潜在的な大腸がん治療としてのクローディン-1の抗体ターゲティング

CRCサンプル

遺伝子発現プロファイリングのために、我々は143人のコホートに含まれる143人の患者から143の腫瘍サンプルを選択した:前向きシングルセンター研究REGP(19人の患者)(GSE62322)、レトロスペクティブマルチセンター研究COSIVAL(68人の患者)および前向きマルチセンター研究バイオコロン(56人の患者)(Gse62080およびGse72970)。 これらの三つの研究のために、包含基準は、組織学的に証明された結腸腺癌、進行性および二次元測定可能な腫瘍(ステージIV)、18歳から75歳の間の年齢、および世界保健機関(WHO)のパフォーマンスステータス≥2であった。 任意の治療の前に、すべての患者は、原発腫瘍切除または内視鏡的生検のための手術を受けた。

ウェスタンブロット分析のために、前向き単一センター研究REGPから13個の追加の腫瘍サンプルを使用したが、143個のサンプルには含まれなかった。

免疫組織化学分析のために、CRCを有する52人の追加患者からの組織サンプルは、正常な粘膜、腺腫および腺癌のサンプルが同じ患者に利用可能であった場合にのみ、モンペリエ癌研究所の病理ファイルから遡及的に選択された。

ヒト組織サンプルを用いたすべての研究は、関連する倫理委員会によって承認され、すべての参加者は、研究の目的と方法について知らされ、登録前に書面によるインフォームドコンセントに署名しました。

遺伝子発現解析

大腸サンプル(REG/P試験では正常結腸、原発腫瘍および肝metastasisサンプル、COSIVALおよびBIOCOLON試験では原発腫瘍標本のみ)を、手術時に標準化された手順に従って収集し、高品質のRNAを得た。 0アレイ(Affymetrix Inc.、サンタクララ、カリフォルニア州)。

mCRCにおける抗体ベースの治療のための新しい治療標的を同定するために、我々は、正常粘膜(n=17)、原発腫瘍(n=20)および肝metastases(n=19)組織サンプルの遺伝子発現プロ

遺伝子発現プロファイルを比較する際にはCRCの異質性を考慮する必要があるため、原発腫瘍サンプル(n=143)は、三つの独立したグループによって提案されている遺伝子発現プロファイルに基づくCRC分子分類と最近のコンセンサス分類を用いて分類された。 手短に言えば、De Sousa E. ccs1(マイクロサテライト不安定性を有するCRC、MSI)、ccs2(染色体不安定性を有する癌、CIN)およびCCS3(新しいサブタイプ)の三つのクラスで腫瘍をグループ化する サダナンダム他 杯様、トランジット増幅(TA)、腸細胞、幹様、および炎症:細胞表現型に基づいて、五つの分子サブタイプを同定しました。 マリサ他 以下の主な特徴を持つ六つの分子サブタイプ(C1-C6)を記載しました: C1=CIN及び免疫経路の下方制御、C2=MSI、C3=変異KRAS、C4=幹細胞表現型様、C5=CIN及びWNT経路の上方制御、及びC6=CIN及び正常様遺伝子発現プロ 最後に、以前に公開された6つの署名から始めて、国際コンソーシアムは、4つのコンセンサスサブタイプ:MSI(CMS1)、canonical(CMS2)、metabolic(CMS3)、およびmesenchymal(CMS4)(レビュー用)の分類を提示した。 分子サブタイプによるCRCサンプル分布を、追加ファイル1:表S1に示す。

免疫組織化学分析

サンプルは、前述のように三つの組織コア(それぞれ直径0.6mm)を使用して組織マイクロアレイ(TMA)で組み立てました。 簡単に言えば、TMAの3μ mセクションは、脱パラフィン化され、傾斜アルコール中で再水和されました。 熱誘起抗原検索は、EDTA緩衝液(pH9)中のTMA切片を98℃の水浴中で20分間インキュベートすることによって行われた。 内因性ペルオキシダーゼ活性を中和した後、TMA切片を、ポリクローナル抗CLDN1抗体(JAY−8,Zymed laboratories Inc,C A,USA)または抗体希釈剤(Dako,Glostrup,Denmark)単独で6 0分間インキュベートした。 一次抗体結合を、Envision(登録商標)システムおよびDako Autostainer(登録商標)(Dako,Glostrup,Denmark)を使用して可視化した。 CLDN1陽性細胞の割合および染色強度(0、染色なし;1、黄色がかった;2、褐色;および3、暗褐色)を、個々のTMAスポットごとに評価した。<7775><6965>ウェスタンブロット分析<2404><5547>患者の腫瘍組織サンプルを、溶解緩衝液(150mM NaCl、10mM Tris pH7.4、1mM EDTA、1mM EGTA、1%SDS、1%Triton X-100、0.5%NP-40、2mM PMSF、100mM NaF、10mMオルトバナジン酸ナトリウム、10mmカクテルプロテアーゼ阻害剤錠剤10ml)中で直接粉砕した。Mixer Mill(登録商標)MM3 0 0Unit(Qiagen,valencia,C A)を使用した。 タンパク質濃度は、Bradford assay(Pierce Coomassie Plus Protein Assay)を用いて決定した。 次いで、5 0μ gの全タンパク質を1 2%SDS−PAGEによって分離し、ニトロセルロース膜上に移した(Watman(登録商標)Protran(登録商標)、孔サイズ0.45μ m)。 非特異的結合部位を、0.1%(vol/vol)Tween20(PBS-T)を含むPBS中の5%(wt/vol)非脂肪乳で室温で1時間ブロックし、次いで膜をポリクローナル抗CLDN1抗体(JAY-8)と4℃で一晩インキュベートした。 その後、膜を洗浄し、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体と1時間インキュベートした。Revelationは、化学発光システム(Amersham Biosciences)を用いて実施した。; β-チューブリン発現を正規化のために使用した。

細胞内タンパク質抽出

タンパク質抽出は前述のように行った。 各試料について、20μ mの厚さの切片をクライオトームで切断し、液体窒素中で混合し、マイクロ乳棒で穏やかに粉砕した。 細胞内タンパク質抽出のために、Proteoextract Subscellular Proteome Extraction Kitを製造業者の指示書(Calbiochem)に従って使用した。 細胞内画分(各1 0μ g/)を、1 2%SDS−PAGEゲル上に負荷した。 免疫ブロッティングは、以下の一次抗体:抗CLDN1(JAY−8)、−CD7 1(Invitrogen)、−ヒストンH3(Pierce)および−β−チューブリン(Sigma T4 0 2 6)を用いて上記のように行った。以下のヒトCRC細胞株を使用した:SW4 8 0(ATCC CCL−2 2 8)、SW6 2 0(ATCC CCL−2 2 7)、Caco−2(ATCC H T B−3 7)、Difi(C.Montagut,Department o f Medical Oncology,Hospital del Mar,Barcelosa,Spainからの贈り物)、HCT1 1 6(CCL−2 4 7)、およびLS1 7 4T(ATCC H T B−3 7)。ATCC CL−1 8 8)。 CLDN1陽性SW4 8 0細胞株(SW4 8 0−CLDN1)を得るために、SW4 8 0細胞を、ヒトCLDN1cDNAクローン(Invitrogen MGC collection)または空ベクター(pcDNA)で、JetPrimeTM transfection reagent(Polyplus−transfection Inc.、フランス)。 CLDN1陽性クローンは、geneticinの500μ g/mlの存在下でトランスフェクト細胞を成長させることによって選択されました。 CLDN1サイレンシングのために、SW6 2 0を、CLDN1に対するshRNA(Sw6 2 0Shcldn1)またはルシフェラーゼ(shluc、陰性対照)に対するshRNAを含有するpsirenベクターで形質導入した。 24時間後、細胞を1μ g/mL puromycinで選択し、安定したクローンをプールした。 すべての一過性トランスフェクションは、jetPRIME™transfection reagentを使用して行った。<7 7 7 5><6 9 6 5>抗CLDN1mAb6の産生f6<2 4 0 4><5 5 4 7>抗体産生のために、6〜8週齢の雌BALB/cマウス(Harlan,Gannat,France)を、2週間毎に一過性にcldn1cDNA(NIH−CLDN1細胞)をトランスフェク NIH-CLDN1細胞は、最初の注射のための完全なFreundのアジュバント(シグマ)と、他の四つの注射のための不完全なFreundのアジュバント(シグマ)と混合しました。 NIH-CLDN1細胞の静脈内ブースター注射は、第五の免疫後三ヶ月を与えられました。 三日後、免疫マウスからの脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞株P3-X63-Agと融合させた。8.653マウスハイブリドーマを生成する。 新しく生成されたクローンからの上清は、SW480-CLDN1およびSW480細胞(陰性対照)を使用して蛍光活性化細胞選別(FACS)によってスクリーニングした。 スクリーニング結果は、SW620およびSW620-shcldn1細胞を用いて追加スクリーニングを行うことにより確認した。 抗CLDN1ハイブリドーマ6F6クローンを選択し、希釈を制限することによってクローン化しました。 抗体アイソタイピングにより、6F6はIgg3Kであったことが示された。

すべての動物実験は、フランス政府の実験動物研究ガイドライン(協定CEEA-LR-12052)に準拠して行われた。

放射性標識およびSPECT-CTイメージング

雌無胸腺ヌードマウス(6-8週齢)をHarlanから購入した。 6つのF6mAbを、IODO−GEN(Pierce Chemical C O.)の方法。 1 6Mbq/5 0μ gの1 2 5I標識6F6の尾静脈注入後、全身単一光子放出断層撮影/コンピュータ断層撮影(SPECT/C T)画像を、4ヘッド多重化マルチピンホールNanospectカメラ(Bioscan Inc.(4 8、7 2および9 6時間)。 同時に、全身マイクロCT画像は、SPECTデータとの解剖学的共同登録のために取得されました。 再構築されたSPECTおよびCTデータを可視化し、Invivoscope(登録商標)を使用して同時登録した。<7775><6965>クローン原性アッセイ<2404><5547>結腸直腸癌細胞を6ウェルプレート(150、250または400細胞/ウェル)に播種し、37℃で一晩接着させた。 次いで、6F6mAbの有無にかかわらず1mlのRPMI(最終濃度:1 0 0μ g/ml)を各ウェルに添加し、細胞を6日間培養した。 抗体を含まない培地でさらに6日後、Celigo(商標)imaging cytometerおよび「Single colony velification」アプリケーションを使用してプレートを読み取った。 Celigo(商標)細胞量計は、明視野照明(Nexcelom Bioscience、M A、USA)を使用してウェルの画像を提供するbenchtop in situ細胞分析システムである。

三次元(3D)スフェロイド培養の確立

超低アタッチメント、丸底96ウェルプレート(コーニングCostar)は、スフェロイド形成のために使用されました。 SW4 8 0、SW4 8 0−CLDN1またはSW6 2 0細胞を5×1 0 4の密度で播種した。 細胞は24-72時間以内に3Dスフェロイドに集約され、マージされました。 ウェルの画像は、5×対物レンズを使用して位相差顕微鏡で撮影するか、または「Tumorosphere」アプリケーションを使用してCeligo(商標)imaging cytometerで撮影した。 細胞生存率は、Celltiter−Glo発光細胞生存率アッセイ(Promega,Madison,WI,USA)を用いて評価した。 各ウェルに1 0 0μ lのCelltiter Glo試薬を1 0分間添加した後、1 4 5 0Microbeta Trilux Luminescence microplate reader(Perkin Elmer)で発光を測定した。

スフェロイドにおける細胞周期および増殖分析

スフェロイドは、超低アタッチメント96ウェルプレートにウェルあたり1000個のDiFi細胞をめっきし、100μ g/mlの6F6mAbまたは無関係なmAb(retuximab)の存在下で5日間増殖させた。 細胞周期分析のために、細胞をペレット化し、トリプシン化し、PBSで洗浄し、7 5%エタノールに固定し、1 0 0μ g ml−1Rnase(Qiagen)の存在下で4 0μ g/mlのヨウ化プロピジウムで染色した。 細胞周期分布は、FL−3チャネルを使用したFC5 0 0Beckman Coulterフローサイトメーターで決定した。 細胞は、二重項を除外するために、DNA−パルス−ピーク対DNA−パルス領域を表示したドットプロット上でゲートされた。 細胞周期分布を、Flow Jo分析ソフトウェア(Treestar,FLOW JO,Ashland,OR,USA)を使用して図示した。

培養4日目に、5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)と細胞を24時間インキュベートすることによって細胞増殖を測定した。EdUは活性DNA合成中にDNAに組み込 次いで、細胞トリプシン化および7 5%エタノール/PBS中での固定/透過処理の後、組み込まれたEduを標識し、Click−it Edu Alexa Fluor4 8 8Flow Cytometry Assay Kit(Invitrogen)で検出した。 次いで、細胞を1μ g/mlの4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)とPBS/0.1%Triton X100中で37℃で30分間インキュベートした。 Celigo(商標)「Expression Analysis」(Target1+Mask)アプリケーションを使用して、蛍光シグナルを定量化し、データ分析を行った。 細胞をDAPI核染色を使用して同定し、DNA合成をEdu取り込みを測定することによって定量した。

マウス異種移植モデル

1.5×106SW620細胞または3×106DiFi細胞を培養培地に懸濁し、Harlanから6-8週齢の雌無胸腺ヌードマウスの右脇腹に皮下(s.c.)注入した。 腫瘍体積が約100mm3に達したとき、マウスを異なる群で無作為化し、0.9%NaClまたは6F6mAb(注射当たり15mg/Kg)のi.p.注射によって、最初の実験では週に二回、第二の実験では週に三回連続して治療した。 腫瘍を隔週キャリパーで測定し、体積を式:D1X D2x D3/2で計算した。<7775><6965>脾内肝コロニー形成モデル<2404><5547>各実験において、6-8週齢の雌無胸腺ヌードマウスの脾臓に200万個のルシフェラーゼ発現SW620細胞(SW620-LUC細胞) 細胞注射の2分後に脾臓を除去した。 注射後1日目に、マウスを10匹のマウスの2群に無作為に分け、15mg/kgの6F6mAbまたは0.9%NaClのいずれかでi.p.注射により、週に3回処置した。 転移性の形成および播種を評価するために、ルシフェリン(Camera Ivis Lumina II、PerkinElmer(登録商標))の注射後のルミネッセンスイメージングにより、週に1回、ルシフェラーゼ発現 手術後5週目に、マウスを屠殺し、肝臓を除去し、撮影し、肝表面上の肉眼的に見える転移を計数した。

統計解析

統計解析は、STATA13.0ソフトウェア(StataCorp)を使用して行いました。 遺伝子発現または免疫組織化学実験のために、群間の差をKruskall Wallis/Dunnの試験を用いて分析した。 CLDN1遺伝子発現と無増悪生存(PFS)と全生存(OS)の間の相関は、グループ全体(n=143患者)で、腫瘍分子サブタイプに従って評価した。 この目的のために、1 4 3人の患者を、CLDN1遺伝子発現の中央値に基づいて2つの群に分けた(すなわち、9. PfsおよびOS値を、Kaplan−Meier法を用いて比較し、生存分布間の差を、対数ランク検定を用いて評価した。

対になったt検定を用いて、in vitro実験における6つのF6mAbとのインキュベーションの効果を比較した。

in vivo実験では、線形混合回帰モデルを使用して、腫瘍の成長と注射後の日数との関係を決定しました。 モデルの固定部分には、移植後日数および異なる治療群に対応する変数が含まれていた。 モデルには相互作用項が組み込まれ、時間効果を考慮するためにランダムな切片とランダムな斜面が含まれていました。 モデルの係数は最尤によって推定された。 生存率は、注射の日から、腫瘍がKaplan–Meier法を用いて1500mm3の体積に達した日まで推定した。 生存曲線を対数ランク検定を用いて比較した。 肝コロニー形成実験では,群間の差をMann-Hhitneyu試験で評価した。 すべての実験について、P<0.05の場合、差は有意であると考えられた。

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