注射可能なヒト組換えコラーゲンマトリックスは、心筋梗塞後の有害なリモデリングを制限し、心機能を改善する

スタディデザイン

ここでは、(i)組換えヒトコラーゲンi型およびIII型を用いて臨床的に関連するコラーゲンハイドロゲルを設計する研究を行った。(ii)rHCIおよびrHCIII材料の物理的性質を特徴づけ、比較する; （ｉｉｉ）マウスにおけるＭＩを治療するための材料の治療可能性を評価する；および（ｉ ｖ）ＲＨＣ治療の観察された治療効果の根底にあるメカニズムを同定する。 In vivo実験では、マウスにおけるLAD動脈結紮は、MIの臨床的に関連し、十分に確立された動物モデルとして選択されました。 機能的、組織学的、および分子的評価のために、群あたりの動物の数は、図の凡例で指定されているように、3〜15匹のマウスに最小化された。 マウスを無作為に処置群に割り当て、すべての分析を盲検で行った。

rHCマトリックスの調製と特性評価

0.1gの凍結乾燥コラーゲン（フィブロジェン由来のrHCIおよびrHCIII）を10mlの超純粋なddh2oに溶解して1％コラーゲン溶液を調製した。コラーゲン：CS：NHS：EDCの質量比が1：4：0.5：0.3の混合物。 材料は泡を加えないで同種の混合を可能にする封じられたシステムを使用して氷で準備された。 十分に混合した後、ｐＨを７に調整した。4NaOH(1.0N)によって。 ＣＳを含まない行列も同様に調製したが、ＣＳの体積を補償するためにＰＢＳを添加した。 Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５ ９ ４−ＮＨＳで標識されたマトリックスは、Ｎａｏｈ（ヒドロゲルあたり２ ５ｎｍｏｌの染料）を添加する前に、２ ０μ ｌの染料貯蔵溶液（ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍＬ）をゲルに添加し、続いて２ ０

材料粘度

粘度測定は、Brookfield R/S plus rheometer(Brookfield)を使用して37℃で行った。C25–2/30円錐スピンドルを使用して、材料（50μ m変位）を温度制御された台座上に圧縮した。 粘度は、３ ０分の時間にわたって５単位の剪断速度で予め設定された１／分単位の速度で傾斜回転ブロックを用いて測定した。

架橋度

示差走査熱量測定（DSC）実験を行い、架橋度を評価した。 簡単に説明すると、５℃分−１の走査速度を用いて、８〜８ ０℃の範囲のＱ２ ０ ０ ０示差走査熱量計（Ｔ Ａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で測定を行った。 コラーゲンマトリクス（5-20mg）は、ろ紙で表面乾燥し、アルミニウム蓋（Tzero）で密閉した; Ｔ Ａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）をアルミサンプルパン（Ｔｚｅｒｏ；Ｔ Ａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）中に入れた。 吸熱ピークの開始時に変性温度（Ｔ ｄ）を測定した。

水分含有量

水分含有量は、サンプルの湿潤重量（W0）を秤量し、PBS中で96時間4℃で平衡化して測定した後、室温で96時間真空乾燥し、乾燥質量（W）を得た。 次いで、ヒドロゲルの総含水量（Ｗ Ｔ）を、式に従って計算した。:

分解

酵素分解は、50-100mgのヒドロゲルを用いて5mlのタイプIコラゲナーゼ（PBS中10U/ml）に入れ、37℃で測定した。

材料気孔率

低温走査電子顕微鏡（Cryo-SEM）測定は、冷段サンプルホルダ、後方散乱電子検出器（BSE）、二次電子検出器（SE）を備えたTescan（モデル：Vega II-XMU）を用いて–50℃で行 孔径は、ImageJ（登録商標）ソフトウェアを使用して、サンプルの4〜6個のランダムな領域から少なくとも250個の個体から測定した。 細孔の直径は、直線ツールを用いて細孔の長手方向軸を用いて定量した。 画像の面積は、Ｔｅｓｃａｎ Ｖｅｇａ ＩＩ ｓｙｓｔｅｍ６ ５から得られたサイズスケールバーに対して調整した。

動物実験

すべての手順はオタワ大学動物ケア委員会によって承認され、国立衛生研究所ガイドFor The Care and Use Of Laboratory Animalsに従って実行されました。

MIモデル

MIは、9週齢の雌C57BL/6マウス（Charles River、マウスの数/群は図の凡例にある）で誘導され、確立されたプロトコルを用いて治療送達が行われた26,27。 マウスは麻酔（2％イソフルラン）、挿管され、心臓は第四肋間開胸術を介して露出した。 左前下行冠動脈（ＬＡＤ）を左心房から出芽のすぐ下に結さつした。 この手順は、動脈によって供給される領域の心筋ブランチングによって手術時に確認された心臓の前外側、後部、および頂端部分を含む大きなMIを結 手術の少なくとも一時間前に短時間作用型ブプレノルフィンを投与し，周術期鎮痛のために手術直前に長時間作用型ブプレノルフィンを皮下投与した。 ＭＩ（ベースライン）の１週間後に、マウスを無作為に割り当て、超音波誘導閉鎖胸部手順を用いて２ ７Ｇ針を介して５つの等量心筋内注射（各部位１ ０μ ｌ、合計５ ０μ ｌ）で送達したＰＢＳ（対照）、ｒＨＣＩ、またはｒＨＣＩＩＩマトリクスの処置を受ける。 注射器はマイクロマニピュレータ（VisualSonics）に固定されており、注射手順の前に、針とRMV scanheadプローブの両方が心臓の長軸に沿って整列されています。 超音波視野を介して、マイクロマニピュレータは、注射の送達のために心筋内の所望の位置にあった針先を位置決めするために使用される（補足図を参 1および補足ビデオ1）。 マウスは、治療後2日または4週間で終末麻酔によって殺され、心臓は、組織学および/または機械的特性の測定のために収集されました。

心エコー検査

経胸心エコー検査は、Vevo770システムを用いて707Bシリーズのリアルタイム微小可視化スキャンヘッドプローブ（VisualSonics）を用いてBモードで長軸ビューで行われた。 画像化は、左心室駆出率（ＬＶＥＦ）、分画面積変化（ＦＡＣ）、収縮終期容積（ＥＳＶ）、拡張終期容積（ＥＤＶ）、一回拍出量、および心拍出量を決定するために、処置注射前のベースライン（ＭＩの７日後） ＬＶＥＦ、ＥＳＶ、およびＥＤＶは、Ｈ ＦおよびＭＩ４ ４後の生存の臨床予測因子として使用されることに留意されたい。

Alexa-Fluor®594標識マトリックスのEx vivoイメージング

化学的にタグ付けされたrHCマトリックス（ヒドロゲルあたり25nmolの色素）を、上記のように梗塞したマウス心臓に注入した。 処置の２時間後、２日後および７日後に動物を死滅させ、心臓を回収し、ｉｖｉｓ（登録商標）スペクトル（Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ）によりｅ ｘ ｖｉｖｏで画像化して、心臓内のｒＨＣＩおよびｒＨＣＩＩＩ分布を可視化した（ 組織学のために、組織切片をアセトン中で調製し、次いでDAPIで染色し、その後、×20の最終倍率を有するLeica Aperio Versaスライドスキャナおよび1.5μ mの八段階のZスタックを用いたイメージングを行った。

ひずみ解析

経胸心エコー検査は、MX400シリーズリアルタイム微小可視化スキャンヘッドプローブ（VisualSonics）とBモードでVevo3100システムを使用して長軸ビューに行 画像化を、処置注射前のベースライン（ＭＩの７日後）および注射後２日後に実施して、大動脈弁閉鎖時（収縮期末を表す）における縦心内膜株を決定した。 治療注射のために標的化された境界領域に対応するセグメント５（前中位セグメント）の株を、Ｖｅｖｏ ＬＡＢ３． 実施される測定のための代表的な例は、補足図に含まれる。 すべての実験群に健康な（非梗塞）動物を加えた場合には、10。

心電図

心電図は、治療注射前（MI後7日）および注射後2日のベースラインでVevo3100システム（VisualSonics）を用いた心エコー検査と同時に得られた。 心電図はVevo LAB3.1.1からエクスポートされました。 ソフトウェア（ビジュアルトランスフォーメーション）。 ＰＲ、Ｑ Ｔ、およびＱＲＳ間隔の長さは、Ｉｍａｇｅｊソフトウェアを使用して決定した（補足表１）。

心筋の機械的性質

マウスは、治療後2日または28日に終末麻酔によって安楽死させ、心臓を収穫した。 瘢痕および境界領域を含む左心室の長方形片（2.5×5mm）を切除した。 組織の引張弾性率（ヤング率）を決定するために、試料を、１ ０ｍｍ ｍｉｎ−１のクロスヘッド速度を使用して、シリーズＩＸ／Ｓソフトウェアを装備したＩｎｓｔｒｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｔｅｓｔｅｒ（モデル３ ３ ４ ２、Ｉｎｓｔｒｏｎ）

組織学/免疫組織化学

心筋組織切片のスライドは、機械的特性測定に使用されなかった心臓のサブセットから調製した。 注射の２ ８日後に、心臓を回収し、ＰＢＳで灌流し、ＯＣＴ中に埋め込み、液体窒素中で急凍結した。 10μ mの切片をクライオスタットを用いて切断した。 瘢痕サイズを評価するために、組織切片を４％ＰＦＡ中で１時間固定し、Ｍａｓｓｏｎ’ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ手順（Ｓｉｇｍａ）で染色した。 オリンパスBX50顕微鏡で2倍の対物レンズを用いて撮影した画像と、マウスあたりの八つのセクションを用いて、遠隔壁の厚さを測定し、MIQuant software66を用いたミッドラインアーク法を用いて傷跡の大きさを決定した。 免疫組織化学のために、組織切片をアセトン中で20分間固定し、0.1％トリトンで10分間透過処理し、次いで10％血清中で室温で1時間ブロックした。 一次抗体を１ ０％血清中４℃で一晩適用し、次いでスライドをすすぎ、二次抗体で室温で１時間処理した後、蛍光装着培地（Ｄａｋｏ）を装着した。 血管および筋線維芽細胞の検出のためには、ＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３ １としても知られる；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ１ ０ １ ４ ５ ４，１：５ ０）およびα−ＳＭＡ（Ａｂｃａｍ５ ６ ９ ４，１：５ ０）が用いられる。:抗体を使用し、それぞれ、ＡＦ５ ９ ４抗ラット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａ１ １ ０ ０ ８、１：５ ０ ０）およびＡＦ４ ８ ８抗ウサギ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａ１ １ ０ ０ ７、１：５ ０ ０）で検出した。 Ｍ２マクロファージは、ＡＦ４ ８ ８結合抗ＣＤ２ ０ ６抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ１ ４ １ ７ １ ０、１：５ ０）によって検出された。 心臓トロポニンｉ染色のために、切片を、ＡＦ４ ８ ８標識小麦胚芽凝集素（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｗ１ １ ２ ６ １）と３ ７℃で１時間インキュベートし、続いてヤギ心臓トロポニンｉ一次抗体（Ａｂｃａｍ ａ ｂ５ ６ ３ ５ ７、１：２ ０ ０） 最後に、コネキシン４ ３染色のために、切片を、コネキシン４ ３／ＧＪＡ１（Ａｂｃａｍ ａ ｂ１ １ ３ ７ ０、１：４ ０ ０）および心臓トロポニンｉ（Ａｂｃａｍ ａ ｂ１ ８ ８ ８ ７ ７、１：２ ０ ０）一次抗体とインキュベートし、続いて、ＡＦ４ ８ ８抗ウサギ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａ１ １ ０ ０ ７、１：５ ０ ０）およびロバ抗ヤギＡ Ｆ５ ９ ４二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａ−１ １ ０ ５ ８、１：５ ０ ０）で検出した。 蛍光画像は、×20対物を有するZeiss Axioオブザーバー顕微鏡を用いて得られ、connexin43染色セクションのために、20×対物を有するLeica Aperio Versaスライドスキャナを使用した。 すべてのIHC染色について、マウスあたりの四つのセクションを分析し、境界ゾーン内の各セクション2-4の画像について、梗塞および遠隔領域を分析のた Ｈ＜９ ２ ４ １＞Ｅ染色では、組織切片を１ ０％ホルマリンで固定した。 次いで、切片を、最初にヘマトキシリンギル溶液No.2で7分間染色し、続いて酸アルコール分化、次いで0.5％エオシンを7分間染色し、続いて脱水した（Sigma製の全溶液）。 画像は、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｂ Ｘ５ ０顕微鏡で撮影した。 境界領域は、ＬＶの５ ０％が線維性瘢痕組織であるときに始まる梗塞領域のいずれかの側に直接隣接するＦＯＶとして指定された（補足図を参照されたい）。 概略的な描写のための11）。＜8870＞＜681＞Cx3Cr1-EGFPマウス実験＜4654＞＜4522＞rHC処理後の心筋への循環単核細胞の動員を評価するために、B6.129P-Cx3Cr1tm1litt/Jマウス（Cx3Cr1-EGFP）をJackson Laboratoryから購入した。 これらのマウスは、単球、樹状細胞、NK細胞、および脳ミクログリアで強化された緑色蛍光タンパク質を発現し、心臓への単核細胞の動員の研究のために報告されたモデルである67。 ＭＩの１週間後に、マウスは、上記のように、５ ０μ ｌのＰＢＳ、ｒＨＣＩ、またはｒＨＣＩＩＩの処置を受けた。 処置の２日後に動物を死滅させ、血液をＥＤＴＡ管に集めた。 また，ｐｂｓで心臓を潅流し，右心室と左心室の頂端領域を採取した。 組織をＨＢＳＳですすぎ、２で消化した。試料をＰＢＳで３回洗浄し、４ ０ ０ｇで５分間遠心分離し、単離された細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のために調製した。 細胞を、ＡＰＣ抗マウス／ヒトＣｄ１ １Ｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ１ ０ １ ２ １ １）、ＰＥ抗マウスＬｙ−６Ｇ／６Ｃ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ１ ０ ８ ４ ０ ７）、ＰＥ／Ｃｙ５抗マウスＦ４／８ ０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ１ ２ ３ １ １ １）、ＰＥ／Ｃｙ７抗マウスＣＤ３ ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ１ ０ ２ ７ １ ７）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７ ０ ０抗マウスＣＤ２ ０ ６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ１ ４ １ ７ ３ ３）、以下のメーカー推奨希釈液（0.Cd11B、Ly-6G/6C、CD38、およびCD206では1×106細胞あたり25μ g/L、F4/80では1×106細胞あたり1μ g/L）。 補足図を参照してください。 ソート/ゲーティング戦略のための12。

単球サブセットの細胞単離およびフローサイトメトリー

治療後2日間の注射マウスをco2吸入後に頚部脱臼により死亡させた。 血液を、５ ０ｍ Ｍ ＥＤＴＡ溶液中の心臓穿刺を通してマウスから収集し、Ｒｂｃを、製造業者のプロトコール（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ４ ２ ０ ３ ０ １）に従って、赤血球（ＲＢ Ｃ）溶解緩衝液で溶解した。 細胞を、Ｄｎａｓｅ ｉ（５ ０Ｕ／μ ｌ；Ｓｉｇｍａ Ｄ５ ０ ２ ５）、コラゲナーゼＩＩ型（４ ０ ０Ｕ／ｍｌ；Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ１ ７ １ ０ １ ０ １ ５）、コラゲナーゼＤ（０． ３ ７℃で１時間消化した後、単離された心臓細胞を７ ０μ ｍフィルターに通した。 最後に、収穫されたマウス脾臓を粉砕し、赤血球（RBC）溶解緩衝液とのインキュベーションに続いて70μ mフィルターを介して粉砕した。 細胞ペレットを４℃で５分間、×４ ０ ０ｇで遠心分離することによって収集した。 全ての組織から単離された細胞を、Zombie Aqua fixable viability色素（1:500、Biolegend423101）と共に室温で20分間インキュベートした。 次に、Ｆｃ受容体を、Ｔｒｕｓｔａｉｎ Ｘ試薬（１：１ ０ ０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ１ ０ ３ ３ １ ９）で室温で１ ０分間遮断した。 次いで、細胞を、ＣＤ４ ５−ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ７ ５ ０（１：１ ６ ０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ３ ０−Ｆ１ １）、Ｃｄ１ １Ｂ−ＰＥ／Ｃｙ７（１：８ ０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｍ１／７ ０）、Ｌｙ６Ｇ−Ｐｅｒｃｐ／Ｃｙ５．af488(1:50,バイオレジェンドra3-6B2),F480-Af647(1:およびＬｙ６Ｃ−ＢＶ４ ２ １（１：８ ０、Ｂ Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａ Ｌ−２ １）。 Ｂ Ｄ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩを使用してフローサイトメトリーを実施し、データをＦｌｏｗｊｏ Ｖ１ ０.５.２ソフトウェア（補足図を参照）で分析した。 ソート/ゲーティング戦略のための12）。 単離後の各組織の全生存細胞数を、血球計を用いたトリパンブルー排除によって決定した。 各白血球集団内の細胞の総数は、所与の細胞集団に対する生細胞の割合を用いて決定され、単離後にカウントされた生細胞の総数は、次いで、組織のmgま ゲーティング戦略：単一細胞は、Fsc-AおよびFSC-Hに基づいてゲーティングされた。 この生きた単一細胞集団から、白血球はＣＤ４ ５＋であった。 白血球サブセットは以下のように特徴付けられた: 好中球CD45+Cd11B+Ly6G+、Ly6C低単球CD45+Cd11B+Ly6G−F480−Ly6C-、Ly6C高単球CD45+Cd11B+Ly6G−F480−Ly6C+、マクロファージCD45+Cd11B+Ly6G−F480+、T細胞CD45+Cd11B−Ly6G−CD3+B220−およびB細胞CD45+Cd11B−Ly6G−CD3+B220−およびB細胞CD45+Cd11B−Ly6G-CD3+B220-cd11B-LY6G-Cd3-B220+。 血液F480発現のための注意は、ゲーティング戦略では使用されませんでした。 ゲートはアイソタイプ対照に相対的に設定された。

新生児心筋細胞研究

新生児ラット心室筋細胞（NRVMs）を確立されたプロトコール68を用いて新たに単離した。 ２日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ）から採取した左心室を、トリプシン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびコラゲナーゼＩＩ型（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）によって消化した。 単離された細胞を、10％FBS、19.4mMグルコース、2mM l-グルタミン、2U/mLペニシリン、0.8μ g/mLビタミンB12、10mM HEPES、および1×MEM非必須アミノ酸（Sigma-Aldrich）を補充したM-199培地（Life Technologies） 60分前めっきの二つのラウンドは、心臓線維芽細胞は、このようにNRVMsのための非接着集団を豊かに、皿の底に付着し、その間に行われました。 次に、非接着細胞（Nrvm）を24ウェルプレート（40,000細胞/cm2）内の異なるコラーゲンマトリックス上に播種した。 生存アッセイのために、3日間培養NRVMsは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニックエンドラベリング（TUNEL）アッセイを行った後、3時間50μ mの過酸化水素を含むM-199培地に供され、死んだ細胞は、三つのランダムな視野でカウントされた。

細胞培養

確立されたプロトコルを用いて、8-12週齢のC57BL/6J mice69から骨髄由来マクロファージを単離した。 マウスは、CO2吸入および頸部脱臼によって安楽死させ、脛骨を収集し、骨髄を単離するための媒体でフラッシュした。 骨髄単離物を繰り返しピペッティングして単細胞懸濁液を得、次いでこれを細胞ストレーナに通した。 新たに単離された細胞を、10％FBS、20％L929馴化培地、およびペニシリン-ストレプトマイシンを補充したDMEM中で1週間培養し、その後、rHCヒドロゲル上で3日間再 細胞を、２ ５ ０単位のコラゲナーゼｉ（Ｇｉｂｃｏ）を含有する３ｍ ＭのＣａｃｌ２ｈａｎｋ緩衝生理食塩水を使用して、ＲＨＣヒドロゲルから収集した。 マクロファージ偏光は、それぞれ、M1およびM2マクロファージを同定するためにCD86およびCD206（Biolegend）を使用してフローサイトメトリー（FACS Aria III;Becton Dickinson）によって評価した。 単核細胞単離のために、脛骨骨からの骨髄を上記のように収集した。 製造業者の説明書に従って、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ）を使用して、密度勾配遠心分離により単核細胞を精製した。 細胞を０で標識した。＜８ ８ ７ ０＞＜６ ８ １＞Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｓｓａｙ＜４ ６ ５ ４＞＜４ ５ ２ ２＞単核細胞を、６〜１ ２週齢のマウスの脛骨および大腿骨をフラッシングすることにより単離した。＜８ ８ ７ ０＞＜６ ８ １＞Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｓｓａｙ＜４ ６ ５ ４＞＜４ ５ ２ ２＞Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｓｓａｙ＜４ ６ ５ ４＞＜４ ５ ２ ２＞Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｓｓａｙ 細胞を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ）を製造業者の説明書に従って使用して、密度勾配遠心分離によって精製した。 単核細胞を計数し、ＤＡＰＩで標識した。 細胞を50,000細胞/cm2の濃度で24時間、異なる生体材料上に播種した。 データは、対照（非被覆ウェル、すなわち、非被覆ウェル）に対する相対的に表された。 ドナー間の細胞変動の影響を最小限に抑えるために、ＴＣＰＳ）を使用することができる。

マクロファージ遊走アッセイ

骨髄単核細胞を、10％FBS、20％L929馴化培地、およびPen/Strepを添加したDMEMで7日間培養し、骨髄由来マクロファージ（Bmdm）を生成し、 次いで、ＢＭＤＭＳ（２×１ ０ ５）を、増殖因子および血清を欠くＥＢＭ中に再懸濁し、１ ０ ０μ ｌのｒＨＣＩまたはｒＨＣＩＩＩで被覆したＴｒａｎｓｗｅｌｌプレート（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の上部チャンバに装填した。 底部チャンバは、上記のように完全なマクロファージ培地を含んでいた。 ２ ４時間後、挿入物を除去し、生体材料を通って遊走したＢｍｄｍの数を、Ｚｅｉｓｓ Ｚ１蛍光顕微鏡を使用して盲検で定量した。 データは、ドナー間細胞変動の影響を最小化するために、対照（非被覆ウェル、すなわち、ＴＣＰ）に対して発現された。＜８ ８ ７ ０＞＜６ ８ １＞マクロファージ偏光アッセイ＜４ ６ ５ ４＞＜４ ５ ２ ２＞Ｂｍｄｍを、上記のように、１ ０％ＦＢＳ、２ ０％Ｌ９ ２ ９馴化培地、およびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを７日間補充したＤＭＥＭ中で生成した。 マクロファージ活性化実験では、細胞を、ｍ１活性化のためにリポ多糖（１μ ｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）＋ＩＦＮ−γ（５ ０ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）で３日間、またはＭ２活性化のためにＩＬ−４（２ ０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＜９ ２ ４ １＞ｄ系） 全ＲＮＡを、製造業者のプロトコールに従って、Ｔｒｉ試薬（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して抽出した。 Ｓｍａｒｔｓｃｒｉｂｅ逆転写酵素（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ）およびｒａｎｄｏｍ ｈ ｅｘａｍｅｒ ｐｒｉｍｅｒ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて第１鎖ｃＤＮＡを合成した。 標的遺伝子ｍ ＲＮＡレベルを、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４ ８ ０ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｉ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）およびＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４ ８ ０Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価した。 プライマー対の配列は、補足表2に記載されている。 データは、ドナー間細胞変動の影響を最小限に抑えるために、コントロール（非コーティングされたウェル、すなわち、tcps）に対して相対的に発現した。

H2O2曝露後の生存

細胞を、10%FBS、20%L929馴化培地、およびPen/Strepを添加したDMEM中で7日間培養した。 7日目に、培地を0.5mM過酸化水素を含むDMEMに変更し、細胞を3時間培養した後、フローサイトメトリーによる分析のために7-AADで染色した。 データは、ドナー間細胞変動の影響を最小化するために、対照（非被覆ウェル、すなわち、ＴＣＰ）に対して発現された。

統計解析

統計解析はKaleida Graph4.5®を用いて行った。 全てのデータは平均±ＳＥＭとして提示される。 処置間のｉｎ ｖｉｖｏデータの比較のために、Ａ ＮＯＶＡを使用し、続いて多重比較のためのＨｏｌｍの補正を使用した。 瘢痕サイズは、治療群（ｒＨＣＩ、ｒＨＣＩＩＩ、およびＰＢＳ）およびベースラインＬＶＥＦを含む重回帰を使用して分析した。 ｐｂｓと比較したｒｈｃｉおよびｒｈｃｉｉｉは、ベースラインＬＶＥＦに加えて、梗塞サイズの有意な予測因子であった。 STATA多重線形回帰を使用したモデルの相関係数は0.6です。 インビトロNRVMでは、マクロファージおよび心臓線維芽細胞データを、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定または多重比較のためのＨｏｌｍの補正を伴う一方向Ａ ＮＯＶＡによって、図の凡例に規定されているように分析した。

報告概要

研究デザインに関する詳細は、この記事にリンクされているNature Research Reporting Summaryを参照してください。