時計によるヘテロクロマチンの安定化が幹細胞の若返りと軟骨の再生を促進
抗体
ウェスタンブロッティングの場合:抗時計(#5157,1:1,000)、抗Hp1A(#2616S,1:1,000)、抗Hp1Y(#2619,1:1,000)、抗Hp1Y(#2619,1:1,000)、抗Hp1Y(#2619,1:1,000)、抗Hp1Y(#2619,1:1,000)、抗Hp1Y(#2619,1:1,000)、抗Hp1Y(#2619,1:1,000)。ＣＥＬＬ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからの抗ｋａｐ１（Ａｂ２ ２ ５ ５ ３，１：２，０ ０ ０）、Ａｂｃａｍからの抗ラミンｂ１（ＡＢ１ ６ ０ ４ ８，１：１，０ ０ ０）および抗Ｌｂｒ（Ａｂ３ ２ ５ ３ ５，１：１，０ ０ ０）；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからの抗β−アクチン（ｓｃ−６ ９ ８ ７ ９，１：３，０ ０ ０）。
For immunostaining: anti-Ki67 (ZM0166, 1:500) from ZSGB-BIO; anti-γH2AX (05-636, 1:400) from Millipore; anti-53BP1 (A300-273A, 1:500) from Bethyl Laboratories; anti-FOXA2 (8186S, 1:100) from Cell Signaling Technology; anti-SMA (A5228, 1:100), and anti-TuJ1 (T2200, 1:100) from Sigma-Aldrich; anti-H3K9me3 (Ab8898, 1:500) and anti-NANOG (Ab21624, 1:200) from Abcam; anti-Lamin A/C (sc-376248, 1:500), anti-OCT3/4 (sc-5279, 1:200) and anti-SOX2 (sc-17320, 1:100) from Santa Cruz Biotechnology; anti-Aggrecan (AF1220, 1:100), anti-Osteocalcin (MAB1419, 1:100), and anti-FABP4 (AF3150, 1:100)R&Dシステムから。フローサイトメトリーの場合：抗ＣＤ７ ３（５ ５ ０ ２ ５ ７、１：２ ０ ０）、抗ＣＤ９ ０（５ ５ ５ ５ ９ ５、１：２ ０ ０）、抗ＣＤ４ ４（５ ５ ０ ９ ８ ９、１：２ ０ ０）、抗ＨＬＡ−ＡＢＣ（５ ６ ０ １ ６ ８、１：１ ０ ０）、抗ＣＤ３ ４（５ ５ ５ ８ ２ ２、１：２ ０ ０）、抗ＣＤ４ ３（１：１ ０ ０）、抗ＨＬＡ−ＡＢＣ（１：１ ０ ０）、抗ＨＬＡ−ＡＢＣ（１：１ ０ ０）、抗ＨＬＡ−ＡＢＣ（１：１ ０ ０）、抗ＨＬＡ−ＡＢＣ（１：１ ０ ０）、抗ＨＬＡ−ＡＢＣ（１：１ ０ ０）、抗ＨＬＡ−ＡＢＣ（１：１ ０ ０）、抗ＨＬＡ−ＡＢＣ（１：１ ０ ０）、抗ＨＬＡ−ＡＢＣ（１：１ ０ ０）、抗ＨＬＡ−ＡＢＣ（らの抗ＣＤ４ ５（５ ５ ５ ４ ８ ２，１：２ ０ ０）、抗ＣＤ１ ４（５ ５ ５ ３ ９ ８，１：２ ０ ０）および抗ＣＤ１ ９（５ ５ ５ ４ １ ５，１：２ ０ ０）；抗ＣＤ１ ０ ５（１ ７−１ ０ ５ ７−４ １，１：２ ０ ０）および抗ＰＤＰＮ（１ ７−９ ３ ８ １−４ ２，１：２ ０ ０）；および抗ＣＤ１ ０ ５（１ ７−１ ０ ５ ７−４ １，１：２ ０ ０）；および抗ＰＤＰＮ（１ ７−９ ３ ８ １−４ ２，１：２ ０ ０）；および抗ＰＤＰＮ（１ ７−９ ３ ８ １−４ ２，１：２ ０ ０）；（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）から；抗ＣＤ２ ９（３ ０ ３ ０ ０ ４，１：２ ０ ０）、および抗ｃｄ１ ３（３ ０ １ ７ ０ ５，１：２ ０ ０）、抗ｃｄ１ ６ ６（３ ４ ３ ９ ０ ３，１：２ ０ ０）および抗ＣＤ１ ６ ４（３ ２ ４ ８ ０ ５，１：２ ０ ０）が挙げられる。
細胞培養
CLOCK+/+hESCs（hescs、line H9、WiCell Research Institute）およびCLOCK−/−hescsは、hESC培養培地中のマイトマイシンC不活性化マウス胚線維芽細胞（MEFs）からなるフィーダー層上に維持された。 ＨＥＳＣ培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１ ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ ０％ノックアウト血清置換（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０を含有した。１ｍ Ｍ非必須アミノ酸（Ｎｅａａｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ｍ Ｍ Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５ ５μ Ｍ β−メルカプトエタノール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および１ ０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（Ｊｏｉｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｎｔｒａｌ、Ｉｎｃｈｏｎｅ、Ｋｏｒｅａ）。 あるいは、ｈＥＳＣを、Ｍｔｅｓｒ培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）中でＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｂ Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）被覆プレート上で培養した。１ｍ Ｍ Ｎｅａａｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および１ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（Ｊｏｉｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｎｔｒａｌ，Ｉｎｃｈｏｎｅ，Ｋｏｒｅａ）を添加したＭｅｍａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有するｍｓｃ培地中で維持した。＜８ ５ ８ ２＞＜９ ６ ８ ３＞ｈＥＳＣ由来のｈＭＳＣと一次ｈＭＳＣの両方を、１ ０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｃａｔ＃１ ０ ０ ９ ９−１ ４ １、Ｌｏｔ＃１ ６ １ ６ ９ ６ ４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．
hESCsにおけるCRISPR/Cas9媒介遺伝子編集
CRISPR/Cas9媒介遺伝子編集は、いくつかの変更を加えた以前に記載された方法を介して行われました。簡単には、ＣＬＯＣＫ（ＣＬＯＣＫ−ｇＲＮＡ）のエクソン５を標的とするガイドＲＮＡをｇＲＮＡクローニングベクター（＃４ １ ８ ２ ４、Ａｄｄｇｅｎｅ）にクローニングした（補足情報、表Ｓ１）。 ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２ ７ ６ ３ ２（Ｓ１ ０ ４ ９、Ｓｅｌｌｅｃｋ）で２ ４時間処理すると、ｈＥＳＣ（５×１ ０ ６）を、相同性アーム、ＣＬＯＣＫ−ｇＲＮＡおよびＨＣＡＳ９（＃４ １ ８ １ ５、Ａｄｄｇｅｎｅ）を含むドナープラスミドカクテルを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１ ０ ０μ ｌに再懸濁し、４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｏｎｚａ） 次いで、細胞をＭＥＦフィーダー細胞上に播種した。 Ｇ４ １ ８（１ ０ ０μ ｇ／ｍｌ、１ １ ８ １ １ ０ ２ ３、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加して、電気穿孔の２〜４日後に陽性選択を開始した。 選択の2週間後、G418耐性クローンを選択し、さらなる特性評価および拡張のために96ウェルプレートに移した。 ゲノム編集同定にはゲノムＰＣＲとウェスタンブロッティングを用いた。 さらに、我々はpCAG-FLpo−2A−puroベクターとエレクトロポレーションを介してクロック/-hESCsのネオマイシン抵抗カセットを削除しました。 トランスフェクションの三日後、1μ g/mLのピューロマイシン（Thermo Fisher Scientific）を使用して、ピューロマイシン耐性細胞を48時間濃縮した。8-12日の選択の後、新興コロニーを選
hMSCの生成と特性
hmscは、以前に公開されたプロトコルに従ってhESCsと区別されました。簡単には、ｈＥＳＣを胚様体（Ｅｂｓ）に解離させ、分化培地（１ ０％ＦＢＳを補充したＭｅｍａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ｃａｔ＃１ ０ ０ ９ ９−１ ４ １、ロット＃１ ６ １ ６ ９ ６ ４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０）で処理した。１ｍ Ｍ Ｎｅａａｓ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１ ０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、５ｎｇ／ｍｌ Ｔｇｆ Β、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））を、９ ５％合流するまで１ ０日間、マトリゲル被覆プレート上に置いた。 １ｍ Ｍ Ｎｅａａｓ、１ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＭｅｍａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＭＳＣ培地で処理したＭｓｃ様細胞を消化し、マトリゲル被覆プレート上に 次いで、合流したＭＳＣ様細胞をゼラチン被覆板に継代した。 ＨＭＳＣを、ＨＭＳＣ特異的マーカー（ＣＤ７ ３、ＣＤ９ ０、およびＣＤ１ ０ ５）に対応する異なる抗体でＦＡＣＳによって精製した。 ＣＤ７ ３、ＣＤ９ ０およびＣＤ１ ０ ５三重陽性細胞は、ＣＤ４ ４、ＣＤ１ ６ ６、ＣＤ２ ９、ＨＬＡ−ＡＢＣ、およびＣＤ１ ３などの陽性マーカー、ならびにＣＤ３ ４、ＣＤ４ ３、ＣＤ４ ５、ＣＤ１ ６ ４、ＣＤ１ ４、ＣＤ１ ９、およびＰＤＰＮなどの陰性マーカーを含 HMSCの機能性は、軟骨細胞、脂肪細胞および骨芽細胞への分化によってさらに検証された。 HMSCに由来する骨芽細胞、軟骨細胞および脂肪細胞を、von Kossa染色によって特徴付けた（GMS80045.3、GenMed Scientific Inc. Ｏｌｉｌ Ｒｅｄ Ｏ（Ｏ１ ３ ９ １，Ｓｉｇｍａ）染色（脂肪形成を示す）、ｏｌｉｌ Ｒｅｄ Ｏ（Ｏ１ ３ ９ １，Ｓｉｇｍａ）染色（脂肪形成を示す）、ｏｌｉｌ Ｒｅｄ Ｏ（Ｏ１ ３ ９ １，Ｓｉｇｍａ）染色（脂肪形成を示す）、ｏｌｉｌ Ｒｅｄ Ｏ（Ｏ１ ３ ９ １，Ｓｉｇｍａ）染色（脂肪形成を示す）、ｏｌｉｌ Ｒｅｄ Ｏ（Ｏ１ ３ ９ １，Ｓｉｇｍａ）染色（脂肪
原発性hMSCの単離と培養
原発性hMSCは、異なる個体の歯肉から単離された。23,33,34,65歯肉から分離した組織を、TrypLE™Express Enzyme(1×)plus Dispase IV中のはさみを使用して小さな（1mm2）片に切断し、さらに37℃で30分間インキュベートした。 消化された組織懸濁液をＭＳＣ培養培地によって中和し、室温で２ ０ ０×ｇで５分間遠心分離した。 得られたペレットを、１ ０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＭｅｍａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＭＳＣ培地に再懸濁し、一次Ｈ ＭＳＣの増殖のためにゼラチン
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
PER2-dLucプラスミドは、E.E.Zhangからの親切な贈り物でした。２ ５ｍ Ｍルシフェリン（ＬＵＣＫ−１Ｇ，Ｇｏｌｄｂｉｏ）を含有するＭＳＣ培養培地と交換した。ＰＥＲ２−ＤＬｕｃを保有する８ ８個の細胞を、２ ４ウェル培養プレート中で合流するように成長させ、２ ０μ Ｍ ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（Ｓ２ ４ ４ ９，Ｓｅｌｌｅｃｋ）と２時間同期させた。 細胞をＬｕｍｉｃｙｃｌｅルミノメーターで３ ７℃で５〜７日間監視し、生成したデータをＬｕｍｉｃｙｃｌｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｃｔｉｍｅｔｒｉｃｓ）で分析した。 最初の24時間サイクルからのデータは、私たちの統計分析から除外されました。
In vitro hMSC同期および概日分析
hmscをmsc培地でゼラチンコーティングしたプレートに95％合流するまでめっきした。 同期のために、細胞を20μ Mフォルスコリンで2時間処理し、PBSで2回洗浄した後、MSC培地に再保存した。 細胞を、同期後２ ４時間から開始して、９時間の３時間間隔で細胞を収集し、続いてＲＮＡ抽出およびＲＴ−ｑＰＣＲ検出を行った。 ノンパラメトリックテストJTK_CYCLEは、前述のように概日振動を検証するために使用されました。Pとqの値<0.05の両方を持つhMSCsの89時間コーススレッドは、リズミカルと考えられました。
ウェスタンブロッティング
細胞を、4%SDSおよび100mM Tris-HClを含むSDS緩衝液中で溶解した。 タンパク質濃度を、ＢＣ Ａ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量し、試料あたり約２ ０μ ｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気変換した。 その後、膜を5％ミルクでブロックし、一次抗体とインキュベートし、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）共役二次抗体とインキュベートした。 免疫反応性バンドを、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ＸＲＳ＋システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で可視化した。 統計的分析は、画像Ｊソフトウェア（ＮＩＨ）によって定量化した。 各グループには3つの独立した実験がありました。 統計的有意性は、両側の対のない学生のt検定によって評価された。＜８ ５ ８ ２＞＜２ ３ １ １＞透過型電子顕微鏡＜２ ０ ０ １＞＜９ ６ ８ ３＞後期通過（Ｐ９）ＣＬＯＣＫ＋／＋およびＣＬＯＣＫ−／−ｈＭＳＣを、Ｔｒｙｐｌｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で酵素的に採取し、室温で５ ０ ０×ｇで５分間遠心分離した。 得られたペレットを４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で氷上で一晩ｐｂｓ（ｐＨ７． その後、細胞を段階的な一連のエタノールで脱水し、透過性化し、Lowicryl樹脂HM20に埋め込みました。 切片（２ ０ ０ｎｍ）を得て、１ ０ ０ｋＶで動作するＳｐｉｒｔ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＦＥＩ Ｃｏｍｐａｎｙ）で撮像した。＜８ ５ ８ ２＞＜２ ３ １ １＞免疫蛍光染色＜２ ０ ０ １＞＜９ ６ ８ ３＞カバースリップ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に播種した細胞をＰＢＳで２回洗浄した。 次いで、細胞を４％ＰＦＡで３ ０分間固定し、ＰＢＳ中の０.４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１ ０ ０で３ ０分間透過処理し、ｐｂｓ中の１ ０％ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で室温で１時間遮断した。 ブロッキング後、細胞を一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。 続いて、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体と室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。 核をＨｏｅｃｈｓｔ３ ３ ３ ４ ２（Ｈ３ ５ ７ ０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。 撮像は、Ｌｅｉｃａ ＳＰ５共焦点システムで行った。 蛍光信号の数、強度および面積の統計的分析を、Image J software（NIH）によって定量した。 細胞を３つの生物学的複製物から収集した。 統計的有意性は、両側の対のない学生のt検定によって評価された。 Ｈ３Ｋ９Ｍｅ３染色の３Ｄ再構成を図１に示す。 ２ｆは、Ｌｅｉｃａ ＳＰ５共焦点システムを用いて最大５ ０枚の画像に対して従来のモードで５ ０ｎｍ間隔で連続ｚスタック分割によって実施され、さらに、前述のようにＩｍａｒｉｓソフ90
SA-β-gal染色アッセイ
SA-β-gal染色は、以前の研究に記載されているように行った。33,34手短に言えば、細胞を固定緩衝液（2％ホルムアルデヒドおよび0.室温の5分の2%のglutaraldehyde）。 その後、固定された細胞を、３ ７℃で一晩、新鮮な染色溶液で染色した。 視野を各ウェルで無作為に選択し、ＳＡ−β−ｇａｌ陽性細胞の割合をＩｍａｇｅｊソフトウェアを用いて決定した。 各グループは三つの生物学的複製を有していた。 統計的有意性は、両側の対のない学生のt検定によって評価された。
Clonal expansion assay
clonal expansion assayを以前に報告したように実施した。34,65簡単に言えば、ウェルあたり6000細胞を6ウェルプレートに播種し、9-12日間培養した。 細胞をPBSで2回洗浄し、4%PFAで固定し、室温で1時間0.2%crystal violetで染色した。 視野はスキャナによって走査され、さらにＩｍａｇｅｊソフトウェア（ＮＩＨ）によって測定された。 各グループは三つの生物学的複製を有していた。 統計的有意性は、両側の対のない学生のt検定によって評価された。
Co-IP
Flag-LucまたはFlag-CLOCKおよびhmscを発現するプラスミドをトランスフェクトしたHEK293T細胞をCHAPS溶解緩衝液（120mM NaCl、0.５）、およびｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔｌｅ（Ｒｏｃｈｅ））を４℃で４時間遠心分離し、次いで１ ４，５ ０ ０×ｇで４℃で４ ０分間遠心分離した。 内因性タンパク質との共−ＩＰの場合、上清を、示された抗体と一晩４℃で回転させて混合し、次いで、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ−ＰＬＵＳ Ａｇａｒｏｓｅビーズ（ｓｃ−２ ０ ０ ３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）と４℃でさらに４時間インキュベートした。 ビーズをＣＨＡＰＳ緩衝液で６回洗浄し、次にＦｌａｇペプチドで溶出するか、または１×ＳＤＳ負荷緩衝液中で１ ０分間沸騰させて、ウェスタンブロッティングを行った。＜８ ５ ８ ２＞＜２ ３ １ １＞ＬＣ−ＭＳ／ｍｓ分析およびタンパク質同定＜２ ０ ０ １＞＜９ ６ ８ ３＞免疫沈降により得られた溶出タンパク質を１ ０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ（Ｗｂ−０ １ ０ １，Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｄｉｎｇｇｕｏ Ｃｈａｎｇｓｈｅｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃ Ｏ． 株式会社）。 タンパク質サンプルを含むゲルバンドを切除し、小さなプラグに切断し、脱水（100％アセトニトリル）、還元（10mM DTT、25mM NH4HCO3、45分間、56℃）およびアルキル化（40mMヨードアセトアミド、25mM NH4HCO3、45分間、暗所で室温）した。 次に、ゲルプラグを乾燥させ、２ ５ｍ Ｍ Ｎ Ｈ４ＨＣＯ３中の配列決定グレード修飾トリプシン（バンド当たり４ ０ｎｇ）で３ ７℃で一晩消化した。 次いで、得られた溶液を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために試料バイアルに移した。
nanoLC-MS/MS実験は、データ依存モードでQ Exactive質量分析計（Thermo Scientific）で実行され、70,000（m/z200）の高分解能でMSデータを300-1,600のm/z範囲で取得できました。 Q Exactive分析からの生データは、タンパク質同定のためのSequest HT検索エンジンと偽発見率（FDR）分析のためのPercolatorを使用してProteome Discovery（バージョン1.4）で分析しました。 データはUniProtの人間蛋白質のデータベース（06-2013で更新される）に対して捜された。 Ｆｄｒ分析は、パーコレーターを用いて行い、ｆｄｒ＜４ ６ ７＞１％をタンパク質同定の閾値として設定した。 ペプチド信頼度はペプチドフィルタリングのために高く設定された。＜８ ５ ８ ２＞＜２ ３ １ １＞ＲＴ−ｑＰＣＲ及びＲＮＡ−Ｓｅｑ＜２ ０ ０ １＞＜９ ６ ８ ３＞ｔｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて培養ヒト細胞又はマウス関節から全ＲＮＡを抽出し、ＤＮＡフリーキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてゲノムＤＮＡを除去した。 cDNA発生したとのスクリプト逆転写システム（（一部、改変が終了したm型). ＲＴ−ＱＰＣＲは、ＣＦＸ３ ８ ４Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中のＱＰＣＲ Ｍｉｘ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いて行った。 各グループは四つのよく複製を持っていた。 統計的有意性は、両側の対のない学生のt検定によって評価された。 全てのＲＴ−ｑＰＣＲ実験は、少なくとも３回の実験反復を用いて実施し、少なくとも２回独立して反復した。 マウス関節RNA-seqのために、Luc（n=12マウス）またはCLOCK（n=12マウス）を発現するレンチウイルスを注入した高齢マウスの同じ治療群からの膝関節RNAサンプルは、質量で均等に混合され、RNA-seqは二つの技術的複製で行われた。 Ｈｍｓｃｒｎａ-ｓｅｑについて，二つの生物学的複製を調べた。 製造業者のプロトコルに従って、Ｉｌｌｕｍｉｎａ用のＮｅｂｎｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用して配列決定ライブラリを構築した。 生成されたライブラリは、150bpの読み取り長さとペアエンド配列とIllumina HiSeq X-Tenプラットフォーム上で配列決定されました。 品質管理および配列決定は、Ｎｏｖｏ ｇｅｎｅ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって行われた。 QPCRに使用されるプライマーは、補足情報、表S2に示されていた。
RNA-seqデータ処理
RNA-seqデータ処理パイプラインは以前に報告されています。Trim Galoreソフトウェア(バージョン0.4.5)(https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore)では、34個の生のペアエンド読み取りがトリミングされました。 クリーンリードは、HISAT2（バージョン2.0.4）を使用してUCSCヒトhg19ゲノムまたはマウスmm10ゲノムにマッピングされました。91samファイルは、パラメータ”-S-b-q10″を使用してSAMtoolsによってbamファイルに変換されました。92その後、読み取りカウントはHTSeq(バージョン0.11.0)によって計算され、高品質のマップされた読み取りのみ(mapping quality>20)が保持されました。各遺伝子のＦｐｋｍ値は、StringTie（バージョン1.2.3）を使用して計算した。２）を用いて、カットオフ「ｑ値（調整されたｐ値、ｐａｄｊ）＜４ ６ ７＞０.０ ５および／ｌｏｇ２（倍変化）／＜１ ７ ５ ０＞１（ｈｍｓｃについては）または／ｌｏｇ２（倍変化）／＜１ ７ ５ ０＞０.５（マウス関節については）」 遺伝子オントロジー（Ｇ Ｏ）濃縮分析をＴｏｐｐｇｅｎｅで行った。95遺伝子セット濃縮分析は、GSEA（バージョン2.2.4）によって実施した。 ＳＡＳＰ遺伝子セットは以前の研究から得た。42
DamID-seq
pLgw V5-EcoDamおよびpLgw EcoDam-V5-EMDは、Bas van Steensel教授(The Netherlands Cancer Institute(NKI))から寄贈されました。 DamID-seqは、記載のようにして、改変を加えて実施した58。 手短に言えば、HEK293t細胞から生成されたDamおよびDam-EMDレンチウイルスを、19,400×gで2.5時間超遠心によって濃縮した。 CLOCK+/+およびCLOCK−/−hmscは、ウェルあたり2×105細胞で六つのウェル皿に播種した。 各グループは三つの生物学的複製を有していた。 翌日、培養培地を、ＤａｍまたはＤａｍ−ＥＭＤレンチウイルスのいずれかを含有する２ｍＬの新鮮な培養培地と交換した。 形質導入の７ ２時間後に、細胞を回収し、Ｄｎｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＜２ ０ ５ ０＞Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（６ ９ ５ ０ ４、Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを単離した。 ＤＰＮＩ（Ｒ０ １ ７ ６Ｓ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）消化、アダプター連結、ＤＰＮＩＩ（Ｒ０ ５ ４ ３Ｓ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）消化、ＰＣＲ増幅および精製を、前述のように行った。アダプタートリミングのために、増幅されたＤＮＡを超音波処理し、Ａｌｗｉ（Ｒ０ ５ １ ３Ｓ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した。 ＤＮＡライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｅ７ ３ ７ ０Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のためのＮｅｂｎｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用して構築した。 ライブラリーをプールし、Illumina NovaSeqシーケンサー上で150bpの読み取り長さを持つペアエンド配列を行った。
DAMID-seqデータ処理
CLOCK+/+およびCLOCK−/−hmscのDamおよびDam-EMDデータの生の読み取りは、Trim Galoreソフトウェア(バージョン0.4.5)(https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore)でトリミングされました。 トリミングされた読み取りは、Bowtie2（バージョン2.2.9）を使用してUCSCヒトhg19ゲノムにマッピングされました。９ ６個のＰＣＲ重複をＭａｒｋｄｕｐｌｉｃａｔｅｓで除去した。Picardツールのjarプログラム。 その後、読み取りはSAMtools(バージョン1.6)でソートされました。 配列決定バイアスと深さの影響を最小限に抑えるために、各サンプルの三つの複製から処理された読み取りをマージしました。 次に、下流分析のために、各細胞型について同じ数（1億1000万）の高品質の読み取りを無作為に選択した。 DamID信号を可視化するために、deepTools（バージョン2.5.4-2-5ee467f）ソフトウェアのbamCompareプログラムを使用して、各10bpビンのCLOCK+/+およびCLOCK-/-HMSCで、Dam−EMDおよびDam信号（log2（Dam−EMD/Dam））
CLOCK+/+およびCLOCK−/−hMSCsにおけるLAD領域の識別のために、deepTools(バージョン2.5.4-2-5ee467f)ソフトウェアのbamCompareプログラムを使用して、最初にDamID信号(Dam−EMDのRPKMとDam信号(log2(Dam−EMD/Dam))をclock+/+およびCLOCK-/-hmscsの2kbビンごとにdamid信号(log2(Dam-EMD/Dam))を計算した。 次に、LADs(https://github.com/dinovski/asDamID/blob/master/scripts/hmmt_functions.R)を識別するために、tエミッション(HMMt)(バージョン0.1)を持つ隠れマルコフモデルのRパッケージを実装しました。
CLOCK+/+とCLOCK−/−hMSCsの間のLAD領域のDamID信号を比較するために、CLOCK+/+とCLOCK−/−hMSCsで識別されたLAD領域をunionのものにマージし、各union LAD領域の相対DamID信号（CLOCK−/−hMSCsのDamID信号からCLOCK+/+hMSCsのDamID信号を差し引いたDamID信号）を計算しました。 次に、Ｌａｄ領域に対する相対Ｄａｍｉｄ信号を、補足情報（図２）に示すように、ＲパッケージＲｉｄｅｏｇｒａｍ（バージョン０． ———–97
ChIP-qPCRおよびChIP-seq
簡単に言うと、1×106CLOCK+/+およびCLOCK−/−hMSCsをpbs中の1%(vol/vol)ホルムアルデヒド中で室温で8分間架橋し、125mMグリシンと室温で5分間インキュベーシ 次いで、試料を氷上でさらに１ ０分間溶解した。 Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２ ２ ０ｆｏｃｕｓｅｄ−ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒ（Ｃｏｖａｒｉｓ）中での超音波処理および４℃で１ ２，０ ０ ０×ｇで１ ０分間遠心分離した後、上清を、抗ＣＬＯＣＫ抗体、抗Ｈ３Ｋ９Ｍｅ３抗体またはウサギＩｇｇと結合したＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１ ０ ０ ０ ４Ｄ） 続いて、溶出および逆架橋を、サーモミキサー中で68℃で2時間行った。 次に，フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール抽出とエタノール沈殿によりＤＮＡを単離した。 精製されたDNAは、反復配列でのクロックまたはH3K9Me3職業の評価のためのqPCRに供された。 ＰＣＲ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｓｅｒｉｅｓ（ＫＫ８ ５ ０ ４，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いたＫＡＰＡ Ｈ Ｙｐｅｒ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを介して、スパイクイン対照を組み込むことなく、濃縮された断片をライブラリーに構築した。 すべての実験は、同様の結果で少なくとも二回行われた。 統計的有意性は、両側の対のない学生のt検定によって評価された。
ChIP-seqデータ処理
H3K9Me3ChIP-seqデータの処理のために、生の読み取りはTrim Galoreソフトウェア（バージョン0.4.5）（https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore）でトリミングされました。 トリミングされた読み取りは、Bowtie2（バージョン2.2.9）を使用してUCSCヒトhg19ゲノムにマッピングされました。96の重複した読み取りは、MarkDuplicatesで削除されました。Picardツールのjarプログラム。 その後、読み取りはSAMtools(バージョン1.6)でソートされました。 配列決定バイアスと深さの影響を最小限に抑えるために、各サンプルの三つの複製から処理された読み取りをマージしました。 次に、下流分析のために、各細胞型について同じ数（1億3000万）の高品質読み取りを無作為に選択した。 ChIP-seq信号を可視化するために、各10-bpビンのRPKM値を決定することにより、正規化された読み取りカウントを計算しました。 H3K9Me3ピークコールでは、SICER(バージョンV1.1)をパラメータ”-w200-g3″とともに使用しました。98はh3K9Me3ピークと呼ばれ、カットオフFDRが1%以上であった。
“H3K9Me3山脈”の同定のために、各h3K9Me3ピークの百万当たりカウント（CPM）でH3K9Me3信号を計算しました。 次に、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ３ピークを、ｈ３Ｋ９Ｍｅ３信号の増加の順にランク付けし、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ３チップ−ｓｅｑ占有率を、ＣＬＯＣＫ＋／＋およびＣＬＯＣＫ−／−ＨＭＳＣでプロットした（補足情報、図１ ４Ａ）。 S4f.これらのプロットは、H3K9Me3占有信号が急速に増加し始めた明確なポイントを示しました。 次に、これらの曲線の変曲点を決定した。 さらに、変曲点の上のH3K9Me3ピークを”H3K9Me3山”と定義し、それらの点の下のH3K9Me3ピークを典型的なH3K9Me3ピークと定義しました。
ATAC-seq
ATAC-seqは前述のように実施した。手短に言えば、合計50,000個の細胞をPBSで2回洗浄し、溶解緩衝液(10mM Tris-HCl(pH7.4)、10mM NaCl、3mM Mgcl2、0.1%(v/v)Nonidet P40代替物)50μ lに再懸濁した。 次いで、核の懸濁液を５ ０ ０×ｇで４℃で１ ０分間遠心分離し、続いて、Ｔｒｕｅｐｒｅｐ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ Ｖ２ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｖａｚｙｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ）から５ ０μ ｌのｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘ（１ ０μ ｌの５×ＴＴＢＬ ｂｕｆｆｅｒ、４μ ｌのＴＴＥＭＩＸ、および３ ６μ ｌのヌクレアーゼフリー Ｈ２Ｏ）を添加した。 次いで、試料を３ ７℃で３ ０分間インキュベートした。 次いで、ライブラリーを増幅し、Ｔｒｕｅｐｒｅｐ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ Ｖ２ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｖａｚｙｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して精製した。 ライブラリの品質は、フラグメントアナライザを使用して評価した。 最後に、ライブラリーはイルミナHiSeq X-Tenプラットフォーム上で配列決定され、150bpの読み取り長さを持つペアエンド配列決定が行われました。
ATAC-seqデータ処理
ATAC-seqデータの処理のために、生の読み取りはTrim Galoreソフトウェア（バージョン0.4.5）（https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore）でトリミングされました。 トリミングされた読み取りは、Bowtie2（バージョン2.2。9)パラメータ”-X2000-N1-L25–no-mixed–no-discordant-t”を使用します。96の重複した読み取りは、MarkDuplicatesで削除されました。Picardツールのjarプログラム。 その後、読み取りはSAMtools（バージョン1.6）ソフトウェアでソートされました。 次に、各サンプルの3つの反復からの処理された読み取りをマージしました。 ＡＴＡＣ信号を可視化するために、各読取り値を２ ５ ０ｂｐ拡張し、各１ ０−ｂｐビンのＲＰＫＭ値によって読取りカウントを正規化した。 ATACピークコールでは、MACS2（バージョン2.1.1.20160309）がパラメータ”-nomodel–shift0–extsize250–call–summits”とともに使用されました。100q値<0.01を持つATACピークと呼ばれるだけが保持されました。 ＣＬＯＣＫ＋／＋で同定されたがＣＬＯＣＫ−／−ＨＭＳＣでは同定されなかったＡＴＡＣピークを「閉」ＡＴＡＣピークと定義し、ＣＬＯＣＫ−／−で同定されたがＣＬＯＣＫ＋／−ＨＭＳＣでは同定されなかったＡＴＡＣピークを「開」ＡＴＡＣピークと定義した。 使用されるATACピークのゲノム分布の推定annotatePeaks.pl homerソフトウェアのプログラム。101
配列決定データの再現性の評価
H3K9Me3ChIP-seqおよびATAC-seqデータの再現性を評価するために、複製間のユークリッド距離は次のように計算されました: 読み取りをカウントし、2kbのビンサイズでRPKMによって正規化しました。 次に、再現性を評価するために、R（バージョン3.5.1）でユークリッド距離を計算しました。 より低いユークリッド距離は、より高い相関を意味する。 DamID-seqデータの再現性を評価するために、主成分分析（PCA）は、R（バージョン3.5.1）で行われました。 RNA-seqデータの再現性を評価するために、散布図は、Deseq2と正規化された対数（rlog）-正規化された読み取りカウントに基づいて描かれ、複製間のピアソン相関係数＜8582＞＜2311＞動物実験＜2001＞＜9683＞奇形腫形成解析のため、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（６〜８週齢、Beijing Vital River Laboratory Animal Technologies Co. Ｍａｔｒｉｇｅｌ：ＭＴＥＳＲ（１：４）溶液中に３×１ ０ ６ＣＬＯＣＫ＋／＋またはＣＬＯＣＫ−／−ｈＥＳＣを注入した。 奇形腫は、さらなる分析のために注射の8-12週間後に収穫された。
hmsc移植アッセイのために、Lucを発現するレンチウイルスで形質導入された1×106CLOCK+/+またはCLOCK−/−hmscをヌードマウス（6-8週齢）のTA筋肉に注入した。 次いで、マウスをＤ−ルシフェリン（ＬＵＣＫ−１Ｇ，Ｇｏｌｄｂｉｏ）で処理し、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｐｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍ Ａ，ＵＳＡ）で撮像した。 生物発光画像は「自動」モードで取得した。 各グループは六つの生物学的複製を有していた。 統計的有意性は、両側の対のない学生のt検定によって評価された。
加齢に伴うクロックレベルの検出のために、異なる年齢のマウス（若い、1ヶ月、n=5マウス;古い、15ヶ月、n=10マウス）を安楽死させ、関節をRT-qPCR分析のため 統計的有意性は、両側の対のない学生のt検定によって評価された。
clockのレンチウイルス投与が老化関連症候群を軽減できるかどうかを評価するために、Luc（n=14マウス）またはCLOCK（n=13マウス）を発現するレンチウイルスを18ヶ月のマウス（SPF（Beijing）Biotechnologyから購入）の関節腔に注射し、8週間後に補充した。 トレッドミル実験は、LucまたはCLOCKを発現するレンチウイルスの最初の注射後15週間の時間に行われた。 詳細には、マウスを、トレッドミル（ＳＡ１ ０ １、ＳＡＮＳ）上で、５°の傾斜で、３日間、毎日２ ０分間訓練し、速度を０〜２ ０ｍ／分に加速した。 試験日に、マウスは0m/分の初期速度でトレッドミル上を走行し、その後速度を2m/分から20m/分に増加させた。 全体の走行時間は20分に設定されていました。 軽度の感電刺激の頻度を記録し、分析した（Ｌｕｃ、ｎ＝１ ４マウス；ＣＬＯＣＫ、ｎ＝１ ３マウス）。 マイクロCTスキャンは、最初の注射後16週間の時点で実施した（Luc、n=14マウス；CLOCK、n=13マウス）。 次いで、マウスを安楽死させ、組織学的評価（Ｌｕｃ、ｎ＝１ ４マウス；ＣＬＯＣＫ、ｎ＝１ ３マウス）およびｍＲＮＡ定量化（Ｌｕｃ、ｎ＝１ ２マウス；ＣＬＯＣＫ、ｎ＝１ ２マウス）のために関節を収集した。 統計的有意性は、両側の対のない学生のt検定によって評価された。
組織学および免疫組織化学
組織学的分析のために、収穫されたマウス関節を4％PFAで2日間固定し、14-21日間脱灰した後にパラフィンに埋めた。 切片（５μ ｍ）を、ｆａｓｔ ｇｒｅｅｎ ＦＣＦ（０.０ ２％）およびｓａｆｒａｎｉｎ Ｏ（０.０ ２％）で染色した。1%)製造業者の指示に従って。
免疫組織化学染色は、いくつかの修正を加えて、前述のようにDAB染色法を用いて行った。33,34,102最初に、スライドはキシレンおよびアルコールの異なった集中を使用してdeparaffinized、再水和させました。 抗原検索は、トリプシン（ZLI-9010、ZSGB-BIO）消化を用いて室温で20分間行った。 過酸化水素（3％）は、室温で10分間インキュベートすることによって内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックするために使用された。 次いで、スライドを１ ０％ロバ血清で室温で１時間遮断し、抗Ｐ１ ６抗体（Ａｂ５ ４ ２ １ ０、Ａｂｃａｍ、１：２ ０ ０）と４℃で一晩インキュベートし、二次抗体（ＰＶ−６ ０ ０ ２、ＺＳＧＢ−ＢＩＯ）と室温で１時間インキュベートし、ＤＡＢ染色（ＺＬＩ−９ ０ １ ７、ＺＳＧＢ−ＢＩＯ）を行った。
倫理宣言
本研究に関与した実験は、動物を含む研究のための倫理的承認のための申請様式の原則に従っており、動物学研究所（中国科学院）の施設動物 マウスの麻酔はイソフルランで行われ、安楽死はco2で行われ、その後子宮頸部脱臼が行われた。
統計解析
統計解析はGraph-Pad Prismソフトウェアを用いて行った。 データは、平均±ＳＥＭまたはＳＤとして提示される。 両側の対のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定との比較を行った。 P値(p)<0.05は統計的に有意であると定義した。
