再生医療における幹細胞条件培地の展望
概要
背景。 幹細胞由来の馴化培地は、再生医療用医薬品として有望な見通しを持っています。 目的だ 幹細胞由来馴化培地（CM）を得るための様々な方法を調査し、様々な疾患への適用の見通しについての洞察を得る。 メソッド。 キーワード”幹細胞”と”条件培地”または”セクレトーム”と”療法を使用して体系的なレビュー。”治療された状態/疾患、培養された細胞の種類、細胞を培養するための培地およびサプリメント、培養条件、CM処理、分析された成長因子およびその他の分泌物、適用方法、および転帰に関するデータが記載され、グループ化され、集計され、分析された。 結果。 ＣＭを用いた研究のほとんどは良好な結果を示した。 しかし、種々のＣＭは、同じ種類の細胞に由来する場合であっても、異なる条件、すなわち、異なる継代、培養培地および培養条件から産生された。 様々なタイプの細胞の成長因子収量は、いくつかの研究で利用可能であり、1つの用途のためにCMを生成するために必要とされた細胞数を計算するこ 結論。 種々の幹細胞由来の条件培地を種々の疾患について試験し，ほとんどが良好な結果を示した。 しかし、標準化された生産方法とその使用の検証を行う必要があります。
1. はじめに
様々な疾患における幹細胞の使用のデータが蓄積されています。 いくつかの研究では、心筋梗塞などの変性疾患における幹細胞療法の有益な効果を報告し、幹細胞は、必要な細胞に分化する能力ではなく、損傷した組織に有益な影響を及ぼす栄養因子を分泌する能力のために組織修復を引き起こすことを明らかにした。 幹細胞由来の分泌因子に関する様々な研究は、幹細胞自体を含まない分泌因子のみが、組織/器官の損傷を伴う様々な状態で組織修復を引き起こす可能性 分泌された要因はsecretome、microvesicles、またはexosomeと言われ、幹細胞が培養される媒体で見つけることができます;従って、媒体は調節された媒体(CM)と呼ばれます。
CMを含むセクレトームの使用は、CMをより容易に製造、凍結乾燥、包装、輸送することができるため、幹細胞の使用に比べていくつかの利点があります。 さらに、それが細胞を欠いているので;拒絶問題を避けるために提供者および受け手を一致させる必要性がありません。 したがって、幹細胞由来の馴化培地は、再生医療用医薬品として製造される有望な見通しを有している。
これまで、特定の疾患にCMを使用した臨床試験は報告されていませんが、脂肪由来間葉系幹細胞CMを毛包再生に使用し、ヒトの創傷治癒を再舗装するフラクショナル二酸化炭素に関する二つのパイロット研究を除き、良好な結果を示しました。 治療のためのCMの使用は非常に魅力的であり、様々な疾患のためのCMの使用に関する研究が蓄積しているように、近い将来に活況を呈している可能性が 馴化培地には、幹細胞によって分泌された様々な成長因子および組織再生剤が含まれています。 幹細胞が様々な成長因子を分泌するという事実は、様々なプロテオーム研究によっても示され、CM中に様々な成長因子および他のサイトカインの存在を明らかにした。
しかし、様々な研究では、様々な動物モデルにおける様々な種類の変性疾患を治癒するためのCMを得るために、様々な種類の幹細胞および様々な方法の使用が報告されている。 したがって、このシステマティックレビューは、CMと治療された様々な疾患を取得するための様々な方法を調査し、様々な種類のCMと様々な疾患におけるそれらの適用利益への洞察を得ることを目的とした。
2. 材料と方法
January23,2014,pubmed/Medlineにおいて、キーワード”stem cell”と”conditioned medium”または”secretome”と”therapy”を用いた”all text”検索、キーワード”secretome”または”conditioned medium”を用いたCochrane library(trials)における”all text”検索、およびキーワード”secretome”または”conditioned medium”を用いた”all text”検索、およびキーワード”all text”検索を行った。ClinicalTrials.gov キーワード”幹細胞”と”条件培地”または”セクレトーム”と”療法を使用しています。”また、私たちのライブラリ内の関連する既存の記事が追加されました。
包含基準は、特定の疾患に対してCMを使用したすべての研究です。 除外基準は、対象の状態／疾患モデル、ＣＭの発生源、およびＣＭによる治療の転帰に関する完全なデータを含まなかった研究である。
データ収集は、治療条件/疾患、培養された細胞の種類、細胞を培養するために使用された培地およびサプリメントの詳細な組成、CMを得るための培養条件（低酸素症または正常酸素症）、CM処理、成長因子、および分析されたその他の分泌物、CM適用の方法（モード）および結果を記載し、グループ化し、表にした。
データ合成は以下の通りである：データは、CMを生成するために使用された治療された疾患および細胞型に従ってグループ化された。 また、種々の種類の細胞の成長因子収量を知るために、利用可能な場合には、成長因子を含む馴化培地を得た細胞の種類、細胞数、培養の種類および期間、および馴化培地の処理に関連して、成長因子レベルを表わし、グループ化した。 データが利用可能になったとき、1つのアプリケーションのCMを生成するために必要なセルの数が計算されました。
3. 結果と議論
包含基準を満たした39の記事を得ましたが、不完全なデータのために7つが除外されました。 様々な状態/疾患は、様々な細胞由来のCMによって治療され、ほとんどが有望な結果を示した（表1）。
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| ID: intradermal, IM: intramuscular, SC: subcutaneous, MCI: myocardial infarct, R: reperfusion, IC: intracoronary artery, IV: intravenous, Imyo: intramyocardial, LV: left ventricular, RSLT: 50% reduced size liver transplantation, TBI: traumatic brain injury, VILI: ventilator induced lung injury, SCID: severe combined immunodeficient, NOD: nonobese diabetic, SD: Sprague-Dawley, DL: Dalland Landrace, L: Landrace, W: Wistar, Le: Lewis, hu: human, AD: adipose tissue derived, MSC: mesenchymal stem cells, SC: stem cell, ESC: embryonic stem cell, PB: peripheral blood, MNC: mononuclear cell, UC: umbilical cord, UCB: UC blood, BM: bone marrow, EPC: endothelial progenitor cell, HUVEC: human umbilical vein endothelial cell, AF: amniotic fluid, EDT: exfoliated deciduous tooth, MPC: mesenchymal progenitor cell, USSC: unrestricted somatic stem cell, iPSC: induced pluripotent stem cell, LL: limb lost, F: fibrosis, BF: blood flow, AA: antiapoptosis, CM: conditioned medium, PAC: proangiogenic cells, deg: degeneration, IZ: infarct zone, A: apoptosis, ALT: alanine amino transferase, AST: aspartate aminotransferase, HP: histopathology, ICI: immune cell infiltration, S-D: systolic-diastolic, LIB: liver injury biomarker, PIC: proinflammatory cytokine, Hu-SC-, IL1-rec-A: IL1 receptor antagonist, NPC: neural progenitor cell, PAH: para amino hippuric acid. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
種々の馴化培地は、同じ種類の細胞に由来する場合であっても、異なる条件、すなわち、異なる継代、細胞数、培養培地、および培養条件から産生された（表2）。 種々のタイプの細胞の増殖因子収率を表３に見ることができ、１つの用途のためにＣＭを産生するのに必要な細胞数を表４に見ることができる。
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| SCID:厳しい結合された免疫不全、うなずき: 非肥満糖尿病、ＳＤ：Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、Ｈ Ｕ：ヒト、ＡＤ：脂肪組織、ＳＣ：幹細胞、ＡＦ：羊水、ＵＣＢ：臍帯血、ＥＰＣ：内皮前駆細胞、ＢＭ：骨髄、ＭＳＣ：間葉系ＳＣ、ＭＮＣ：単核細胞、ＭＰＣ：間葉系前駆細胞、ＨＰＬ：肝前駆様細胞、およびＥＤＴ：剥離落葉 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
種々の研究により、脱毛症、急性および慢性後肢虚血、急性および慢性創傷治癒、心筋梗塞、急性肝障害/障害、脳損傷/虚血/脳卒中、脊髄損傷、肺損傷、骨欠損など、様々な種類の疾患/状態（表1）において条件培地が試験されており、条件の改善を示した。 さらに，ヒトはい性幹細胞由来間葉系幹細胞（ｈｕｅｓｃ-ＭＳＣ）ＣＭを用いて治療した慢性腎疾患では，収縮期血圧と蛋白尿の低下，尿細管および糸球体損傷，腎血流および糸球体ろ過速度の改善を示した。 しかし，ヒトさい帯血無制限体性幹細胞（ｈｕｕｃｂ-ＵＳＳＣ）またはマウス骨髄間葉系幹細胞（ｍｂｍ-ＭＳＣ）ＣＭからのｃｍを用いて治療した腎症は，血清尿素およびクレアチニンレベル，病理組織学的損傷および身体活動スコアの改善を示さなかった。 さらに，ヒト間葉系幹細胞株ＣＭを用いた癌の予防は，腫よう細胞増殖と血管新生の増加を示した。
腎臓病の二つのケースでは、hu-ESC-MSCからのCMは条件を改善することができ、CMの処理が25時間の集中のステップを含んでいるので必要な成長因子のレベ しかし、hu-UCB-USSCまたはmBM-MSC-CMの場合、CM処理に関するデータとCMの成長因子レベルに関するデータの欠如は、条件を改善するための失敗は、特定の成長因子の
3.1. 培養培地およびサプリメント
いくつかの研究では、ウシ胎児血清または完全培地を含む他のサプリメントを使用したが、他の研究では無血清培地を使用した。 さらに、使用された基礎培地は、可変、例えば、ＡＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１ ２、Ｍ１ ９ ９、ｅｂｍ２、ＥＧＭ−２、ｉｎ ｖｉｖｏ１ ５、または化学的に定義された培地であり、同じ型の細胞を異なる種類の基礎培地 Ｉｎｖｉｔｒｏ培養における培養培地はｉｎｖｉｖｏ状態における微小環境を表し，細胞の運命およびしたがって細胞分泌を決定する可能性がある。 したがって、同じタイプの細胞は、表３に見られるように、それらを異なる培地で培養したときに、異なるレベルの増殖因子を分泌する可能性がある。
3.2. 培養期間
CMの生産は、培養期間において十六時間から五日まで変化する（表3）。 完全な培地を使用した場合、短い培養期間は、細胞によって消費されなかった特定の血清由来の成長因子を残し、成長因子レベルに追加するか、逆に、 培地からの残留増殖因子の存在の可能性は、細胞を含まない培地がpg/mLのTGF-b1レベルを含有することを示した研究で見ることができる（表3）。
3.3. 培養条件
ほとんどの研究では単層培養でCMが生成されましたが、いくつかの研究ではスフェロイド培養が使用されました（表3）。 スフェロイド培養は特別な取り扱いと装置（スピナーフラスコ）を必要とするが、従来の単層培養と比較してより多くの細胞を産生し、したがってより多くの分泌因子を産生する（表4）。 さらに、回転楕円体の中心に位置する細胞は、表面上の細胞と比較して相対的な低酸素状態にあり、したがって、特定の成長因子収率をさらに増加させ
3.4. 疾患改善における分泌因子の役割
幹細胞からCMに様々なサイトカインが分泌され、様々な疾患-状態の改善に役割を果たしました。 これらのサイトカインは、成長因子、炎症誘発性および抗炎症性サイトカイン、および他のサイトカインに分類することができる。 様々な研究は、従来のELISAアッセイからプロテオームプロファイリング法に、条件付きCMの様々なサイトカインを評価するために様々な方法を使用しました。
3.4.1. 成長因子
さらに、様々な成長因子を分析した研究は、様々な幹細胞によってそれらの馴化培地に分泌された様々な成長因子の存在を報告した（表3）、FGF-2、PDGFBB、BMP-2、およびSDF-1を分泌しなかったが、IGF-1、VEGF、TGF β1、およびHGFを分泌したヒトMSC（Lonza）を除いて。 さらに、異なる培養条件および培地は、異なるレベルの成長因子分泌をもたらす可能性がある。
3.4.2. プロおよび抗炎症性サイトカイン
3.4.3. その他のサイトカイン
3.5. 条件培地の翻訳患者における使用法
条件培地では、様々な要因がカクテルとして存在し、再生を促進するために協調して行動することができる。 したがって、あらゆる種類の幹細胞由来馴化培地の成長因子およびサイトカインレベルの完全なセットを分析し、培養条件、馴化培地処理、および特定の馴化培地処理に応答する疾患/状態を知ることが重要である。 特定の馴化培地中の種々のサイトカインの含有量が既知である場合、特定の疾患／状態に対する馴化培地の結果を決定することができ、患者への翻訳への道が開かれている。
VEGFレベルを分析した研究から、ほとんどの幹細胞はVEGFを分泌すると結論付けることができます。 VEGFは、損傷/損傷した組織/器官の再生において重要な血管新生に役割を果たすため、様々な幹細胞由来の馴化培地は様々な疾患を治癒することができ、虚血を伴う疾患に対してより多くの影響を与えるであろう。 さらに、VEGFは従ってそれ以上の損傷を防ぐ低酸素の状態のapoptosisを防ぐかもしれません。
さらに、FGF2はVEGFと比較してより強力な血管新生因子であり、線維芽細胞、前脂肪細胞、内皮、上皮、神経幹細胞の増殖、神経堤由来グリア細胞および筋原性細胞の遊走、および神経上皮細胞の成熟ニューロンおよびグリア細胞への分化に追加の影響を及ぼす。
他の成長因子は、結合組織、グリアなどの細胞のPDGF、間葉系、グリア、上皮細胞のEGF、様々な種類の細胞のIGF-IおよびIGF-IIの増殖に特に重点を置いて、損傷/損傷を受けた組織器官の再生に貢献している。 さらに、VEGFファミリーのメンバーであるPlGFは、in vitroおよびin vivoでVEGFの活性を増加させ、KGFは、酸化ストレス誘発上皮細胞死を阻害し、NGFは神経突起の伸長および神経細胞の生存を促進し、BDNFは、神経保護であり、細胞の生存を促進し、アストログリア瘢痕形成を減少させ、HEGF、FGF-7、EGF、およびHGFを含むいくつかの成長因子は、肝再生を促進する。＜3052＞＜3567＞再生に関与する炎症誘発性サイトカインは、肝臓保護作用によるIL-1b、血管新生活性によるIL-8、創傷治癒促進活性によるIL-9である。 さらに、抗炎症性サイトカインは炎症を予防し、肝臓の再生を促進する。
MCSF受容体（MCSFR）は、骨髄前駆細胞、単核食細胞、胎盤栄養膜の成長と発達を促進し、PDGFRは、アポトーシス阻害による細胞増殖、運動性、分化、または生存を引き起こ
さらに、血管新生および肝臓保護活性に関与するMCP-1のような、一つの因子が複数の再生作用様式に寄与する可能性がある。 さらに、様々なヒト疾患に適用されるCMの生産のために、有望な転帰を示した動物研究からのデータは非常に貴重である。
3.5.1. 様々なヒト疾患への翻訳用CMの製造
様々なヒト疾患にCMを使用するためには、CMの製造方法を、CMを製造するために必要な細胞の種類と数、培養液と条件、馴化培地処理の観点から標準化する必要がある。 さらに、配信の量とモードも重要です。 様々な研究では、様々な数と細胞の種類と様々な用量のCMが使用されているため、一つのアプリケーションでCMを得た細胞の数を知ることが重要であり、これはヒトの研究のために補間される可能性がある。 したがって、表4では、ヒト研究への補間に必要とされる可能性のあるすべてのデータ、すなわち、治療された疾患、動物の種および年齢または体重、細胞のタイプ、培養培地および状態、一つの適用のためのCMを産生する細胞の数、体積、および適用様式を要約した。 さらに、さまざまな条件のためのCMのさまざまな可能な適用は図1に要約されます。
さまざまな条件のためのCMのさまざまで可能な適用。
さらに，患者への翻訳のためには，様々な条件培地の様々なサイトカイン含量を分析し，注意することが非常に重要である。 さらに、既知のサイトカイン含有量を有するすべての馴化培地について、様々な疾患に対するその使用の検証を実施する必要がある。 最後に、既存の癌の促進の可能性はCM毎にテストされ、受信者が癌から自由であることを保障するCM療法の前に注意が取られるべきである。
患者のための様々なCMの生産の利点は、製造方法が標準化されている場合、製薬会社による大量生産の可能性にあります。 条件培地は、患者に適用するためにgmp（good manufacturing practice）施設を必要とする幹細胞のようなものではありません。 CMが適切に包装されている場合、それは薬物として容易に輸送することができ、幹細胞が必要とするような凍結保存を必要としない。 しかし、長期間生存する可能性のある幹細胞と比較して、サイトカインや成長因子の半減期がほとんど短く、患者にとっては不利であるが製薬会社にはより多くの利益をもたらすため、CMをより頻繁に与える必要がある。
4. 結論
様々な幹細胞由来の条件培地は、様々な方法および処理によって製造され、様々な疾患について試験され、ほとんどが良好な結果を示した。 しかし、様々な条件培地製造のための標準化された方法および様々な疾患に対するそれらの使用の検証を実施する必要がある。
利益相反
著者は、この論文の出版に関して利益相反はないと宣言しています。
謝辞
この研究は、インドネシア教育文化省（Pusnas2014）からの研究助成金、契約番号2218/H2によって資金を供給されました。R12/HKP.05.00/2014.
