩橋対リジン–アスパラギン酸を示す。 3Åの分離で見られる強い過剰表現は、古典的な塩橋の概念と一致しています。 5.5-6Åで観察されたほとんどの溶媒露出層におけるリジン–アスパラギン酸対の過剰表現は予期しないものである。 蛋白質表面上の電荷ネットワークがこの観測を引き起こす可能性があることを提案した。 図3Bには、グルタミン酸–アスパラギン酸対の結果が示されています。 最も明白な特徴は、このペアの予想される過小表現です。 しかし、タンパク質表面の近くには、同じ制限は存在しないようである。 また，表面位置電荷ネットワークがこの観測に寄与していることを提案した。 図3CおよびDには、アミノ酸対トリプトファン–グルタミン酸およびトリプトファン–アスパラギン酸が示されている。 グルタミン酸からアスパラギン酸への変異が保存的であるという一般的な信念は、示された観察に反している。 トリプトファン-グルタミン酸対は，蛋白質の高度に溶媒露出層で高度に過小表現されている。 驚くべきことに、トリプトファン–アスパラギン酸対についても同じことは言えず、3.5-6Åの距離間隔で過剰表現が観察される。 チロシン–グルタミン酸およびチロシン–アスパラギン酸対についても同様であったが，あまり顕著ではなかった。 フェニルアラニン–グルタミン酸とフェニルアラニン–アスパラギン酸対の間に有意差は認められなかった。 グルタミン酸とアスパラギン酸の唯一の違いは、側鎖の長さです。 トリプトファンとチロシンの両方に共通するのは、フェニルアラニンとは対照的に、それらの分極性である。 我々は、タンパク質の機能性を定義することに関与する表面位置トリプトファンは、その局所静電環境によって分極されていると考えています。 定量的な説明はできませんが、グルタミン酸とアスパラギン酸の鎖長の違いがトリプトファンへの近接性を優先する可能性があることはもっともらしいです。 アスパラギン酸は、側鎖カルボニル基と骨格カルボニル基との間に好ましい相互作用を有する傾向があることが示されている（Deane et al. ら、１ ９ ９ ９）、環様構造を生じる。 同様の立体配座は、グルタミン酸については観察されていない。 図3EおよびFには、ヒスチジン–アスパラギン酸およびセリン–ヒスチジン対が示されている。 これらの３つの残基は、広い範囲の加水分解酵素の活性部位残基を構成するので、それらは特に関心を有する。 高度に溶媒アクセス可能な領域では、ヒスチジン-アスパラギン酸対の過剰表現がある。 この距離は活性部位クレバスで観測された典型的な距離よりも大きい。 しかし、3Åの範囲で小さく、しかし重要な、過剰表現は、加水分解酵素の古典的なヒスチジン-アスパラギン酸の距離に準拠しています。 図3Eは、埋没ヒスチジンとアスパラギン酸の間の接触の明確な好みを示しています。 我々は、この特徴がde novo触媒サイトの分子進化の重要な部分であると考えています。 非機能的な環境で可能な触媒”トライアド”を保存すると、サイトを活性化するために必要なアミノ酸置換の数が少なくなります。

図3Fの最も明確な特徴は、高度に溶媒にさらされた環境でのセリン-ヒスチジン対の明確なアンダー表現です。 セリン-ヒスチジン対の弱い過剰表現は、溶媒が少ない領域で3Åで見られる。 したがって，触媒トライアドの存在はヒスチジン–アスパラギン酸対の好みによって主に決定されるが，セリン–ヒスチジン対は類似しているがはるかに弱い傾向を示した。

各溶媒接近性層のアミノ酸組成を決定した。 予想されるように、タンパク質の埋もれた部分は、より多くの溶媒露出層よりも高い量の非極性残基で構成されている。 アミノ酸組成の間の相関は、個々の構造層の組成のデータから計算された。 溶媒接触と局所環境に対して同様の好みを有するアミノ酸は、それらの分布の傾向が同様であるため、高い正の相関を示すことが期待される。 したがって、負の相関を示すアミノ酸は、局所環境に対して異なる好みを有し、したがって、互換性があるとは考えられない、すなわち、この位置でのこ 非極性残基がコア内に豊富に存在し、溶媒の接近性が一般的に増加するにつれて徐々に減少するので、非極性残基間の相関は正である（図4）。 対照的に、極性残基は、高度に露出した部分でより豊富であり、したがって、非極性残基と負の相関がある。 ヒスチジンとスレオニンは著しく異なる挙動を示す。 これらは互いに正の相関を示したが，アルギニンとグリシンを除いて他のカラムとはほとんど相関しなかった。 これは埋設領域と高度に露出した領域の両方でヒスチジンとスレオニンの発生が低く、媒体露出層での発生が比較的高いことに起因する。 ヒスチジンはトリプトファンとチロシンの二つの芳香族残基と，弱い極性のトレオニンと極性のアルギニンと正の相関を示した。 再び我々は、ヒスチジンの芳香族特性と電荷特性の両方の兆候としてこれを解釈します。 弱極性残基は、極性残基および非極性残基と同じ明確な類似性を分布において有していない。 プロリンとセリンは極性残基とより密接に関連しているようである。 弱極性残基アラニンは非極性残基とのみ正の相関を示した。 我々は、高い正の相関を持つ残基間の変異は、3D構造の熱力学的安定性を維持する高いチャンスを持っていることを提案しています。 これは荷電残基の場合に特にそうである。 対照的に、負の相関度の高い残基は、典型的には、タンパク質の物理化学的性質を変えずに交換することができない異なる物理化学的特性を有する残基である。 非相関残基は、構造において特別な役割を有する残基、例えば、触媒作用にしばしば関与するいくつかの残基を含む。 我々は、我々の研究におけるプロリンが極性残基と同様に振る舞うという観察は、プロリン残基の構造的役割とループとターンのためのその好みと関連していると考えている。 蛋白質工学プロジェクトで頻繁に使用されるアラニンのスクリーニングはアラニンが”中立”残余であるという仮定に基づいてアラニンへの残余の置 しかし，アラニンは非極性残基を除くすべての残基と高い負の相関を有することを示した。 したがって、例えば、アラニンと負に相関している残基の代替としてセリンの使用を提案します。

著者らの意見では、本論文はタンパク質構造組織に関する重要な新しい情報を提供する。 蛋白質の表面は各層に特定の構成および生じる特徴がある蛋白質の多層の構造特徴として見られるべきです。 この単純な重要な観察は、溶媒暴露残基の修飾を標的とする多くのタンパク質工学戦略にとって非常に重要であると考えている。

P.H.J.財政支援のためのノルウェーの研究評議会に感謝(NFR-116316/410). S.B.P. オベルスク-ファミリエフォンドとMål-2からの財政的支援に感謝の意を表している。