潜在的な大腸がん治療としてのクローディン-1の抗体ターゲティング

CRCサンプル

遺伝子発現プロファイリングのために、我々は143人のコホートに含まれる143人の患者から143の腫瘍サンプルを選択した：前向きシングルセンター研究REGP（19人の患者）（GSE62322）、レトロスペクティブマルチセンター研究COSIVAL（68人の患者）および前向きマルチセンター研究バイオコロン（56人の患者）（Gse62080およびGse72970）。 これらの三つの研究のために、包含基準は、組織学的に証明された結腸腺癌、進行性および二次元測定可能な腫瘍（ステージIV）、18歳から75歳の間の年齢、および世界保健機関（WHO）のパフォーマンスステータス≥2であった。 任意の治療の前に、すべての患者は、原発腫瘍切除または内視鏡的生検のための手術を受けた。

ウェスタンブロット分析のために、前向き単一センター研究REGPから13個の追加の腫瘍サンプルを使用したが、143個のサンプルには含まれなかった。

免疫組織化学分析のために、CRCを有する52人の追加患者からの組織サンプルは、正常な粘膜、腺腫および腺癌のサンプルが同じ患者に利用可能であった場合にのみ、モンペリエ癌研究所の病理ファイルから遡及的に選択された。

ヒト組織サンプルを用いたすべての研究は、関連する倫理委員会によって承認され、すべての参加者は、研究の目的と方法について知らされ、登録前に書面によるインフォームドコンセントに署名しました。

遺伝子発現解析

大腸サンプル（REG/P試験では正常結腸、原発腫瘍および肝metastasisサンプル、COSIVALおよびBIOCOLON試験では原発腫瘍標本のみ）を、手術時に標準化された手順に従って収集し、高品質のRNAを得た。 ０アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．、サンタクララ、カリフォルニア州）。

mCRCにおける抗体ベースの治療のための新しい治療標的を同定するために、我々は、正常粘膜（n=17）、原発腫瘍（n=20）および肝metastases（n=19）組織サンプルの遺伝子発現プロ

遺伝子発現プロファイルを比較する際にはCRCの異質性を考慮する必要があるため、原発腫瘍サンプル（n=143）は、三つの独立したグループによって提案されている遺伝子発現プロファイルに基づくCRC分子分類と最近のコンセンサス分類を用いて分類された。 手短に言えば、Ｄｅ Ｓｏｕｓａ Ｅ． ccs1（マイクロサテライト不安定性を有するCRC、MSI）、ccs2（染色体不安定性を有する癌、CIN）およびCCS3（新しいサブタイプ）の三つのクラスで腫瘍をグループ化する サダナンダム他 杯様、トランジット増幅（TA）、腸細胞、幹様、および炎症：細胞表現型に基づいて、五つの分子サブタイプを同定しました。 マリサ他 以下の主な特徴を持つ六つの分子サブタイプ（C1-C6）を記載しました: Ｃ１＝ＣＩＮ及び免疫経路の下方制御、Ｃ２＝ＭＳＩ、Ｃ３＝変異ＫＲＡＳ、Ｃ４＝幹細胞表現型様、Ｃ５＝ＣＩＮ及びＷＮＴ経路の上方制御、及びＣ６＝ＣＩＮ及び正常様遺伝子発現プロ 最後に、以前に公開された6つの署名から始めて、国際コンソーシアムは、4つのコンセンサスサブタイプ：MSI（CMS1）、canonical（CMS2）、metabolic（CMS3）、およびmesenchymal（CMS4）（レビュー用）の分類を提示した。 分子サブタイプによるＣＲＣサンプル分布を、追加ファイル１：表Ｓ１に示す。

免疫組織化学分析

サンプルは、前述のように三つの組織コア（それぞれ直径0.6mm）を使用して組織マイクロアレイ（TMA）で組み立てました。 簡単に言えば、TMAの3μ mセクションは、脱パラフィン化され、傾斜アルコール中で再水和されました。 熱誘起抗原検索は、EDTA緩衝液（pH9）中のTMA切片を98℃の水浴中で20分間インキュベートすることによって行われた。 内因性ペルオキシダーゼ活性を中和した後、ＴＭＡ切片を、ポリクローナル抗ＣＬＤＮ１抗体（ＪＡＹ−８，Ｚｙｍｅｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）または抗体希釈剤（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）単独で６ ０分間インキュベートした。 一次抗体結合を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）システムおよびＤａｋｏ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ（登録商標）（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して可視化した。 ＣＬＤＮ１陽性細胞の割合および染色強度（０、染色なし；１、黄色がかった；２、褐色；および３、暗褐色）を、個々のＴＭＡスポットごとに評価した。＜7775＞＜6965＞ウェスタンブロット分析＜2404＞＜5547＞患者の腫瘍組織サンプルを、溶解緩衝液（150mM NaCl、10mM Tris pH7.4、1mM EDTA、1mM EGTA、1％SDS、1％Triton X-100、0.5％NP-40、2mM PMSF、100mM NaF、10mMオルトバナジン酸ナトリウム、10mmカクテルプロテアーゼ阻害剤錠剤10ml）中で直接粉砕した。Ｍｉｘｅｒ Ｍｉｌｌ（登録商標）ＭＭ３ ０ ０Ｕｎｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃ Ａ）を使用した。 タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ）を用いて決定した。 次いで、５ ０μ ｇの全タンパク質を１ ２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜上に移した（Ｗａｔｍａｎ（登録商標）Ｐｒｏｔｒａｎ（登録商標）、孔サイズ0.45μ ｍ）。 非特異的結合部位を、0.1%(vol/vol)Tween20(PBS-T)を含むPBS中の5%(wt/vol)非脂肪乳で室温で1時間ブロックし、次いで膜をポリクローナル抗CLDN1抗体(JAY-8)と4℃で一晩インキュベートした。 その後、膜を洗浄し、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体と１時間インキュベートした。Revelationは、化学発光システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施した。; β-チューブリン発現を正規化のために使用した。

細胞内タンパク質抽出

タンパク質抽出は前述のように行った。 各試料について、20μ mの厚さの切片をクライオトームで切断し、液体窒素中で混合し、マイクロ乳棒で穏やかに粉砕した。 細胞内タンパク質抽出のために、Ｐｒｏｔｅｏｅｘｔｒａｃｔ Ｓｕｂｓｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを製造業者の指示書（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）に従って使用した。 細胞内画分（各１ ０μ ｇ／）を、１ ２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に負荷した。 免疫ブロッティングは、以下の一次抗体：抗ＣＬＤＮ１（ＪＡＹ−８）、−ＣＤ７ １（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、−ヒストンＨ３（Ｐｉｅｒｃｅ）および−β−チューブリン（Ｓｉｇｍａ Ｔ４ ０ ２ ６）を用いて上記のように行った。以下のヒトＣＲＣ細胞株を使用した：ＳＷ４ ８ ０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２ ２ ８）、ＳＷ６ ２ ０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２ ２ ７）、Ｃａｃｏ−２（ＡＴＣＣ Ｈ Ｔ Ｂ−３ ７）、Ｄｉｆｉ（Ｃ．Ｍｏｎｔａｇｕｔ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏ ｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｄｅｌ Ｍａｒ，Ｂａｒｃｅｌｏｓａ，Ｓｐａｉｎからの贈り物）、ＨＣＴ１ １ ６（ＣＣＬ−２ ４ ７）、およびＬＳ１ ７ ４Ｔ（ＡＴＣＣ Ｈ Ｔ Ｂ−３ ７）。ＡＴＣＣ ＣＬ−１ ８ ８）。 ＣＬＤＮ１陽性ＳＷ４ ８ ０細胞株（ＳＷ４ ８ ０−ＣＬＤＮ１）を得るために、ＳＷ４ ８ ０細胞を、ヒトＣＬＤＮ１ｃＤＮＡクローン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＭＧＣ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）または空ベクター（ｐｃＤＮＡ）で、ＪｅｔＰｒｉｍｅＴＭ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｎｃ．、フランス）。 CLDN1陽性クローンは、geneticinの500μ g/mlの存在下でトランスフェクト細胞を成長させることによって選択されました。 ＣＬＤＮ１サイレンシングのために、ＳＷ６ ２ ０を、ＣＬＤＮ１に対するｓｈＲＮＡ（Ｓｗ６ ２ ０Ｓｈｃｌｄｎ１）またはルシフェラーゼ（ｓｈｌｕｃ、陰性対照）に対するｓｈＲＮＡを含有するｐｓｉｒｅｎベクターで形質導入した。 24時間後、細胞を1μ g/mL puromycinで選択し、安定したクローンをプールした。 すべての一過性トランスフェクションは、jetPRIME™transfection reagentを使用して行った。＜７ ７ ７ ５＞＜６ ９ ６ ５＞抗ＣＬＤＮ１ｍＡｂ６の産生ｆ６＜２ ４ ０ ４＞＜５ ５ ４ ７＞抗体産生のために、６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｇａｎｎａｔ，Ｆｒａｎｃｅ）を、２週間毎に一過性にｃｌｄｎ１ｃＤＮＡ（ＮＩＨ−ＣＬＤＮ１細胞）をトランスフェク NIH-CLDN1細胞は、最初の注射のための完全なFreundのアジュバント（シグマ）と、他の四つの注射のための不完全なFreundのアジュバント（シグマ）と混合しました。 NIH-CLDN1細胞の静脈内ブースター注射は、第五の免疫後三ヶ月を与えられました。 三日後、免疫マウスからの脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞株P3-X63-Agと融合させた。8.653マウスハイブリドーマを生成する。 新しく生成されたクローンからの上清は、SW480-CLDN1およびSW480細胞（陰性対照）を使用して蛍光活性化細胞選別（FACS）によってスクリーニングした。 スクリーニング結果は、SW620およびSW620-shcldn1細胞を用いて追加スクリーニングを行うことにより確認した。 抗CLDN1ハイブリドーマ6F6クローンを選択し、希釈を制限することによってクローン化しました。 抗体アイソタイピングにより、6F6はIgg3Kであったことが示された。

すべての動物実験は、フランス政府の実験動物研究ガイドライン（協定CEEA-LR-12052）に準拠して行われた。

放射性標識およびSPECT-CTイメージング

雌無胸腺ヌードマウス（6-8週齢）をHarlanから購入した。 ６つのＦ６ｍＡｂを、ＩＯＤＯ−ＧＥＮ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ Ｏ．）の方法。 １ ６Ｍｂｑ／５ ０μ ｇの１ ２ ５Ｉ標識６Ｆ６の尾静脈注入後、全身単一光子放出断層撮影／コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ／Ｃ Ｔ）画像を、４ヘッド多重化マルチピンホールＮａｎｏｓｐｅｃｔカメラ（Ｂｉｏｓｃａｎ Ｉｎｃ．（４ ８、７ ２および９ ６時間）。 同時に、全身マイクロCT画像は、SPECTデータとの解剖学的共同登録のために取得されました。 再構築されたＳＰＥＣＴおよびＣＴデータを可視化し、Ｉｎｖｉｖｏｓｃｏｐｅ（登録商標）を使用して同時登録した。＜7775＞＜6965＞クローン原性アッセイ＜2404＞＜5547＞結腸直腸癌細胞を6ウェルプレート（150、250または400細胞/ウェル）に播種し、37℃で一晩接着させた。 次いで、６Ｆ６ｍＡｂの有無にかかわらず１ｍｌのＲＰＭＩ（最終濃度：１ ０ ０μ ｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加し、細胞を６日間培養した。 抗体を含まない培地でさらに６日後、Ｃｅｌｉｇｏ（商標）ｉｍａｇｉｎｇ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒおよび「Ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｙ ｖｅｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」アプリケーションを使用してプレートを読み取った。 Ｃｅｌｉｇｏ（商標）細胞量計は、明視野照明（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍ Ａ、ＵＳＡ）を使用してウェルの画像を提供するｂｅｎｃｈｔｏｐ ｉｎ ｓｉｔｕ細胞分析システムである。

三次元（3D）スフェロイド培養の確立

超低アタッチメント、丸底96ウェルプレート（コーニングCostar）は、スフェロイド形成のために使用されました。 ＳＷ４ ８ ０、ＳＷ４ ８ ０−ＣＬＤＮ１またはＳＷ６ ２ ０細胞を５×１ ０ ４の密度で播種した。 細胞は24-72時間以内に3Dスフェロイドに集約され、マージされました。 ウェルの画像は、５×対物レンズを使用して位相差顕微鏡で撮影するか、または「Ｔｕｍｏｒｏｓｐｈｅｒｅ」アプリケーションを使用してＣｅｌｉｇｏ（商標）ｉｍａｇｉｎｇ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで撮影した。 細胞生存率は、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて評価した。 各ウェルに１ ０ ０μ ｌのＣｅｌｌｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬を１ ０分間添加した後、１ ４ ５ ０Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で発光を測定した。

スフェロイドにおける細胞周期および増殖分析

スフェロイドは、超低アタッチメント96ウェルプレートにウェルあたり1000個のDiFi細胞をめっきし、100μ g/mlの6F6mAbまたは無関係なmAb（retuximab）の存在下で5日間増殖させた。 細胞周期分析のために、細胞をペレット化し、トリプシン化し、ＰＢＳで洗浄し、７ ５％エタノールに固定し、１ ０ ０μ ｇ ｍｌ−１Ｒｎａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）の存在下で４ ０μ ｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムで染色した。 細胞周期分布は、ＦＬ−３チャネルを使用したＦＣ５ ０ ０Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒフローサイトメーターで決定した。 細胞は、二重項を除外するために、ＤＮＡ−パルス−ピーク対ＤＮＡ−パルス領域を表示したドットプロット上でゲートされた。 細胞周期分布を、Ｆｌｏｗ Ｊｏ分析ソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，ＦＬＯＷ ＪＯ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を使用して図示した。

培養4日目に、5-エチニル-2′-デオキシウリジン（EdU）と細胞を24時間インキュベートすることによって細胞増殖を測定した。EdUは活性DNA合成中にDNAに組み込 次いで、細胞トリプシン化および７ ５％エタノール／ＰＢＳ中での固定／透過処理の後、組み込まれたＥｄｕを標識し、Ｃｌｉｃｋ−ｉｔ Ｅｄｕ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４ ８ ８Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で検出した。 次いで、細胞を1μ g/mlの4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)とPBS/0.1%Triton X100中で37℃で30分間インキュベートした。 Ｃｅｌｉｇｏ（商標）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ」（Ｔａｒｇｅｔ１＋Ｍａｓｋ）アプリケーションを使用して、蛍光シグナルを定量化し、データ分析を行った。 細胞をＤＡＰＩ核染色を使用して同定し、ＤＮＡ合成をＥｄｕ取り込みを測定することによって定量した。

マウス異種移植モデル

1.5×106SW620細胞または3×106DiFi細胞を培養培地に懸濁し、Harlanから6-8週齢の雌無胸腺ヌードマウスの右脇腹に皮下（s.c.）注入した。 腫瘍体積が約100mm3に達したとき、マウスを異なる群で無作為化し、0.9％NaClまたは6F6mAb（注射当たり15mg/Kg）のi.p.注射によって、最初の実験では週に二回、第二の実験では週に三回連続して治療した。 腫瘍を隔週キャリパーで測定し、体積を式：D1X D2x D3/2で計算した。＜7775＞＜6965＞脾内肝コロニー形成モデル＜2404＞＜5547＞各実験において、6-8週齢の雌無胸腺ヌードマウスの脾臓に200万個のルシフェラーゼ発現SW620細胞（SW620-LUC細胞） 細胞注射の２分後に脾臓を除去した。 注射後1日目に、マウスを10匹のマウスの2群に無作為に分け、15mg/kgの6F6mAbまたは0.9％NaClのいずれかでi.p.注射により、週に3回処置した。 転移性の形成および播種を評価するために、ルシフェリン（Camera Ivis Lumina II、PerkinElmer（登録商標））の注射後のルミネッセンスイメージングにより、週に1回、ルシフェラーゼ発現 手術後5週目に、マウスを屠殺し、肝臓を除去し、撮影し、肝表面上の肉眼的に見える転移を計数した。

統計解析

統計解析は、STATA13.0ソフトウェア(StataCorp)を使用して行いました。 遺伝子発現または免疫組織化学実験のために、群間の差をＫｒｕｓｋａｌｌ Ｗａｌｌｉｓ／Ｄｕｎｎの試験を用いて分析した。 CLDN1遺伝子発現と無増悪生存（PFS）と全生存（OS）の間の相関は、グループ全体（n=143患者）で、腫瘍分子サブタイプに従って評価した。 この目的のために、１ ４ ３人の患者を、ＣＬＤＮ１遺伝子発現の中央値に基づいて２つの群に分けた（すなわち、９． ＰｆｓおよびＯＳ値を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を用いて比較し、生存分布間の差を、対数ランク検定を用いて評価した。

対になったt検定を用いて、in vitro実験における6つのF6mAbとのインキュベーションの効果を比較した。

in vivo実験では、線形混合回帰モデルを使用して、腫瘍の成長と注射後の日数との関係を決定しました。 モデルの固定部分には、移植後日数および異なる治療群に対応する変数が含まれていた。 モデルには相互作用項が組み込まれ、時間効果を考慮するためにランダムな切片とランダムな斜面が含まれていました。 モデルの係数は最尤によって推定された。 生存率は、注射の日から、腫瘍がKaplan–Meier法を用いて1500mm3の体積に達した日まで推定した。 生存曲線を対数ランク検定を用いて比較した。 肝コロニー形成実験では，群間の差をＭａｎｎ-Ｈｈｉｔｎｅｙｕ試験で評価した。 すべての実験について、P<0.05の場合、差は有意であると考えられた。