難治性農薬クロルデコンの脱スルホビブリオsp.による形質転換|Scientific Reports難治性農薬クロルデコンの脱スルホビブリオsp.による形質転換|Scientific Reports86開環脱塩素から還元硫化活性へのスイッチを用いた
Desulfovibrio spの単離。86
Desulfovibrio sp.86は、硫酸還元条件を用いてクロルデコン分解コンソーシアム865から達成された。 クロルデコンを変換することができる細菌コンソーシアム86は、クロルデコンを添加したMM+5という濃縮鉱物培地（MM）から得られたので、主な化学組成は保 硫酸塩還元細菌を濃縮するために使用されるいくつかの培地製剤は、有機酸、例えば乳酸塩を炭素源およびエネルギー源（電子供与体）として利用し、そ これに関連して、ＭＭ＋液体培地中のピルビン酸塩を乳酸塩で置換し、硫酸塩を添加した（ＭＭＤ液体培地、「方法」の項を参照）。 濃縮をＭＭＤ寒天上に広げ、茶色のビブリオ様細菌コロニー（光学顕微鏡下で観察）を２つの追加の板状の縞を通してさらに精製した（図１ ０Ａ）。 S1）。 単離された細菌株はＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｓｐと同一であることが分かった。86コンソーシアム86から100％の16S rRNA遺伝子の同一性に基づいて（それぞれ1538bp）。
Desulfovibrio sp.のゲノム解析86
全ゲノムは単一の3,464,070bpの環状染色体で構成されています。 61のゲノムと284の系統で行われたCheckM分析19は、ゲノムがDeltaproteobacteriaに属し、CheckMの完全性が100％であることを示しています（必須マーカーの欠落はゼロ）。 DNAの平均G+C含量は58.06％である。 3,342コードDNA配列（CDSs）の合計は、染色体、4pseudogenesと10雑Rna（misc-RNA）、3rRNAオペロン、および54tRNA遺伝子のために予測されました。
Desulfovibrio sp.の3つの16S rRNA遺伝子。86は同一である。 彼らの最高のブラストヒット（NCBI）は、未培養のDesulfovibrio spからでした。 ＭＦＣ６ ３Ａ０ ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＦＪ８ ２ ３ ８ ６ ５；適用範囲９ ８％；同一性９ ９，８ ７％）などの微生物燃料電池からのクローン２ ０。 栽培可能な細菌の利用可能な16S rRNAを用いた系統樹は、Desulfovibrio spとの間の類似性を確認した。８ ６およびＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｓｉｍｐｌｅｘ ＤＳＭ４ １ ４ １（Ｇｅｎｂａｎｋ１ ６Ｓ ｒＲＮＡ受託番号：ＮＲ＿１ １ ７ １ １ ０；適用範囲９ ９％；同一性９ ９、２ ２％；ゲノム配列利用不可）（図８）。 2011年2月21日に発売。 ゲノムレベルでは、Desulfovibrio sp.86位はデスルフォビブリオ-デスルフィリカンスsubspである。 desulfuricans str. ATCC27,774ゲノム（GenBank：NC_011883）。 それにもかかわらず、Desulfovibrio sp.86株のみ1,408遺伝子(43%)d.desulfuricansと(80%以上のアミノ酸の同一性と80%アライメントカバレッジ). さらに、Desulfovibrio sp.間の平均ヌクレオチド同一性（ANI）。86および配列決定されたDesulfovibrioゲノムは、種の描写のために一般に受け入れられている95％ANIカットオフ値よりも低い（図。 2012年3月22日に発売。 これらの結果は，Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｓｐ．86はおそらくDesulfovibrio門の新種である。 二つのスーパーオキシドジスムターゼと一つのカタラーゼ遺伝子の存在は、その相対的な酸素耐性を説明します。 予想されるように、Desulfovibrio sp。86ゲノムは、電子受容体として硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩およびテトラチオン酸塩のような無機源と硫黄呼吸経路を包含する、硫黄代謝のための広範な遺伝子補体を示しています。 有機硫黄源は、硫黄バイオマス（スルホキノボシル脂質のスルホキノボース）スルホ酢酸、スルホアセトアルデヒドを介した硫黄非タンパク質性アミノ酸タウリン、またはアルカンスルホン酸塩23の発酵生成物によって提供されることがある。
Desulfovibrio sp.86はクロルデコンを既知の形質転換生成物に分解し、予想外の硫黄含有化合物
単離されたDesulfovibrio spのクロルデコン分解能力を低下させる。86株は、GC–MS（ガスクロマトグラフィー質量分析）とLC-HRMS（液体クロマトグラフィー高分解能質量分析）技術を用いて、Desulfovibrio spに正常に適用された成長条件で調べた。86分離（MMD液体媒体）。 Na2sは還元剤として使用され、嫌気性N2/H2（98/2;V/V）雰囲気は、グローブボックスシステムを使用して適用されました。 これらのインキュベーション条件は、GC–MSおよびLC-HRMSにおけるクロルデコンシグナルの完全な消失につながり、Citrobacter spで得られたものと同様のGC–MSおよびLC-hrms TPＢ１、テトラクロロインデンＢ３−Ｂ４およびポリクロロインデンカルボン酸Ｃ１−Ｃ２およびＣ３−Ｃ４（図８ ６ ６）。 1a、b）。 グローブボックスシステムでは、ガス交換を可能にし、汚染を避けるために、疎水性多孔質膜を有する100mLのガラスバイアルを用いて細菌培養を行った。 このインキュベーション条件は”リニューアル大気”条件（Ｒ ａ）と考えられた。 このシステムでは、大気はＮ２／Ｈ２（９ ８／２；Ｖ／Ｖ）で定期的に更新され、箱は恒温制御されなかったので、温度は２ ５℃と３ ３℃の間で変化した。密封されたバイアルを最初にＮ２／Ｈ２（９ ８／２；Ｖ／Ｖ）ガスでパージして嫌気性菌症を確実にした。 このインキュベーション条件を”閉じ込められた雰囲気”条件（Ｃ ａ）と考えた。
Desulfovibrio sp.によるクロルデコン変換のフルスキャンモード（任意のユニット）でのGC–MSおよびLC-HRMSモニタリング。86RA条件（グローブボックス、嫌気性菌（N2/H2、98/2、V/V）、室温、多孔質フィルムを有するオープンバイアル、40mg/Lのクロルデコンを添加したMMD培地中）、およびCA条件（オーブン、嫌気性菌（最初にN2/H2、98/2、V/Vでパージ）、30℃、密封バイアル、40mg/Lのクロルデコンを添加したMMD培地中）における。f1… (a)Desulfovibrio sp.によるクロルデコン形質転換のGC–MSモニタリング。RAの条件で86. (b)Desulfovibrio sp.によるクロルデコン形質転換のLC-HRMSモニタリング。RAの条件で86. (c)Desulfovibrio sp.によるクロルデコン形質転換のGC–MSモニタリング。CAの条件で86。 (d)Desulfovibrio sp.によるクロルデコン形質転換のLC-HRMSモニタリング。CAの条件で86。 In each graph, green circles represent chlordecone, red circles F1, blue triangles 10-monohydrochlordecone A1, pink squares 2,4,5,6,7-pentachloroindene B1 and purple diamonds 2,5,6,7-tetrachloroindenecarboxylic acid and 2,4,5,6-tetrachloroindenecarboxylic acid C1–C2. In RA conditions traces of B3-B4 and C3–C4 TPs were also detected. (e) Chlordecone transformation over the time in CA conditions, OD600 corresponds to the optical density at 600 nm in biotic conditions. (f) GC mass spectrum of F1 TP and its interpretation.
クロルデコンとの６週間のインキュベーション後，同じ分析法では農薬は検出できなかった。 同時に、F1という名前の単一の未知の塩素化化合物が現れた。 それは、ＧＣ−ＭＳ（２ ５.６分）を通してのみ検出可能であった（図１ ０Ｂ）。 1c）。 以前に報告されたクロルデコン分解培養5,6と同様に、主なクロルデコン変態は静止相の間に現れた（図。 1e）。 て見える塩素のピークを観測することもできるであろう液体クロマトグラフィー-HRMS。 図1d)に示すように、GC–MSデータの解釈に基づくF1の構造解明に基づいています(図1d)。 1階）。 M/z507.8を中心とするより高い同位体パターンが分子イオンを含んでいると仮定すると、我々はF1、C10Cl10O2h2とC10Cl10Sh2の二つの可能な中性式を仮定した。 インソースフラグメントは、クロルデコン、ヒドロクロルデコン、クロルデコールとmirex5、6、24を含むポリ塩化ビショモクバンベースの構造で観察されたものと非常に 実際、m/z201.0、235.9および271の同位体パターン。9は、おそらく既知のインソースbishomocubane retrocyclodimerizationから生じ、正に荷電したC5断片に対応していた。 同位体シミュレーションとの比較は、次のラジカルイオンに可能性を制限しました：+·+·と+·、n=0,1。 後者のビス酸素化された一般的な方式は粗いGCのクロマトグラフの条件（>200°C）に抵抗しなければならなかったcyclopentenylリングのgemジオール機能かgemクロロヒドリンの部分の存在を必要としたので非常にまずないことになった。 その代わりに、我々は、硫黄部分、すなわち結論しました。 ビショモクバン多環にはチオール機能が存在していたと考えられている。 私たちは、F1のために図に示す構造を提案しました。 2aおよび名前chlordecthiol、chlordecol（chlordeconeアルコール）の硫黄のアナログを提案しました。
化学標準クロルデクチオールの合成とその完全な特性評価。 （ａ）Ｃｄ２Ｃｌ２におけるクロルデクチオール合成およびＮＭＲシフトの化学反応スキーム：１Ｈ ＮＭＲシフト（斜体および下線）および１ ３Ｃ ＮＭＲシフト（太字）；同様に着色された (b)C10Cl10O2H-のm/zシミュレーション、(c)C10Cl10Sh-のm/zシミュレーション、(d)合成クロルデクチオールのネガモード(LC-HRMS)での高分解能質量スペクトルの抽出。
クロルデクチオール標準の合成と形質転換生成物F1がクロルデクチオール
と同一であることの確認F1の構造を確認するために、標準クロルデクチオールを化学的に合成し、完全に特徴付けた。 クロルデコンの化学還元硫化を達成するためには，二つのステップが必要であった。 最初のものは、対応するケトンform20,25との平衡におけるクロルデコンのgem-ジオール機能の硫黄アナログ、すなわちgem-チオール/チオカルボニル部分への変換 この工程を行うために、リン含有硫黄試薬が一般的に適用される26,27。 ここでは、カンフォルチオール29の合成に成功したZaidiと同僚のプロトコルに従って、berzelius reagent27,28とも呼ばれる脱硫リン（P4S10）を使用しました（図。 2a）。 第二段階は、Nabh4を用いたgem-チオール中間体の還元で構成されていた。 精製後、白色固体を全体の収率７ ３％で得た（図３）。 2a）。 1D-および2D-NMR分析は、クロルデクチオール構造を確認した：（i）二つの1H信号は、一つのプロトンのためにそれぞれを統合し、一緒に結合（δ3.78ppm、d、J=5.5Hzとδ2.01ppm、d、J=5.5Hz）、δ3.78ppmのものは、チオール機能の隣にあるCH部分を完全に説明するHSQC実験で13C信号シフトダウンフィールド（δ55.1ppm）に相関し、（ii）合計六つの目に見える現在のビショモクバン構造で保存されている対称面を反映する図13c信号（fig. 図２Ａ、図２ｂを参照。 S19–23)。 微生物形質転換では、F1は、開発された条件でLC-HRMSツールを使用して検出することができませんでしたが、合成標準クロルデクチオールの濃縮サンプルは、 硫黄原子の存在および予想される中性式Ｃ１ ０Ｃｌ１ ０Ｓｈ２が確認された（図１）。 Ｃ１ ０Ｃｌ１ ０Ｏ２Ｈ２は除外された（図２ｃ、ｄ）。 2b）。 最後に、ＧＣ−ＭＳ分析は、完全に一致することを実証した（すなわち、２ ５.６分の同じ保持時間および同じソース内質量スペクトル図）。 S6）合成標準とTP F1の間で、したがって間違いなくクロルデクチオールとしてそれを割り当てます。 実際、F1は、初めて硫黄原子を有するクロルデコンTPsの新しいファミリーの最初のメンバーを表しています。
Desulfovibrio sp.の能力。86クロルデコン変換生成物を分解する
化合物A1、B1、C1-C2およびF1Desulfovibrio spの存在下で形成される可能性のあるTPsの四つのファミリーを代表する。86は、以前に報告された化学プロトコール6に従って合成され、本明細書でF1のために開発された。 それらの各々をＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｓｐの存在下でインキュベートした。還元的硫化（密封されたバイアル;CA条件）または開環による脱塩素（開いたバイアル;RA条件）を促進することが示された条件で86培養する。 全ての試料のＧＣ−ＭＳおよびＬＣ−ＨＲＭＳの二重モニタリングを行った。
CA条件下で一ヶ月インキュベーションした後、10-モノヒドロクロルデコンA1はGC–MSを用いてかろうじて分離された二つの未知の塩素化化合物に完全に変換された（保持時間：24.3分F2および24.5分f3、図。 図3に示す。 S7-S11）。 それらは、F1断片化パターンと非常に類似していた同一のソース内質量スペクトルを示した（図。 S8）。 検出されたすべての供給源断片は、F1質量スペクトルにおいてそれらの類似体よりも少ない一つの塩素原子を有するようになった。 したがって、化合物F2およびF3は、10-モノヒドロクロルデクチオールのジアステレオ異性体であると仮定された（図。 3c）。 これは、１ ０−ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｄｅｃｏｎｅ Ａ１からの２つの１ ０−ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｄｅｃｔｈｉｏｌ標準の化学合成によって、以前にクロルデクチオールＦ１の合成に適用された手順を使用して確認された（図４Ａおよび図４Ｂ）。 S24–27)。 これらの化学標準は、生物学的Ｆ２およびＦ３と比較して、同じ保持時間（２ ４． S8）。 TPs B1、C1-C2およびF1はDesulfovibrio spとの半年の孵化の後でさえも変わらなかった。CAの条件の下で86。
Desulfovibrio sp.とクロルデコン変態生成物の運命。86件の口コミ並び順： （ａ）Ｒ ａ条件下でのクロルデコンの形質転換および（ｂ）Ｃ Ａ条件下でのクロルデコンの形質転換。 （Ｃ）Ａ１、（ｄ）Ｆ１、（ｅ）Ｂ１および（ｆ）Ｃ１〜Ｃ２の変換。
ＲＡ条件下で６ヶ月培養した後、クロルデクチオールＦ１を部分的に１ ０−モノヒドロクロルデクチオールＦ２およびＦ３に変換し、Ｆ４（保持時間：１ ７.９分）およびＦ５（保持時間：２ ６.６分）と命名されたＧＣ−ＭＳを用いて検出された他の２つの未知の塩素化種を検出した（図１）。 3d、図。 S12）。 これら二つの化合物のいずれもＬＣ-ＨＲＭＳで検出可能なシグナルを与えなかった。 GC-MS解析により、F4の生の式としてC10Cl6Sh4を提案することができました(図1)。 Ｓ１ ４）、およびＦ５用のＣ１ １Ｃｌ１ ０Ｓｈ４（図１ ４）。 S15）。 クロルデクスルフィドメチルを化学合成し、NMRにより完全に特徴付けた(図1)。 S28–31)。 クロルデクスルフィドメチルおよび生物学的F5のGC保持時間およびGC質量スペクトルの完全な対応（図。 S13）は、その仮定された同一性を確認する。 注目すべきは、F5の構造（図。 3d)はF1のS-メチル化された形態を表す。 F4の正確な性質は明らかに残っています（SI-補足テキストを参照）。 他のすべてのＴｐはＲ ａ条件下では変化しなかった。
要約すると、A1（RA条件下で形成された）はクロルデコンと同じように還元的硫化を受けた。Ｆ１（Ｃ Ａ条件下で生成された）は、ＲＡ条件下で形質転換され得る（図８ ６）。 3).
細菌還元硫化につながるインキュベーション条件の調査
Desulfovibrio spの培養におけるクロルデコンの変換経路に影響を与える物理化学的または生理学的図８ ６を参照して、ＧＣ−ＭＳモニタリング（それぞれ、Ｒ ＡおよびＣ Ａ条件の証拠としてのＢ１およびＦ１存在）を選択した。
二つの硫黄含有無機化合物、還元剤Na2Sと電子受容体Na2So4は、元のMMD液体媒体中に存在していました。 他の還元剤によるNa2Sの置換と密封されたバイアルでの実験の最初のシリーズは、硫化またはしない、すなわちシステインとクエン酸チタン（III）（TiCi）は、クロルデクチオールF1（表1）の同等のレベルにつながった。 ＴＰ Ｂ１の痕跡は、陽性対照であるＮａ２Ｓを含む全ての実験においても観察された（表１）。
実験の第二のセットは、還元剤としてNa2Sと密封されたバイアル中の代替硫黄ベースの電子受容体を使用して設計されました（表2）。 ９ ０％３ ４Ｓ富化無機硫酸塩の使用により、類似の３ ４Ｓ富化レベルを示すクロルデクチオール生成物が得られた（９ ０％３ ４Ｓ−Ｆ１／１ ０％Ｆ１、図１ ０Ａ）。 S16）。 培養ヘッドスペースのＧＣ−ＭＳ分析はまた、Ｈ２ ３ ４ＳおよびＨ３Ｃ３ ４ＳＨの存在を明らかにした（図１ ０Ａ）。 S16)、このようにDesulfovbibrio sp.86は硫酸塩からH2Sを生成した。 これらのガスは、ＭＭＤ培地を用いて、ＣＡ条件下で培養頭隙中に検出されたが、グローブボックス雰囲気に対応するＲＡ条件下で培養頭隙中には存在しなかった（図１）。 S17）。 硫酸の不在はDesulfovibrio spを阻害しなかった。86成長したが、B1の形成をもたらした（表2）5。 亜硫酸塩、重亜硫酸塩またはチオ硫酸塩による硫酸塩の再置換は、すべての場合においてクロルデクチオールF1の形成につながった。
瓶を用いた第三の一連の実験は、培養物と接触する気相の性質の影響を調べた。 グローブボックス内のオープンバイアルを用いたＲ ａ条件とオーブン内の密閉バイアルを用いたＣ ａ条件の間では，いくつかのパラメータ（大気の性質と体積，温度）が異なった。 いくつかのバイアルを含むｊａｒシステムを用いて，Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｓｐによるクロルデコン変態に対する大気再生の効果を選択的に研究した。MMD媒体で86. それぞれの場合において、疎水性多孔質膜を有する開いたバイアルを、最初に選択されたガスでパージされたジャーに入れた。 それらのいくつかは、グローブボックスシステムを模倣するために、数回フラッシュされたが、他のものは閉じたままであった。
瓶1-4には、MMD、chlordecone、Desulfovibrio spで満たされた二つの同一のオープンバイアルが含まれていました。86接種、および一つの負の非生物的コントロール。 その中で、２つのジャーを週に２回フラッシュし、ジャー１を（Ｎ２／Ｈ２（９ ８／２；Ｖ／Ｖ））、ジャー２をＮ２（図１ ４Ａ）で洗浄した。 4a)、一方、jar3および4は、最初にN2および(N2/H2(98/2))でパージされました; Ｖ／Ｖ））をそれぞれ非フラッシュしたままにした（図１ ０Ｂ）。 4b）。
ガス制御実験の概略図。 （a）フラッシュジャー、（b）フラッシュジャー、（c）硫酸フリー Desulfovibrio sp.とフラッシュジャー。86件の口コミ
最後の二つの瓶（瓶5と6）は、MMD、chlordeconeとDesulfovibrio spで満たされた三つの開いたバイアルを含んでいました。86、硫酸塩を含まないプラスワン培養。 これらのジャーは、最初に（Ｎ２／Ｈ２（９ ８／２；Ｖ／Ｖ））で洗い流され、２ヶ月間洗い流されないままにされた（図１ ０Ｂ）。 4c）。
瓶と並行して、硫酸塩を含まないMMDで満たされた二つの密封されたバイアル、chlordeconeおよびDesulfovibrio sp。図８ ６に、瞬間的に合成されたＨ２Ｓでフラッシュした（図８ ６）。 S4）。
30℃で2ヶ月インキュベーションした後、TP B1はフラッシュジャー1および2に入れたバイアルで検出され（表3a）、TP F1はフラッシュジャー3および4に入れたバイアルでのみ検出された（表3b）。 非生物的対照にはＴＰは存在しなかった。 ジャー5と6では、f1は硫酸塩と硫酸フリー Desulfovibrio spの両方に存在していた。86開いた培養物（表3c）。 同様に、Desulfovibrio sp。Ｈ２Ｓでフラッシュされた８ ６硫酸フリー培養物は、有意なレベルのＦ１ＴＰを示したが、陰性対照では形質転換は観察されなかった（表３ｄ）。
追加の化学実験は、クロルデコン変換にH2Sの影響を評価するために行われました。 BおよびC TPsの形成を可能にする古典的な化学議定書は、適用されました（chlordecone、チタニウムのクエン酸塩、ビタミンB12、水）。 N2雰囲気下ではBおよびC TPsが得られたが、H2S雰囲気下ではA1のみが生成された（図。 S18）。
これらの結果は、クロルデクチオールF1の形成には還元雰囲気を有する閉じたインキュベーション系が必要であることを明確に示している。 但しH2Sの存在が要求される一方最初のガスの大気としてH2は必須ではないです。 化学的に、H2Sの存在は開環脱塩素プロセスから防ぎます。
クロルデコン還元硫化の環境関連性
我々は、クロルデコンTPsの様々なレベルが報告されていたマルティニーク島クロルデコン汚染された環境サンプル（八土壌と二層堆積物）の以前のコレクションを再調査した6。 ここで報告された新規硫黄含有TPsの中で、我々は、それぞれ約50μ g/kgおよび20μ g/kgの湿潤堆積物と推定される濃度で、二つの層堆積物サンプル（927および928）にf1のかなりのレベルを発見した（表S1）。 並行して、これらの試料のメタバコーディング分析から発行された細菌集団多様性データ（Fig. 図5に示す。 S5）は、それらの分類学的組成に応じて環境サンプルの階層的なクラスタリングを回復するために処理されました6。 硫酸還元細菌は、以前に報告されたように、他の区画よりも床の堆積物中にはるかに存在していたことが注目された30,31,32。
細菌集団の多様性に応じた環境サンプルの階層的クラスタリングから生成された系統樹（Rパッケージpvclust v.1.3-2、https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btl117から）。 200,000配列は、各環境サンプルのために採取し、正規化しました。 検出された門の割合は、Deltaproteobacteriaクラス、FirmicutesとNitrospirae門から硫酸還元細菌に焦点を当ててここで表されました。 赤では不偏（au）p値、緑ではブートストラップ確率値（bp）を表します。 SRB=硫酸還元細菌。
