血液細胞集団における環状RNAの差動発現と小児急性リンパ芽球性白血病におけるcircRNA規制緩和の探索
B細胞、T細胞および単球集団におけるcircrnaの発現
高深度リボデプレットを用いて、健常ドナーのB細胞、T細胞および単球集団におけるCircRNAの発現を調べた。12サンプルのrna-seqデータ、ソートされた細胞の各集団のための4つの複製 末梢血単核細胞から、Ｐｂｍｃｓ（ＧＥＯシリーズＩＤ：ＧＳＥ１ １ ０ １ ５ ９；補足方法および補足表１）。
CircRNA定量化と注釈は、最も信頼性の高いバックスプライスを得るために、9つのcircRNA検出ソフトウェアツール（CIRI226Findcirc27;Circexplorer228on BWA29、STAR30、Segemehl31およびTophat232アライナ;DCC33;circrna_finder34;およ 実際、ｃｉｒｃＲＮＡ検出のための２つ以上のアルゴリズムからの共有出力は、偽陽性予測を減少させることが実証されている３ ５、３ ６。 CirComParaは、アダプタトリミング、読み取り平均品質選択、読み取り長さによるフィルタリングなどの読み取り前処理品質フィルタを実行します。 さらに、CirComParaは、circRNAのホスト遺伝子から発現された線形転写産物の発現を推定するために、各circRNAの逆splice接合に整列した線形スプライシングされたリードをカウン これらの値を、循環式と線形アイソフォームの間の発現の割合を計算するために、循環式を測定する逆乗算された読み取りカウントと組み合わせた（循環 さらに、CLPは循環から線形発現相関の概念を埋め込み、条件にわたるCLP変動は、circRNAとその宿主遺伝子の線形発現との間の独立性の速度を伝える33。
全体として、68,007個の個々の遺伝子から10,148個のcircrnaが少なくとも二つの方法によって検出された。 Hansenらによって報告されている。図36に示すように、アルゴリズムは主に高発現circrnaに一致したが、一つのアルゴリズムのみによって検出されたものは、一般的に低い読み取り数を有していた（補足図。 1).
さらに、少なくとも一つの細胞型のすべての生物学的複製において発現を示す6,228個のcircRNA（3,323遺伝子由来）のサブセットを検索し、「高信頼性」（HC）circRNAと 本研究で報告されたｃｉｒｃＲＮＡとＮｉｃｏｌｅｔらの結果との比較。17は、以前の研究で取得された489のHC circRNAの83％の一致を確認し、血球集団における発現変動についてまだ調査されていない5,824の追加のHC circRNAを開示した（補 2A）。＜９ ６ １ ３＞＜３ ９ ８ ９＞６，２ ２ ８個のＨ Ｃ ｃｉｒｃＲＮＡのうち、５，９ ７ ０および５，８ ２ １がＢ細胞およびＴ細胞で発現され、５，１ ４ ４が単球で発現された（図３）。 1a）。 Circrnaの大部分（4,763;80％）は、ユビキタスcircznf60937、circhipk338と新規circrnaを含むすべての三つの細胞型で検出されました。 新しいcircrna（例えばcircPICALM）は、造血コンパートメントに特異的である可能性が高い。 Circrnaは、リンパ球の間で主に共通の二つの細胞型によって共有されます。
B細胞、T細胞および単球のcircRNAomeの比較。 （ａ）Ｂ−、Ｔ−細胞および単球において発現された６，２ ２ ８個の高信頼性（Ｈ Ｃ）ｃｉｒｃＲＮＡの重複；（ｂ）Ｈ Ｃ ｃｉｒｃＲＮＡ発現プロファイルの主成分分析；（ｃ）Ｒｎａｓｅ ｒ処理後の検証されたｃｉｒｃＲＮＡ。 Ｂ２Ｍ、ＧＡＰＤＨおよびＨＰＴＲ ｍＲＮＡは、陽性対照として示され；相対発現は、２−μ Ｃｑとして計算され、ここで、μ Ｃｑは、Ｒｎａｓｅ ｒ処理されたＲＮＡと総ＰＢＭＣ ＲＮＡとの間の差である；（ｄ）全体的に、および各細胞型で発現された遺伝子あたりのｃｉｒｃＲＮＡの数である。
教師なし主成分分析は、同じ細胞集団の複製内でのcircRNA発現プロファイルの比較的小さな変化を示し、細胞型を明確に区別するcircrnaの違いを指摘した（Fig. 1b）。＜９ ６ １ ３＞＜３ ９ ８ ９＞２ １個のＨ Ｃ ｃｉｒｃＲＮＡの発現は、異なる健康なドナーのＰｂｍｃにおけるＲＴ−ＰＣＲによって検証された（補足表３；表１；図１）。 1c）。 この検証には、15の異なる遺伝子、IKZF1の二つの代替アイソフォームとy染色体、一つのcircRNA（18から男性特異的ZFYのからエキソニックcircrnaが含まれていました:63280887-63281214:−)328bpのユニークな大きなBCL2イントロンの環状化、および推定される新しい遺伝子（”遺伝子間”、以下を参照）からの一つのcircRNAから誘導される。 Circrnaの円形構造は、RNase r処理後のcircrnaの観察された濃縮によって確証され、逆splice接合に特異的な発散プライマーを有するqRT-PCRによって検出された14,27。 さらに、すべての予測された逆splice接合は、Sanger配列決定によって確認された。
新しい遺伝子からの複数の環状アイソフォームとcircrna
ほぼすべてのcircrna（99.4％）は、注釈された遺伝子に由来し、よく知られているエクソン（98.9％）と重複する イントロン領域の両端を持つ71circrnaのうち、最も豊富なものは、検証されたリンパ球特異的circbcl2、circHLA-E、circrassf3、およびいくつかのcircmbl1アイソフォームが含まれていた。
circRNA宿主遺伝子のほぼ半分は、それぞれ複数の（最大20個の）環状アイソフォームを発現していた（図3）。 1d）。 優先的なバックスプレスジャンクションの使用と一つまたはいくつかの流行しているアイソフォームの発現が観察された。 アイソフォームの最大数は、AGTPBP1（20）とPICALM（15）によって単球で、ubap2（19）とATM（17）によってリンパ球で発現していた。
遺伝子間領域に由来する三十から四circrna。 異なる組み合わせで同じbacksplice末端を使用して遺伝子間circrnaは、複数のアイソフォームを発現する三つの遺伝子座を同定した。 ２領域における推定される新規遺伝子に由来する５つの「遺伝子間」ｃｉｒｃＲＮＡ（ＣＨＲＸ：６ ５ ０ ５ １ ４ ６ ２−６ ５ １ １ ３ ８ １ ３）（補足図１ ４）（Ｃ Ｈ２Ｃ Ｈ２Ｃ Ｈ２Ｃ Ｈ２Ｃ Ｈ２Ｃ Ｈ２Ｃ Ｈ２Ｃ Ｈ２Ｃ Ｈ２Ｃ Ｈ２Ｃ Ｈ２Ｃ Ｈ２Ｃ Ｈ２Ｃ Ｈ２Ｃ Ｈ２Ｃ Ｈ２Ｃ Ｈ２ 3). 遺伝子座の中で最も豊富なｃｉｒｃＲＮＡであるｃｉｒｃＸ（遺伝子間）（Ｘ：６ ５ ０ ５ １ ４ ６ ２−６ ５ ０ ７ ５ ９ １ ２：＋）は、Ｍｅｍｃｚａｋおよびｃｏｌｌｅｇｕｅｓ１ ２によって血液中で以前に検出されたものであることが検証された（図１ ２）。 1c）。
次に、逆splice接合部と重複する線形転写物に関して、表現がどの程度循環に有利であるかを調べました。 CLP値は0から1の範囲である：0は、環状発現が検出されないときに来て、0<CLP<0.5は、それぞれの線形アイソフォームよりも豊富に発現しないcircrnaを表し、0.5は、環状および線形転写物が同等の存在量を有することを意味する、0。5<CLP≤1は、それぞれの線状転写物よりも豊富に発現される環状アイソフォームを示す。 特に、ｃｉｒｃＲＮＡに対する線形発現が検出されない場合、ＣＬＰ＝１である。 興味深いことに、10circrnaの線形発現は検出されませんでした。 さらに、CLPは非常に高かった(>0.95)14circrna(補足表4)、circgusbp2とcircnbpf10を含む、中央値CLP0.99から1すべての細胞集団(補足表4)、および単球(0.97)で高いCLPを示したcircaff2。 特定の遺伝子5、39および/または線形Rna16、40と比較して円形のより高い安定性の成熟した血液細胞における優先転写物の循環化は、これらの知見を説明
細胞型間の比較は、細胞型特異的circRNA発現と代替circularizationパターンを開示しました
次に、B細胞、T細胞および単球集団circRNAomesの違いを定義することを目的としました。 3つの集団のペアワイズ比較は、全体的な1,369有意に差動880遺伝子に由来する細胞型（補足表5）の間でcircRNA（Dec）を発現同定しました。 DEC発現プロファイルの階層的クラスタリングは、各細胞型でアップレギュレートされたcircRNAのセットを反映していた（図10B）。 2a）。 ＤＥＣは、１つの細胞型において排他的にまたは過剰発現され、集団特異的ｃｉｒｃＲＮＡを示した（図１ ０Ｂ）。 Ｂ細胞の特徴は６ ２ ２個、Ｔ細胞の特徴は１ ８ ３個、単球の特徴は４ ３ ８個であった（合計で１，２ ４ ３個；補足表５）。 さらに、７ ２個のＤｅｃは、両方のリンパ球集団において上方制御された（図１ ０Ａ）。 2b-d）。 遺伝子オントロジー用語の有意に濃縮されたKEGG経路は、それにもかかわらず、Sos2とNF Κ B1などのB細胞受容体シグナル伝達経路に関与する遺伝子を含 逆に、T細胞特性circrnaを発現する遺伝子は、T細胞受容体シグナル伝達経路を有意に濃縮した。 さらに、単球特徴的なcircrnaの遺伝子は、単球機能に関連するいくつかの生物学的プロセスおよび経路を有意に濃縮した。 代わりに、他の細胞型特徴宿主遺伝子は、起源細胞に直接リンクされていない細胞機能を有していた（補足表6）。
成熟した血液細胞集団におけるｃｉｒｃＲＮＡの差動発現。 (a)階層クラスタリング(ユークリッド距離; 完全なクラスタリング）1,369の発現プロファイルの有意に差動circrna（DECs）細胞型間で発現しました。 （ｂ）各集団において過剰発現されたｃｉｒｃＲＮＡの重複を示すベン図：非交差部分は、細胞型特異的な過剰発現ｃｉｒｃＲＮＡを概説する。 （ｃ）１つの細胞型でのみ過剰発現されるＤｅｃの宿主遺伝子：交差領域は、異なる細胞型で過剰発現される異なる環状アイソフォームを発現する遺伝子を表 （ｄ）単球（Ｍ）、Ｔ細胞（Ｔ）、Ｂ細胞（Ｂ）または両方のリンパ球集団（Ｔ＋Ｂ）において有意に過剰発現される１ ５個のｃｉｒｃＲＮＡの発現のｑＲＴ−ＰＣＲ検証。 ＲＮＡ-ｓｅｑデータと一致して，ｃｉｒｃｚｆｙおよびｃｉｒｃｇｒｈｐｒは有意に差動的に発現しなかった。 Backspliceに関与する遺伝子エクソンは、circRNA名の後に括弧内に表示されます。 Ｂ細胞の平均に対する発現。 マン-ホイットニー U検定,p値* < 0.05, ** < 0.01.
細胞型特性circRNAセットは互いに素であったが、特定のアイソフォームを発現する遺伝子セットの重複は、代替の細胞型特異的な循環パターンを示した。 注目すべきは、37個の遺伝子が2つの細胞型に特徴的なcircRNAを発現し、複数の細胞型特異的なcircRNAを有する遺伝子の14.7％を占めていたことである（図1）。 2c）。 四つのcircakt3アイソフォームは、b細胞のための三つとT細胞のための一つ、細胞型特異的な発現を示した;また四つのcircmbnl1は、b細胞のための3と単球のための さらに、六つの異なるGRK3環状アイソフォームは、B細胞で特異的に過剰発現されたが、他の二つは単球でのみ過剰発現された。
5つの独立した健康なドナーからソートされたB細胞、T細胞および単球におけるqRT-PCRによる定量化は、試験された15すべてのcircrnaについてRNA-seqの結果を確認し、データの堅牢性および再現性を支持している（図。 2dおよび補足図。 4).
circaff3(エクソン4-6)、circil4r(エクソン6-7)、circsetbp1(エクソン2)を含む5つのcircrnaのB細胞における有意なアップレギュレーションが確認された。 また、PAX5を含むゲノム領域9p13.2からの高いcircRNA発現（補足図。 5)が検証された：circpax5（エクソン2-5）とcirczcchc7（エクソン2）は、B細胞におけるcircGRHPRのアップレギュレーションの傾向はRNA-seqデータからの推定値と一致していたが、両方のB細胞特異的であった。 PAX5はB細胞41のコミットメントに顕著な役割を発揮し、PAX5とZCCHC7線形転写産物の共発現は、一般的なリンパ球前駆体からプレpro-B細胞42への進行 9月13日にメジャー契約を結んでアクティブ-ロースター入りした。2 locus, circPAX5, circZCCHC7 and circGRHPR isoforms were all overexpressed specifically in B-cells. CircPAX5 and circZCCHC7 were previously detected in CD19 + cells14. Both circZCCHC7 and circGRHPR were identified in CD34 + cells and, according to data on RNA base modification promoting efficient initiation of protein translation from circRNAs in human cells, are likely to encode peptides10.
Regarding T-cells, significant overexpression was confirmed for circIKZF1 (exons 2–3), circTNIK (exons 5–7), circTXK (exons 2–6) and, in agreement with previous reports17, for circFBXW7 (exons 3–4). Also an increasing trend for circZFY (exons 2–3) in T-cells and for circAFF2 (exon 3) in monocytes, in agreement with Nicolet et al.17, confirmed RNA-seq results, while significant upregulation of circX(intergenic) and circBCL2(intronic) in lymphocytes and of circHIPK3 (exon 2) in monocytes was validated.
Nicolet et al.17は、102のcircrnaが血球の種類および段階にわたって差動的に発現しており、そのうち98が私たちのデータで検出されました。 特に、４ ２個のｃｉｒｃＲＮＡは、我々の比較においても差動的に発現され、そのうちの３ １個は細胞型特異的であった。 全体的に、我々のデータは、ｃｉｒｃＲＮＡクラスターと一致して、以前に成熟細胞集団に関連していた（補足図１ ０Ａ）。 2b）。 以前にリンパ系細胞特異的クラスターに割り当てられたcircrnaは、我々が実験的に検証したcirczcchc7とcircfbxw7を含むB細胞またはT細胞で最高の発現を示した。 以前に単球特異的とみなされた10のcircRNAのうち9つは、circaff2を含む単球でより発現されている我々の分析によって想起された。 しかしながら、本研究において細胞型特異的として定義された１，２ ４ ３個のｃｉｒｃＲＮＡの大部分は、この研究において、細胞型特異的な過剰発現がｑＲＴ−ＰＣＲによって確 2d）は、Nicoletらによって定義されたクラスターでは表されなかった。
次に、線状発現に関する円形アイソフォームの存在量が細胞型間で変化したかどうかを調べました。 サンプル条件にわたるCLPの変化は、circRNAと宿主遺伝子の線形発現との間の独立性の速度を示している。 まず、我々は、より豊富な円形発現割合（CLP>0.5）とcircrnaの数がリンパ系細胞（単球で185、B細胞とT細胞で333と364、それぞれ）で最高であったことを観察し、circrna17のより小さ 次いで、宿主遺伝子非依存性発現を有する６ ８ ７個のｃｉｒｃＲＮＡ（４ ９ ５個の遺伝子から）を同定した（補足表７）。 DECsの中で、163は、細胞集団間でこれらのcircRNA発現レベルの観察された変化が線形発現の対応する変化によるものではないことを示す、差動絶対発現に一致して細胞型間の円形発現割合の有意な変化を有していた。 T細胞におけるアップレギュレーションが検証されたcircikzf1は、また、T細胞における高CLPで発現した。 特に、２ ５個のｃｉｒｃＲＮＡは、高い、有意に変化した円形発現割合を示した（補足図１）。 Ｂ細胞およびＴ細胞において全て過剰発現された、検証されたｃｉｒｃＸ（遺伝子間）および３つの追加の遺伝子間ｃｉｒｃＲＮＡを含む。 ＣｉｒｃＳＭＡＲＣＡ５は、Ｂ細胞で最も高い絶対的および相対的な円形発現を有し、一方、ｔ細胞では有意に低く、単球では最も低かった（補足図１ ４Ａ）。 7).
B細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病の六つの細胞遺伝学的サブタイプにおけるcircrnaの発現
上記のトランスクリプトーム全体のcircRNAリソースから出発して、bcp-ALLにおけるcircrnaの発現と可能な規制緩和を、circrnaの標的セットについて検討した。 選択されたｃｉｒｃＲＮＡは、リンパ球特異性および／または白血病関連遺伝子座に由来することを示した。 これらの基準に従って、Ｂ細胞、Ｔ細胞、または両方のリンパ球集団において、検証された上方制御を有する１ ０のｃｉｒｃＲＮＡが（図１ ０Ａ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞、または両方のリンパ球集団において、上方制御を有する。 既知の遺伝子（ＡＦＦ２、ＡＦＦ３、ＢＣＬ２、ＦＢＸＷ７、ＩＫＺＦ１、ＩＬ４Ｒ、ＰＡＸ５、ＳＥＴＢＰ１およびＺＣＣＨＣ７）からのｃｉｒｃＲＮＡおよびリンパ球中で高度に発現された新たに同定されたｃｉｒｃＸ（遺伝子間）を含む、ＢＣＰ−ＡＬＬでの定量 さらに、circZFYは、男性被験者の血液細胞において高レベルで発現するcircRNAである; 固形がんで発癌性が知られているcirchipk3 43、急性リンパ芽球性白血病に最近関連しているcircpvt1 22が含まれていました。＜９ ６ １ ３＞＜３ ９ ８ ９＞選択された１ ３個のｃｉｒｃＲＮＡの発現を、３ ２個のＢＣＰ−ＡＬＬ患者由来異種移植片（ＰＤＸ）試料中でｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した（補足表８）。
すべての白血病サンプルを一緒に、最初に健康なドナー由来のB細胞と比較した（補足図。 図8および図8。 白血病細胞における制御解除されたｃｉｒｃＲＮＡ発現をチェックする。 ７つのｃｉｒｃＲＮＡについて，発現はＢ細胞と比較して全ての試料で有意に異なっていた。 CircIL4R, circZCCHC7 and circX(intergenic), all highly expressed in lymphocytes, were less expressed in ALL. Conversely, overexpression of circAFF3, circHIPK3, circPVT1 and circPAX5 in BCP-ALL emerged. Differently from circPVT1 and circHIPK3, a functional characterization of circPAX5 and circAFF3 is still lacking. Thus, custom functional predictions, in terms of possible miRNA- binding sites, RNA binding protein (RBP) binding sites, and coding potential were obtained (Fig. 3b and Supplementary Fig. 9).
患者由来BCP-すべてのサンプルおよびcircaff3およびcircpax5の予測された機能におけるCircRNA発現。 （ａ）異なる遺伝サブタイプを有する健康なＰＢＭＣ由来Ｂ細胞および３ ２個のＢＣＰ−すべての患者由来異種移植片試料中のｑＲＴ−ＰＣＲによって評価された１ ２個のｃｉｒｃＲＮＡの相対的発現：ＭＬＬ再配列（ｎ＝４）、ＢＣＲ−ＡＢＬ（３）、ＥＴＶ６−ＲＵＮＸ１（６）、ＴＣＦ３−ＰＢＸ１（４）、高多倍体（＜５ ５ ７ ７＞５ ０本の染色体、７）、「その他」（上記の再配列については陰性、８）。 B細胞に対する発現。 有意なp値のみ(<0.０ ５）を示す（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ、ＫｒｉｅｇｅｒおよびＹｅｋｕｔｅｌｉ手順による複数の試験のために補正された）。 「Ｂ細胞」上のｐ値は、Ｂ細胞対すべてのＢＣＰ−すべてのサンプルを指す（Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ−検定、有意な値のみが示される）。 (b)機能と予測miRNA結合部位を含むcircaff3とcircpax5の相互作用の予測、おそらくRNA結合タンパク質（RB）とバックプライスにまたがる少なくとも150ntのオープンリーディングフレーム（Orf）によって認識される配列モチーフ。
さらに、本発明者らは、主要なＢＣＰ−ＡＬＬ細胞遺伝学的サブタイプ全体にわたるｃｉｒｃＲＮＡの標的セットの発現を検討した（図１ ０Ａ）。 3a）。 細胞遺伝学的サブタイプは、再発転座（MLL再編成、BCR/ABL、ETV6-RUNX1、およびTCF3-PBX1融合）および多倍体核型を含む特定の遺伝的病変によって特徴付けられる。 細胞遺伝学的サブタイプの特性評価は、白血病患者のリスク予後および治療層別化のために尽力している。 異なるサブタイプの白血病細胞は、異なる生物学的特徴、遺伝子発現プロファイルおよび特異的なmiRNAシグナルを有する44、45。 これに関連して、急性白血病の不均一性に関する新規な情報は、細胞遺伝学的サブタイプ間で観察された有意なｃｉｒｃＲＮＡ発現の相違によって追加された（図 3a）。 ＣＩＲＣＡＦＦ２は、Ｂ細胞および他の細胞遺伝学的ＢＣＰ−ＡＬＬサブグループと比較して、ＴＣＦ３−ＰＢＸ１ＢＣＰ−ＡＬＬで高度に発現され、より少ない程度で、ＥＴＶ６−ＲＵＮＸ１ＢＣＰ−ＡＬＬで発現された。 Circbcl2（イントロニック）は、ETV6-RUNX1融合とすべてでアップレギュレートされました。 Circsetbp1とcircX（遺伝子間）は、両方とも非常にMLL再配置されたサンプルで減少した。 Circikzf1は、発現がB細胞と同等のレベルで保存されたETV6-RUNX1サブタイプと比較してBCR-ABLと高二倍体白血病で低かった。
